GB5009.111-2016食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.111-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定

前

言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T5009.111-2003《谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定》、GB/T23503-2009《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定

免疫親和層析凈化高效液相色譜法》、SN/T1571-2005《進(jìn)出口糧谷中嘔吐毒素檢驗(yàn)方法

液相色譜法》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T5009.111-2003相比，主要變化如下：

——標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定”；

——增加了方法的適用范圍；

——增加了食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇乙酰化衍生物的測(cè)定；

——增加了同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；

——增加了固相萃取柱凈化的前處理方式；

——增加了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法；

——增加了商業(yè)化免疫親和柱評(píng)價(jià)技術(shù)參數(shù)要求。

1

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定方法。

第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于谷物及其制品、酒類(lèi)、醬油、醋、醬及醬制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定。

第二法為免疫親和層析凈化高效液相色譜法，適用于谷物及其制品、酒類(lèi)、醬油、醋、醬及醬制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定。

第三法為薄層色譜測(cè)定法，第四法為酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定。

第一法

同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

2

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇用水和乙腈的混合溶液提取，提取上清液經(jīng)固相萃取柱或免疫親和柱凈化，濃縮、定容和過(guò)濾后，超高壓液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

3

試劑和材料

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1

試劑3.1.1

乙腈(CH3CN)：色譜純。3.1.2

甲醇(CH3OH)：色譜純。3.1.3

正己烷(C6H14)。3.1.4

氨水(NH3·H2O)。3.1.5

甲酸(HCOOH)。3.1.6

氮?dú)?N2)：純度≥99.9%。3.2

試劑配制3.2.1

乙腈-水溶液(84+16)：量取160mL水加入到840mL乙腈中，混勻。3.2.2

乙腈飽和的正己烷溶液：量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈，劇烈振搖數(shù)分鐘，靜置分層，棄去下層乙腈層即得。3.2.3

甲醇-水溶液(5+95)：量取5mL甲醇加入到95mL水中，混勻。3.2.40.01%氨水溶液：取100μL氨水加入到1000mL水中，混勻(僅供離子源模式為ESI-時(shí)使用)。3.2.50.1%甲酸溶液：取1mL甲酸加入到1000mL水中，混勻(僅供離子源模式為ESI+時(shí)使用)。3.3

標(biāo)準(zhǔn)品3.3.1

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON，C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.23-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-ADON，C17H22O7，CAS號(hào)：50722-38-8)：純度≥99%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.315-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ADON，C17H22O7，CAS號(hào)：88337-96-6)：純度≥99%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.4

13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液(13C-DON，13C15H20O6)：25μg/mL，純度≥99%。3.3.5

13C17-3-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液(13C-3-ADON，13C17H22O7)：25μg/mL，純度≥99%。3.4

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)：分別稱(chēng)取DON、3-ADON

和15-ADON1mg(準(zhǔn)確至0.01mg)，分別用乙腈溶解并定容至10mL。將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。3.4.2

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(10μg/mL)：準(zhǔn)確吸取100μg/mLDON、3-ADON

和15-ADON

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0mL于同一10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。3.4.3

混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1μg/mL)：準(zhǔn)確吸取13C15-DON

和13C17-3-ADON

同位素內(nèi)標(biāo)(25μg/mL)各1mL

于同一25mL

容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20

℃下密封保存，有效期半年。3.4.4

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相配制成10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，其中同位素內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4℃保存，有效期7d。

4

儀器和設(shè)備4.1

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源。4.2

電子天平：感量0.01g和0.00001g。4.3

高速粉碎機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。4.4

勻漿機(jī)。4.5

篩網(wǎng)：0.5mm~1mm

孔徑。4.6

超聲波/渦旋振蕩器或搖床。4.7

氮吹儀。4.8

高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。4.9

移液器：量程10μL~100μL和100μL~1000μL。4.10

固相萃取裝置。4.11

通用型固相萃取柱：兼具親水基團(tuán)(吡咯烷酮基團(tuán))和疏水基團(tuán)(二乙烯基苯)吸附劑填料的固相萃取小柱，200mg，6mL，或相當(dāng)者。4.12

DONs專(zhuān)用型固相凈化柱，或相當(dāng)者。4.13

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率驗(yàn)證方法參見(jiàn)A.2)。4.14

水相微孔濾膜：0.22μm。

5

分析步驟5.1

試樣制備5.1.1

谷物及其制品：取至少1kg樣品，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)篩，使其粒徑小于0.5mm~1mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。5.1.2

酒類(lèi)：取散裝酒至少1L，對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品至少取3個(gè)包裝(同一批次或號(hào))，將所有液體試樣在一個(gè)容器中用均質(zhì)機(jī)混勻后，縮分至100g(mL)儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。含二氧化碳的酒類(lèi)樣品使用前應(yīng)先置于4℃冰箱冷藏30min，過(guò)濾或超聲脫氣后方可使用。5.1.3

醬油、醋、醬及醬制品：取至少1L樣品，對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品至少取3個(gè)包裝(同一批次或號(hào))，將所有液體樣品在一個(gè)容器中用勻漿機(jī)混勻后，縮分至100g(mL)儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。5.2

試樣提取5.2.1

谷物及其制品：稱(chēng)取2g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入400μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液A

于干凈的容器中備用。5.2.2

酒類(lèi)：稱(chēng)取5g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入200μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min，用乙腈定容至10mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液B于干凈的容器中備用。5.2.3

醬油、醋、醬及醬制品：稱(chēng)取2g(準(zhǔn)確至0.01g)試樣于50mL離心管中，加入400μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。10000r/min離心5min，收集上清液C于干凈的容器中備用。5.3

試樣凈化

注：下述試樣的凈化方法，可根據(jù)實(shí)際情況，選擇其中一種方法即可。5.3.1

通用型固相萃取柱凈化

取5mL上清液A

或上清液B或上清液C置于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混合2min，5000r/min離心2min，棄去正己烷層后，于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈桑尤?mL水充分溶解殘?jiān)齼艋?/p>

將固相萃取柱連接到固相萃取裝置，先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。將4mL上述水復(fù)溶液上柱，控制流速為每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后徹（che）底抽干。用4mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后在40℃~50℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?.0mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻10s，用0.22μm

微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。5.3.2DONs專(zhuān)用型固相凈化柱凈化

取8mL上清液A

或上清液B或上清液C至DONs專(zhuān)用型固相凈化柱的玻璃管內(nèi)，將凈化柱的填料管插入玻璃管中并緩慢推動(dòng)填料管至凈化液析出，移取5mL凈化液于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?.0mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻10s，用0.22μm

微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。5.3.3

免疫親和柱凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。

準(zhǔn)確移取5mL上清液A

或上清液B或上清液C，于40℃~50℃下氮?dú)獯蹈桑尤?mL水充分溶解殘?jiān)庖哂H和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5mLPBS緩沖鹽溶液和5mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1滴~2滴，直至空氣進(jìn)入親和注中，棄去全部流出液，抽干小柱。

準(zhǔn)確加入2mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑尤?.0mL初始流動(dòng)相，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm

濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

注：使用不同廠(chǎng)商的免疫親和柱，在樣品上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。5.4

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參考條件(可根據(jù)實(shí)際情況參考其中一種方法即可)5.4.1

離子源模式：ESI+液相色譜-質(zhì)譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長(zhǎng)100mm，柱內(nèi)徑2.1mm；填料粒徑1.7μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：A

相：0.1%甲酸溶液；B相：0.1%甲酸-乙腈；c)

梯度洗脫：2%B(0min~0.8min)，24%B(3.0min~4.0min)，100%B(6.0min~6.9min)，2%B(6.9min~7.0min)；d)

流速：0.35mL/min；e)

柱溫：40℃；f)

進(jìn)樣體積：10μL；g)

毛細(xì)管電壓：3.5kV；錐孔電壓：30V；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：900L/h；h)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物質(zhì)譜條件參考表1。5.4.2

離子源模式：ESI-液相色譜-質(zhì)譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長(zhǎng)100mm，柱內(nèi)徑2.1mm；填料粒徑1.7μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：A

相：0.01%氨水溶液；B相：乙腈；c)

梯度洗脫：2%B(0min~0.8min)，24%B(3.0min~4.0min)，100%B(6.0min~6.9min)，2%B(6.9min~7.0min)；d)

流速：0.35mL/min；e)

柱溫：40℃；f)

進(jìn)樣體積：10μL；g)

毛細(xì)管電壓：2.5kV；錐孔電壓：45V；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：900L/h；h)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物質(zhì)譜條件參考表2。

各化合物的離子掃描圖、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子通道圖參見(jiàn)圖B.1~圖B.8。5.5

定性測(cè)定

試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。

每種化合物的質(zhì)譜定性離子應(yīng)出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，而且同一檢測(cè)批次，對(duì)同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍。5.6

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

在5.4液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低到高濃度進(jìn)樣檢測(cè)，以DON、3-ADON和15-ADON

色譜峰與各對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。5.7

試樣溶液的測(cè)定

取5.2、5.3處理得到的待測(cè)溶液進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測(cè)液中目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按6計(jì)算樣品中待測(cè)物的含量。試液中待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍內(nèi)，超過(guò)線(xiàn)性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少取樣量后重新測(cè)定。5.8

空白試驗(yàn)

除不加試樣外，按5.3和5.4的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。

6

分析結(jié)果的表述

試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

的含量按式(1)計(jì)算：式中：X

——試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

的含量，單位為微克每千克(μg/kg)；ρ

——試樣中DON、3-ADON

或15-ADON

按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V1

——試樣提取液體積，單位為毫升(mL)；V3

——試樣最終定容體積，單位為毫升(mL)；1000——換算系數(shù)；V2

——用于凈化的分取體積，單位為毫升(mL)；m

——試樣的稱(chēng)樣量，單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的23%。

8

其他

當(dāng)稱(chēng)取谷物及其制品、酒類(lèi)、醬油、醋、醬及醬制品試樣2g時(shí)，方法中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出限為10μg/kg，定量限為20μg/kg。

當(dāng)稱(chēng)取酒類(lèi)試樣5g時(shí)，方法中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg。

第二法

免疫親和層析凈化高效液相色譜法

9

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇用水提取，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。

10

試劑和材料

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。10.1

試劑10.1.1

甲醇(CH3OH)：色譜純。10.1.2

乙腈(CH3CN)：色譜純。10.1.3

聚乙二醇[相對(duì)分子質(zhì)量為8000，HO(CH2CH2O)nH]。10.1.4

氯化鈉(NaCl)。10.1.5

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。10.1.6

磷酸二氫鉀(KH2PO4)。10.1.7

氯（lv）化鉀(KCl)。10.1.8

鹽酸(HCl)。10.2

試劑配制10.2.1

磷酸鹽緩沖溶液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PBS)：稱(chēng)取8.00g氯化鈉、1.20g磷酸氫二鈉、0.20g磷酸二氫鉀、0.20g氯（lv）化鉀，用900mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH

至7.0，用水定容至1000mL。10.2.2

甲醇-水溶液(20+80)：量取200mL甲醇加入到800mL水中，混勻。10.2.3

乙腈-水溶液(10+90)：量取100mL乙腈加入到900mL水中，混勻。10.3

標(biāo)準(zhǔn)品

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。10.4

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制10.4.1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)：稱(chēng)取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇1mg(準(zhǔn)確至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至10mL。將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。10.4.2

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取適量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥?00ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4℃保存，有效期7d。

11

儀器和設(shè)備11.1

高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。11.2

電子天平：感量0.01g和0.00001g。11.3

高速粉碎機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。11.4

篩網(wǎng)：1mm~2mm

孔徑。11.5

超聲波/渦旋振蕩器或搖床。11.6

氮吹儀。11.7

高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。11.8

移液器：量程10μL~100μL和100μL~1000μL。11.9

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率驗(yàn)證方法參見(jiàn)A.2)。

注：對(duì)于不同批次的親和柱在使用前需質(zhì)量驗(yàn)證。11.10

玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。11.11

水相微孔濾膜：0.45μm。11.12

聚丙烯刻度離心管：具塞，50mL。11.13

玻璃注射器：10mL。11.14

空氣壓力泵。

12

分析步驟

使用不同廠(chǎng)商的免疫親和柱，在試樣上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。12.1

試樣制備

同5.1。12.2

試樣提取12.2.1

谷物及其制品：稱(chēng)取25g(準(zhǔn)確到0.1g)磨碎的試樣于100mL具塞三角瓶中加入5g聚乙二醇，加水100mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清(或6000r/min下離心10min)，收集濾液A

于干凈的容器中。10000r/min離心5min。12.2.2

酒類(lèi)：取酒樣20g(準(zhǔn)確到0.1g)，加入1g聚乙二醇，用水定容至25.0mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。用玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清(或6000r/min

下離心10min)，收集濾液B于干凈的容器中。12.2.3

醬油、醋、醬及醬制品：稱(chēng)取樣品25g(準(zhǔn)確到0.1g)，加入5g聚乙二醇，用水定容至100mL，混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20min。以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清(或6000r/min下離心10min)，收集濾液C于干凈的容器中。12.3

凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中，準(zhǔn)確移取上述濾液A

或?yàn)V液B或?yàn)V液C2.0mL，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5mLPBS緩沖鹽溶液和5mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1滴~2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。12.4

洗脫

準(zhǔn)確加入2mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑尤?.0mL初始流動(dòng)相，渦旋30s溶解殘留物，0.45μm

濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。12.5

液相色譜參考條件

液相色譜參考條件列出如下：a)

液相色譜柱：C18柱(柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm；填料粒徑5μm)，或相當(dāng)者；b)

流動(dòng)相：甲醇+水(20+80)；c)

流速；0.8mL/min；d)

柱溫：35℃；e)

進(jìn)樣量：50μL；f)

檢測(cè)波長(zhǎng)：218nm。12.6

定量測(cè)定12.6.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值縱坐標(biāo)，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程。12.6.2

試樣溶液的測(cè)定

試樣液中待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍內(nèi)，超過(guò)線(xiàn)性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少稱(chēng)樣量，重新按12.2、12.3和12.4進(jìn)行處理后再進(jìn)樣分析。12.7

空白試驗(yàn)

除不稱(chēng)取試樣外，按12.2、12.3和12.4做空白試驗(yàn)。確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。

13

分析結(jié)果的表述試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量按式(2)計(jì)算：式中：X

——試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，單位為微克每千克(μg/kg)；ρ1

——試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升(ng/mL)；ρ0

——空白試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的質(zhì)量濃度，單位納克每毫升(ng/mL)；V

——樣品洗脫液的最終定容體積，單位毫升(mL)；f

——樣液稀釋因子；1000

——換算系數(shù)；m

——試樣的稱(chēng)樣量，單位克(g)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

14

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的23%。

15

其他

當(dāng)稱(chēng)取谷物及其制品、醬油、醋、醬及醬制品試樣25g

時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出限為100μg/kg，定量限為200μg/kg；當(dāng)稱(chēng)取酒類(lèi)試樣20g時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出限為50μg/kg，定量限為100μg/kg。

第三法

薄層色譜測(cè)定法

16

原理

試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅膠G

薄層展開(kāi)后，加熱薄層展開(kāi)后，加熱薄層板。由于在制備薄層板時(shí)加入了三氯化鋁，使脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在365nm

紫外光燈下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。

17

試劑和材料

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純。17.1

試劑17.1.1

三氯（lv）甲烷(CHCl3)。17.1.2

無(wú)水乙醇(CH3CH2OH)。17.1.3

甲醇(CH3OH)。17.1.4

石油醚(CnH2n+2)。17.1.5

乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)。17.1.6

乙腈(CH3CN)。17.1.7

丙酮(CH3COCH3)。17.1.8

異丙醇(CH3CH2OHCH3)。17.1.9

乙（yi）醚(CH3CH2OCH2CH3)。17.1.10

氯化鋁(AlCl3·6H2O)：化學(xué)純。17.1.11

中性氧化鋁：經(jīng)300℃活化4h，置干燥器中備用。17.1.12

活性炭：20g活性炭，用3mol/L鹽酸溶液浸泡過(guò)夜，抽濾后，用熱蒸餾水洗至無(wú)氯離子，在120℃烘干備用。17.1.13

硅膠G：薄層層析用。17.2

標(biāo)準(zhǔn)品

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)：純度≥99%。17.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(25μg/mL)：稱(chēng)取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇5.0mg(準(zhǔn)確到0.1mg)，加乙酸乙酯-甲醇(19+1)溶解，轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，并定容至10mL。吸取此溶液0.5mL，用乙酸乙酯-甲醇(19+1)稀釋至10mL。

18

儀器和設(shè)備18.1

小型粉碎機(jī)。18.2

電動(dòng)振蕩器。18.3

玻璃蒸發(fā)皿：75mL。18.4

層析柱：內(nèi)徑2cm，長(zhǎng)10cm，不具活塞。18.5

具塞濃縮瓶：10mL，底部具0.2mL刻度尾管。18.6

玻璃板：5cm×20cm。18.7

薄層涂布器：0.3mm。18.8

展開(kāi)槽：內(nèi)長(zhǎng)26cm，寬6cm，高4cm。18.9

紫外光燈：365nm。18.10

微量注射器：10μL，50μL。18.11

平底管：50mL。18.12

雙波長(zhǎng)薄層掃描儀：帶數(shù)據(jù)處理機(jī)。

19

分析步驟19.1

試樣提取

稱(chēng)取20g粉碎試樣置于200mL具塞錐瓶中，加8mL和100mL三氯（lv）甲烷-無(wú)水乙醇(8+2)，密塞。在瓶塞上涂層水，蓋嚴(yán)防漏，振蕩1h，通過(guò)折疊快速定性濾紙過(guò)濾，取25mL濾液于75mL玻璃蒸發(fā)皿中，置90℃水浴上通風(fēng)揮干。19.2

凈化19.2.1

液-液分配

谷物：用50mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中的殘?jiān)慈?00mL分液漏斗中，再用20mL(玉米試樣用30mL)甲醇-水(4+1)分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中。

谷物制品(蛋糕、餅干、面包等)：用100mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中的殘?jiān)慈?50mL分液漏斗中，再用30mL甲醇-水(4+1)分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中。振蕩分液漏斗1.5min，靜置約15min使分層后，將下層甲醇-水提取液過(guò)柱凈化，不要將兩相交界處的白色絮狀物放入柱內(nèi)。19.2.2

柱凈化

小麥及其制品：在層析柱下端與小管連結(jié)處塞約0.1g脫脂棉，盡量塞緊，先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加0.4g活性炭，敲緊。將層析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽濾瓶上，抽濾瓶中放一平底管接受過(guò)柱液，將抽濾瓶接上水泵或真空泵，稍稍開(kāi)啟泵，使活性炭壓緊，將分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加入柱內(nèi)，控制流速為每15秒18滴~20滴(3mL/min)，甲醇-水提取液過(guò)柱快完畢時(shí)，加入10mL

甲醇-水(4+1)淋洗柱，抽濾，直至柱內(nèi)不再有液體流出。過(guò)柱速度控制在2mL/min~3mL/min，速度太快凈化效果不好，太慢耗時(shí)太長(zhǎng)。

玉米：同，只是將活性炭的用量改為0.3g。19.3

制備薄層層析用樣液

將過(guò)柱后的洗脫液倒入75mL玻璃蒸發(fā)皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗滌平底管。將蒸發(fā)皿置沸水浴上濃縮至干：

a)

小麥：趁熱加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，在水浴鍋上輕輕地反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿數(shù)次，使充分沸騰將殘?jiān)械腄ON

溶出，并將乙酸乙酯揮發(fā)至干，再加入3mL乙酸乙酯同樣處理一次，將溶劑揮干，最后加3mL乙酸乙酯，加熱至沸，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，再用3份1.5mL乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中。

b)

小麥制品和玉米：趁熱加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，在水浴鍋上輕輕地反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿數(shù)次，使充分沸騰，將殘?jiān)蠨ON

溶出，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中。加約0.5mL甲醇-丙酮(1+2)于蒸發(fā)皿中，用玻璃攪動(dòng)溶解殘?jiān)瑢⒄舭l(fā)皿置水浴鍋上揮干溶劑后，加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿，使充分沸騰，放冷至室溫后轉(zhuǎn)入同一濃縮瓶中，再用0.5mL甲醇-丙酮(1+2)和3mL乙酸乙酯同樣處理一次，乙酸乙酯提取液并入濃縮瓶中。

將濃縮瓶置約95℃水浴鍋上，用蒸汽加熱吹氮?dú)鉂饪s至干，放冷至室溫后加入0.2mL三氯（lv）甲烷-乙腈(4+1)溶解殘?jiān)糇鞅訉游鲇谩?9.4

測(cè)定19.4.1

薄層板的制備：4g硅膠G加約9mL15%氯化鋁(AlCl3·6H2O)水溶液，研磨約2min至呈黏稠狀，鋪成5cm×20cm

的薄層板三塊，置室溫干燥后，于105℃活化1h，貯干燥器中備用。19.4.2

點(diǎn)樣：在每塊薄層板上距下端2.5cm

的基線(xiàn)上點(diǎn)樣。

第一塊板：對(duì)每一個(gè)試樣先點(diǎn)第一塊薄層板，在距板左邊緣1.8cm

處點(diǎn)25μL試樣液，在距板上端1.5cm

處的橫線(xiàn)上并與基線(xiàn)試樣點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的位置上點(diǎn)2μLDON

標(biāo)準(zhǔn)液(50ng)。

第二塊板：在第一塊板上未顯熒光的試樣則需在第二塊薄層板上距左邊緣0.8cm~1cm

處滴加樣液點(diǎn)(根據(jù)情況估計(jì)滴加量，或稀釋后定量)，在距板左邊緣2cm

處和在距右邊緣1.2cm

處分別滴加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，DON

的量可為50ng、75ng、100ng。再在距板上端1.5cm

處的橫線(xiàn)上點(diǎn)三個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(各50ng)，使之與基線(xiàn)上的三個(gè)點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。19.4.3

展開(kāi)：

橫展劑：乙（yi）醚、乙（yi）醚-丙酮(95+5)或無(wú)水乙（yi）醚。任選其中一種，使試樣DON

點(diǎn)偏離原點(diǎn)0.7cm~1cm，剛好與雜質(zhì)熒光分開(kāi)。

縱展劑：三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)；

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。

橫展：在展開(kāi)槽內(nèi)倒入10mL橫展劑。將點(diǎn)好樣的薄層板靠樣液點(diǎn)的長(zhǎng)邊斜浸入溶劑，展至板端1min~2min，取出通風(fēng)揮干3min。對(duì)小麥制品還須再用10mL石油醚(30℃~60℃)橫展一次，展至板端過(guò)1min，取出通風(fēng)揮干5min。

縱展：在展開(kāi)槽內(nèi)倒入10mL縱展劑。將橫展揮干后的薄層板置展開(kāi)槽內(nèi)縱展15cm，取出通風(fēng)揮干10min，由于DON

與雜質(zhì)分離的效果受空氣濕度影響較大，當(dāng)板面分離效果不太好時(shí)即第一塊薄層板的試樣點(diǎn)附近有雜質(zhì)熒光干擾時(shí)，可按極性大小依次換用以下幾種展開(kāi)方式：a)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)。b)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)并在展開(kāi)槽蓋內(nèi)面貼上水飽和的濾紙。c)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。d)

三氯（lv）甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)并在展開(kāi)槽內(nèi)面貼上水飽和的濾紙。改換縱展方式，展開(kāi)第二塊薄層板。如展開(kāi)槽內(nèi)極性太大，會(huì)使DON

點(diǎn)變偏。19.4.4

顯熒光：先觀察未加熱的薄層板可見(jiàn)到顯藍(lán)紫熒光的干擾點(diǎn)，這時(shí)DON

不顯熒光，加熱薄層板后，雜質(zhì)點(diǎn)仍顯熒光，它在DON

熒光點(diǎn)附近，但不干擾DON。然后將此薄層板置130

℃烘箱中加熱7min~10min，取出放在冷的表面上1min~5min后于365nm

紫外光燈下觀察。19.4.5

觀察與評(píng)定：薄層板經(jīng)橫展后，板上樣液點(diǎn)的DON

點(diǎn)移動(dòng)0.7cm~1.0cm，正是根據(jù)這一點(diǎn)在縱展后使樣品DON

點(diǎn)擺脫了雜質(zhì)熒光的干擾。薄層板上端未經(jīng)縱展的三個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)可分別作為縱展后樣品DON

點(diǎn)和兩個(gè)DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的橫向定位點(diǎn)。樣品DON

點(diǎn)又可與縱展后的DON

標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較Rf值而定性。這樣從橫向和縱向兩個(gè)方面確定樣品DON

的位置，達(dá)到定性的目的。在第一塊薄層板上如樣品DON

點(diǎn)上有很淺的斜的熒光通過(guò)，這是過(guò)柱時(shí)沒(méi)有掌握好速度，凈化不夠，也可能是空氣濕度的變化，影響分離效果，但兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DON

點(diǎn)的位置上均無(wú)雜質(zhì)熒光干擾。如在第一塊薄層板上樣液未顯熒光點(diǎn)，而在第二塊薄層板上樣液25μL加標(biāo)準(zhǔn)25ng所顯熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)25ng相等，則樣品中DON

含量為陰性或?yàn)?0μg/kg以下。陽(yáng)性樣品概略定量時(shí)，雖然薄層板上三個(gè)D（lv）ON

點(diǎn)在橫展中都稍有移動(dòng)，但對(duì)各點(diǎn)熒光強(qiáng)度無(wú)影響，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)均可用于和樣品DON點(diǎn)比較熒光強(qiáng)度。19.4.6

薄層光密度計(jì)測(cè)定：激發(fā)光波長(zhǎng)340nm、發(fā)射光波長(zhǎng)400nm。在薄層板上標(biāo)準(zhǔn)DON

熒光點(diǎn)至少在100ng、200ng、400ng時(shí)，測(cè)得的響應(yīng)與DON

的量才呈線(xiàn)性關(guān)系。對(duì)DON

含量在300μg/kg以上的樣品才用光密度計(jì)測(cè)定。當(dāng)DON

含量在300μg/kg時(shí)，點(diǎn)樣液20μL

使測(cè)得的DON

的量落在100ng~200ng之間。用薄層掃描儀測(cè)定時(shí)，每塊薄層板上滴加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DON

點(diǎn)，DON

的量為100ng、200ng或200ng、400ng。在激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)400nm

條件下進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得的峰面積值為縱坐標(biāo)，DON

量為橫坐標(biāo)