GB5009.111-2016食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.111-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定

前

言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T5009.111-2003《谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定》、GB/T23503-2009《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定

免疫親和層析凈化高效液相色譜法》、SN/T1571-2005《進(jìn)出口糧谷中嘔吐毒素檢驗(yàn)方法

液相色譜法》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T5009.111-2003相比，主要變化如下：

——標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定”；

——增加了方法的適用范圍；

——增加了食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇乙酰化衍生物的測定；

——增加了同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；

——增加了固相萃取柱凈化的前處理方式；

——增加了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法；

——增加了商業(yè)化免疫親和柱評(píng)價(jià)技術(shù)參數(shù)要求。

1

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定方法。

第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于谷物及其制品、酒類、醬油、醋、醬及醬制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。

第二法為免疫親和層析凈化高效液相色譜法，適用于谷物及其制品、酒類、醬油、醋、醬及醬制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。

第三法為薄層色譜測定法，第四法為酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。

第一法

同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

2

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇用水和乙腈的混合溶液提取，提取上清液經(jīng)固相萃取柱或免疫親和柱凈化，濃縮、定容和過濾后，超高壓液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

3

試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1

試劑3.1.1

乙腈(CH3CN)：色譜純。3.1.2

甲醇(CH3OH)：色譜純。3.1.3

正己烷(C6H14)。3.1.4

氨水(NH3·H2O)。3.1.5

甲酸(HCOOH)。3.1.6

氮?dú)?N2)：純度≥99.9%。3.2

試劑配制3.2.1

乙腈-水溶液(84+16)：量取160mL水加入到840mL乙腈中，混勻。3.2.2

乙腈飽和的正己烷溶液：量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈，劇烈振搖數(shù)分鐘，靜置分層，棄去下層乙腈層即得。3.2.3

甲醇-水溶液(5+95)：量取5mL甲醇加入到95mL水中，混勻。3.2.40.01%氨水溶液：取100μL氨水加入到1000mL水中，混勻(僅供離子源模式為ESI-時(shí)使用)。3.2.50.1%甲酸溶液：取1mL甲酸加入到1000mL水中，混勻(僅供離子源模式為ESI+時(shí)使用)。3.3

標(biāo)準(zhǔn)品3.3.1

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON，C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.23-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-ADON，C17H22O7，CAS號(hào)：50722-38-8)：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.315-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ADON，C17H22O7，CAS號(hào)：88337-96-6)：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.4

13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液(13C-DON，13C15H20O6)：25μg/mL，純度≥99%。3.3.5

13C17-3-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液(13C-3-ADON，13C17H22O7)：25μg/mL，純度≥99%。3.4

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)：分別稱取DON、3-ADON

和15-ADON1mg(準(zhǔn)確至0.01mg)，分別用乙腈溶解并定容至10mL。將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。3.4.2

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(10μg/mL)：準(zhǔn)確吸取100μg/mLDON、3-ADON

和15-ADON

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0mL于同一10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。3.4.3

混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1μg/mL)：準(zhǔn)確吸取13C15-DON

和13C17-3-ADON

同位素內(nèi)標(biāo)(25μg/mL)各1mL

于同一25mL

容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20

℃下密封保存，有效期半年。3.4.4

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相配制成10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，其中同位素內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4℃保存，有效期7d。

4

儀器和設(shè)備4.1

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源。4.2

電子天平：感量0.01g和0.00001g。4.3

高速粉碎機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。4.4

勻漿機(jī)。4.5

篩網(wǎng)：0.5mm~1mm

孔徑。4.6

超聲波/渦旋振蕩器或搖床。4.7

氮吹儀。4.8

高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。4.9

移液器：量程10μL~100μL和100μL~1000μL。4.10

固相萃取裝置。4.11

通用型固相萃取柱：兼具親水基團(tuán)(吡咯烷酮基團(tuán))和疏水基團(tuán)(二乙烯基苯)吸附劑填料的固相萃取小柱，200mg，6mL，或相當(dāng)者。4.12

DONs專用型固相凈化柱，或相當(dāng)者。4.13

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率驗(yàn)證方法參見A.2)。4.14

水相微孔濾膜：0.22μm。

5

分析步驟5.1

試樣制備5.1.1

谷物及其制品：取至少1kg樣品，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過篩，使其粒徑小于0.5mm~1mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。5.1.2

酒類：取散裝酒至少1L，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品至少取3個(gè)包裝(同一批次或號(hào))，將所有液體試樣在一個(gè)容器中用均質(zhì)機(jī)混勻后，縮分至100g(mL)儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。含二氧化碳的酒類樣品使用前應(yīng)先置于4℃冰箱冷藏30min，過濾或超聲脫氣后方可使用。5.1.3

醬油、醋、醬及醬制品：取至少1L樣品，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品至少取3個(gè)包裝(同一批次或號(hào))，將所有液體樣品在一個(gè)容器中用勻漿機(jī)混勻后，縮分至100g(mL)儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。5.2

試樣提取5.2.1

谷物及其制品：稱取2g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入400μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液A

于干凈的容器中備用。5.2.2

酒類：稱取5g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入200μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min，用乙腈定容至10mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液B于干凈的容器中備用。5.2.3

醬油、醋、醬及醬制品：稱取2g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入400μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液C于干凈的容器中備用。5.3

試樣凈化

注：下述試樣的凈化方法，可根據(jù)實(shí)際情況，選擇其中一種方法即可。5.3.1

通用型固相萃取柱凈化

取5mL上清液A

或上清液B或上清液C置于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混合2min，5000r/min離心2min，棄去正己烷層后，于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈桑尤?mL水充分溶解殘?jiān)齼艋?/p>

將固相萃取柱連接到固相萃取裝置，先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。將4mL上述水復(fù)溶液上柱，控制流速為每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后徹（che）底抽干。用4mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后在40℃~50℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?.0mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻10s，用0.22μm

微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。5.3.2DONs專用型固相凈化柱凈化

取8mL上清液A

或上清液B或上清液C至DONs專用型固相凈化柱的玻璃管內(nèi)，將凈化柱的填料管插入玻璃管中并緩慢推動(dòng)填料管至凈化液析出，移取5mL凈化液于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?.0mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻10s，用0.22μm

微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。5.3.3

免疫親和柱凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。

準(zhǔn)確移取5mL上清液A

或上清液B或上清液C，于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈桑尤?mL水充分溶解殘?jiān)庖哂H和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5mLPBS緩沖鹽溶液和5mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1滴~2滴，直至空氣進(jìn)入親和注中，棄去全部流出液，抽干小柱。

準(zhǔn)確加入2mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑尤?.0mL初始流動(dòng)相，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm

濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

注：使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照說明書要求進(jìn)行操作。5.4

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參考條件(可根據(jù)實(shí)際情況參考其中一種方法即可)5.4.1

離子源模式：ESI+液相色譜-質(zhì)譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長100mm，柱內(nèi)徑2.1mm；填料粒徑1.7μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：A

相：0.1%甲酸溶液；B相：0.1%甲酸-乙腈；c)

梯度洗脫：2%B(0min~0.8min)，24%B(3.0min~4.0min)，100%B(6.0min~6.9min)，2%B(6.9min~7.0min)；d)

流速：0.35mL/min；e)

柱溫：40℃；f)

進(jìn)樣體積：10μL；g)

毛細(xì)管電壓：3.5kV；錐孔電壓：30V；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：900L/h；h)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物質(zhì)譜條件參考表1。5.4.2

離子源模式：ESI-液相色譜-質(zhì)譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長100mm，柱內(nèi)徑2.1mm；填料粒徑1.7μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：A

相：0.01%氨水溶液；B相：乙腈；c)

梯度洗脫：2%B(0min~0.8min)，24%B(3.0min~4.0min)，100%B(6.0min~6.9min)，2%B(6.9min~7.0min)；d)

流速：0.35mL/min；e)

柱溫：40℃；f)

進(jìn)樣體積：10μL；g)

毛細(xì)管電壓：2.5kV；錐孔電壓：45V；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：900L/h；h)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物質(zhì)譜條件參考表2。

各化合物的離子掃描圖、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子通道圖參見圖B.1~圖B.8。5.5

定性測定

試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。

每種化合物的質(zhì)譜定性離子應(yīng)出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。5.6

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在5.4液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低到高濃度進(jìn)樣檢測，以DON、3-ADON和15-ADON

色譜峰與各對應(yīng)內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。5.7

試樣溶液的測定

取5.2、5.3處理得到的待測溶液進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測液中目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按6計(jì)算樣品中待測物的含量。試液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少取樣量后重新測定。5.8

空白試驗(yàn)

除不加試樣外，按5.3和5.4的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

6

分析結(jié)果的表述

試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

的含量按式(1)計(jì)算：式中：X

——試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

的含量，單位為微克每千克(μg/kg)；ρ

——試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V1

——試樣提取液體積，單位為毫升(mL)；V3

——試樣最終定容體積，單位為毫升(mL)；1000——換算系數(shù)；V2

——用于凈化的分取體積，單位為毫升(mL)；m

——試樣的稱樣量，單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的23%。

8

其他

當(dāng)稱取谷物及其制品、酒類、醬油、醋、醬及醬制品試樣2g時(shí)，方法中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出限為10μg/kg，定量限為20μg/kg。

當(dāng)稱取酒類試樣5g時(shí)，方法中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg。

第二法

免疫親和層析凈化高效液相色譜法

9

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇用水提取，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜-紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。

10

試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。10.1

試劑10.1.1

甲醇(CH3OH)：色譜純。10.1.2

乙腈(CH3CN)：色譜純。10.1.3

聚乙二醇[相對分子質(zhì)量為8000，HO(CH2CH2O)nH]。10.1.4

氯化鈉(NaCl)。10.1.5

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。10.1.6

磷酸二氫鉀(KH2PO4)。10.1.7

氯（lv）化鉀(KCl)。10.1.8

鹽酸(HCl)。10.2

試劑配制10.2.1

磷酸鹽緩沖溶液(以下簡稱PBS)：稱取8.00g氯化鈉、1.20g磷酸氫二鈉、0.20g磷酸二氫鉀、0.20g氯（lv）化鉀，用900mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH

至7.0，用水定容至1000mL。10.2.2

甲醇-水溶液(20+80)：量取200mL甲醇加入到800mL水中，混勻。10.2.3

乙腈-水溶液(10+90)：量取100mL乙腈加入到900mL水中，混勻。10.3

標(biāo)準(zhǔn)品

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。10.4

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制10.4.1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)：稱取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇1mg(準(zhǔn)確至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至10mL。將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。10.4.2

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取適量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用初始流動(dòng)相稀釋，配制成100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4℃保存，有效期7d。

11

儀器和設(shè)備11.1

高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。11.2

電子天平：感量0.01g和0.00001g。11.3

高速粉碎機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。11.4

篩網(wǎng)：1mm~2mm

孔徑。11.5

超聲波/渦旋振蕩器或搖床。11.6

氮吹儀。11.7

高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。11.8

移液器：量程10μL~100μL和100μL~1000μL。11.9

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率驗(yàn)證方法參見A.2)。

注：對于不同批次的親和柱在使用前需質(zhì)量驗(yàn)證。11.10

玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。11.11

水相微孔濾膜：0.45μm。11.12

聚丙烯刻度離心管：具塞，50mL。11.13

玻璃注射器：10mL。11.14

空氣壓力泵。

12

分析步驟

使用不同廠商的免疫親和柱，在試樣上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照說明書要求進(jìn)行操作。12.1

試樣制備

同5.1。12.2

試樣提取12.2.1

谷物及其制品：稱取25g(準(zhǔn)確到0.1g)磨碎的試樣于100mL具塞三角瓶中加入5g聚乙二醇，加水100mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。以玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清(或6000r/min下離心10min)，收集濾液A

于干凈的容器中。10000r/min離心5min。12.2.2

酒類：取酒樣20g(準(zhǔn)確到0.1g)，加入1g聚乙二醇，用水定容至25.0mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清(或6000r/min

下離心10min)，收集濾液B于干凈的容器中。12.2.3

醬油、醋、醬及醬制品：稱取樣品25g(準(zhǔn)確到0.1g)，加入5g聚乙二醇，用水定容至100mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。以玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清(或6000r/min下離心10min)，收集濾液C于干凈的容器中。12.3

凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中，準(zhǔn)確移取上述濾液A

或?yàn)V液B或?yàn)V液C2.0mL，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5mLPBS緩沖鹽溶液和5mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1滴~2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。12.4

洗脫

準(zhǔn)確加入2mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑尤?.0mL初始流動(dòng)相，渦旋30s溶解殘留物，0.45μm

濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。12.5

液相色譜參考條件

液相色譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長150mm，柱內(nèi)徑4.6mm；填料粒徑5μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：甲醇+水(20+80)；c)

流速；0.8mL/min；d)

柱溫：35℃；e)

進(jìn)樣量：50μL；f)

檢測波長：218nm。12.6

定量測定12.6.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值縱坐標(biāo)，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。12.6.2

試樣溶液的測定

試樣液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少稱樣量，重新按12.2、12.3和12.4進(jìn)行處理后再進(jìn)樣分析。12.7

空白試驗(yàn)

除不稱取試樣外，按12.2、12.3和12.4做空白試驗(yàn)。確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

13

分析結(jié)果的表述試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量按式(2)計(jì)算：式中：X

——試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，單位為微克每千克(μg/kg)；ρ1

——試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升(ng/mL)；ρ0

——空白試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升(ng/mL)；V

——樣品洗脫液的最終定容體積，單位毫升(mL)；f

——樣液稀釋因子；1000

——換算系數(shù)；m

——試樣的稱樣量，單位克(g)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

14

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的23%。

15

其他

當(dāng)稱取谷物及其制品、醬油、醋、醬及醬制品試樣25g

時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出限為100μg/kg，定量限為200μg/kg；當(dāng)稱取酒類試樣20g時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出限為50μg/kg，定量限為100μg/kg。

第三法

薄層色譜測定法

16

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅膠G

薄層展開后，加熱薄層展開后，加熱薄層板。由于在制備薄層板時(shí)加入了三氯化鋁，使脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在365nm

紫外光燈下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。

17

試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純。17.1

試劑17.1.1

三氯（lv）甲烷(CHCl3)。17.1.2

無水乙醇(CH3CH2OH)。17.1.3

甲醇(CH3OH)。17.1.4

石油醚(CnH2n+2)。17.1.5

乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)。17.1.6

乙腈(CH3CN)。17.1.7

丙酮(CH3COCH3)。17.1.8

異丙醇(CH3CH2OHCH3)。17.1.9

乙（yi）醚(CH3CH2OCH2CH3)。17.1.10

氯化鋁(AlCl3·6H2O)：化學(xué)純。17.1.11

中性氧化鋁：經(jīng)300℃活化4h，置干燥器中備用。17.1.12

活性炭：20g活性炭，用3mol/L鹽酸溶液浸泡過夜，抽濾后，用熱蒸餾水洗至無氯離子，在120℃烘干備用。17.1.13

硅膠G：薄層層析用。17.2

標(biāo)準(zhǔn)品

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%。17.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(25μg/mL)：稱取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇5.0mg(準(zhǔn)確到0.1mg)，加乙酸乙酯-甲醇(19+1)溶解，轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，并定容至10mL。吸取此溶液0.5mL，用乙酸乙酯-甲醇(19+1)稀釋至10mL。

18

儀器和設(shè)備18.1

小型粉碎機(jī)。18.2

電動(dòng)振蕩器。18.3

玻璃蒸發(fā)皿：75mL。18.4

層析柱：內(nèi)徑2cm，長10cm，不具活塞。18.5

具塞濃縮瓶：10mL，底部具0.2mL刻度尾管。18.6

玻璃板：5cm×20cm。18.7

薄層涂布器：0.3mm。18.8

展開槽：內(nèi)長26cm，寬6cm，高4cm。18.9

紫外光燈：365nm。18.10

微量注射器：10μL，50μL。18.11

平底管：50mL。18.12

雙波長薄層掃描儀：帶數(shù)據(jù)處理機(jī)。

19

分析步驟19.1

試樣提取

稱取20g粉碎試樣置于200mL具塞錐瓶中，加8mL和100mL三氯（lv）甲烷-無水乙醇(8+2)，密塞。在瓶塞上涂層水，蓋嚴(yán)防漏，振蕩1h，通過折疊快速定性濾紙過濾，取25mL濾液于75mL玻璃蒸發(fā)皿中，置90℃水浴上通風(fēng)揮干。19.2

凈化19.2.1

液-液分配

谷物：用50mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中的殘?jiān)慈?00mL分液漏斗中，再用20mL(玉米試樣用30mL)甲醇-水(4+1)分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中。

谷物制品(蛋糕、餅干、面包等)：用100mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中的殘?jiān)慈?50mL分液漏斗中，再用30mL甲醇-水(4+1)分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中。振蕩分液漏斗1.5min，靜置約15min使分層后，將下層甲醇-水提取液過柱凈化，不要將兩相交界處的白色絮狀物放入柱內(nèi)。19.2.2

柱凈化

小麥及其制品：在層析柱下端與小管連結(jié)處塞約0.1g脫脂棉，盡量塞緊，先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加0.4g活性炭，敲緊。將層析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽濾瓶上，抽濾瓶中放一平底管接受過柱液，將抽濾瓶接上水泵或真空泵，稍稍開啟泵，使活性炭壓緊，將分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加入柱內(nèi)，控制流速為每15秒18滴~20滴(3mL/min)，甲醇-水提取液過柱快完畢時(shí)，加入10mL

甲醇-水(4+1)淋洗柱，抽濾，直至柱內(nèi)不再有液體流出。過柱速度控制在2mL/min~3mL/min，速度太快凈化效果不好，太慢耗時(shí)太長。

玉米：同，只是將活性炭的用量改為0.3g。19.3

制備薄層層析用樣液

將過柱后的洗脫液倒入75mL玻璃蒸發(fā)皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗滌平底管。將蒸發(fā)皿置沸水浴上濃縮至干：

a)

小麥：趁熱加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，在水浴鍋上輕輕地反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿數(shù)次，使充分沸騰將殘?jiān)械腄ON

溶出，并將乙酸乙酯揮發(fā)至干，再加入3mL乙酸乙酯同樣處理一次，將溶劑揮干，最后加3mL乙酸乙酯，加熱至沸，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，再用3份1.5mL乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中。

b)

小麥制品和玉米：趁熱加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，在水浴鍋上輕輕地反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿數(shù)次，使充分沸騰，將殘?jiān)蠨ON

溶出，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中。加約0.5mL甲醇-丙酮(1+2)于蒸發(fā)皿中，用玻璃攪動(dòng)溶解殘?jiān)瑢⒄舭l(fā)皿置水浴鍋上揮干溶劑后，加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿，使充分沸騰，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入同一濃縮瓶中，再用0.5mL甲醇-丙酮(1+2)和3mL乙酸乙酯同樣處理一次，乙酸乙酯提取液并入濃縮瓶中。

將濃縮瓶置約95℃水浴鍋上，用蒸汽加熱吹氮?dú)鉂饪s至干，放冷至室溫后加入0.2mL三氯（lv）甲烷-乙腈(4+1)溶解殘?jiān)糇鞅訉游鲇谩?9.4

測定19.4.1

薄層板的制備：4g硅膠G加約9mL15%氯化鋁(AlCl3·6H2O)水溶液，研磨約2min至呈黏稠狀，鋪成5cm×20cm

的薄層板三塊，置室溫干燥后，于105℃活化1h，貯干燥器中備用。19.4.2

點(diǎn)樣：在每塊薄層板上距下端2.5cm

的基線上點(diǎn)樣。

第一塊板：對每一個(gè)試樣先點(diǎn)第一塊薄層板，在距板左邊緣1.8cm

處點(diǎn)25μL試樣液，在距板上端1.5cm

處的橫線上并與基線試樣點(diǎn)相對應(yīng)的位置上點(diǎn)2μLDON

標(biāo)準(zhǔn)液(50ng)。

第二塊板：在第一塊板上未顯熒光的試樣則需在第二塊薄層板上距左邊緣0.8cm~1cm

處滴加樣液點(diǎn)(根據(jù)情況估計(jì)滴加量，或稀釋后定量)，在距板左邊緣2cm

處和在距右邊緣1.2cm

處分別滴加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，DON

的量可為50ng、75ng、100ng。再在距板上端1.5cm

處的橫線上點(diǎn)三個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(各50ng)，使之與基線上的三個(gè)點(diǎn)相對應(yīng)。19.4.3

展開：

橫展劑：乙（yi）醚、乙（yi）醚-丙酮(95+5)或無水乙（yi）醚。任選其中一種，使試樣DON

點(diǎn)偏離原點(diǎn)0.7cm~1cm，剛好與雜質(zhì)熒光分開。

縱展劑：三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)；

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。

橫展：在展開槽內(nèi)倒入10mL橫展劑。將點(diǎn)好樣的薄層板靠樣液點(diǎn)的長邊斜浸入溶劑，展至板端1min~2min，取出通風(fēng)揮干3min。對小麥制品還須再用10mL石油醚(30℃~60℃)橫展一次，展至板端過1min，取出通風(fēng)揮干5min。

縱展：在展開槽內(nèi)倒入10mL縱展劑。將橫展揮干后的薄層板置展開槽內(nèi)縱展15cm，取出通風(fēng)揮干10min，由于DON

與雜質(zhì)分離的效果受空氣濕度影響較大，當(dāng)板面分離效果不太好時(shí)即第一塊薄層板的試樣點(diǎn)附近有雜質(zhì)熒光干擾時(shí)，可按極性大小依次換用以下幾種展開方式：a)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)。b)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)并在展開槽蓋內(nèi)面貼上水飽和的濾紙。c)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。d)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)并在展開槽內(nèi)面貼上水飽和的濾紙。改換縱展方式，展開第二塊薄層板。如展開槽內(nèi)極性太大，會(huì)使DON

點(diǎn)變偏。19.4.4

顯熒光：先觀察未加熱的薄層板可見到顯藍(lán)紫熒光的干擾點(diǎn)，這時(shí)DON

不顯熒光，加熱薄層板后，雜質(zhì)點(diǎn)仍顯熒光，它在DON

熒光點(diǎn)附近，但不干擾DON。然后將此薄層板置130

℃烘箱中加熱7min~10min，取出放在冷的表面上1min~5min后于365nm

紫外光燈下觀察。19.4.5

觀察與評(píng)定：薄層板經(jīng)橫展后，板上樣液點(diǎn)的DON

點(diǎn)移動(dòng)0.7cm~1.0cm，正是根據(jù)這一點(diǎn)在縱展后使樣品DON

點(diǎn)擺脫了雜質(zhì)熒光的干擾。薄層板上端未經(jīng)縱展的三個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)可分別作為縱展后樣品DON

點(diǎn)和兩個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的橫向定位點(diǎn)。樣品DON

點(diǎn)又可與縱展后的DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較Rf值而定性。這樣從橫向和縱向兩個(gè)方面確定樣品DON

的位置，達(dá)到定性的目的。在第一塊薄層板上如樣品DON

點(diǎn)上有很淺的斜的熒光通過，這是過柱時(shí)沒有掌握好速度，凈化不夠，也可能是空氣濕度的變化，影響分離效果，但兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DON

點(diǎn)的位置上均無雜質(zhì)熒光干擾。如在第一塊薄層板上樣液未顯熒光點(diǎn)，而在第二塊薄層板上樣液25μL加標(biāo)準(zhǔn)25ng所顯熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)25ng相等，則樣品中DON

含量為陰性或?yàn)?0μg/kg以下。陽性樣品概略定量時(shí)，雖然薄層板上三個(gè)D（lv）ON

點(diǎn)在橫展中都稍有移動(dòng)，但對各點(diǎn)熒光強(qiáng)度無影響，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)均可用于和樣品DON點(diǎn)比較熒光強(qiáng)度。19.4.6

薄層光密度計(jì)測定：激發(fā)光波長340nm、發(fā)射光波長400nm。在薄層板上標(biāo)準(zhǔn)DON

熒光點(diǎn)至少在100ng、200ng、400ng時(shí)，測得的響應(yīng)與DON

的量才呈線性關(guān)系。對DON

含量在300μg/kg以上的樣品才用光密度計(jì)測定。當(dāng)DON

含量在300μg/kg時(shí)，點(diǎn)樣液20μL

使測得的DON

的量落在100ng~200ng之間。用薄層掃描儀測定時(shí)，每塊薄層板上滴加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DON

點(diǎn)，DON

的量為100ng、200ng或200ng、400ng。在激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長400nm

條件下進(jìn)行測定，以測得的峰面積值為縱坐標(biāo)，DON

量為橫坐標(biāo)