61、輟學如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。蛋白質組學主要技術簡介蛋白質組學主要技術簡介61、輟學如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。蛋白質組學主要技術簡介蛋白質組學主要技術簡介楊學習生物技術學院蛋白質組（proteome）Proteome＝PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達的所有蛋白質）。一個基因組、一種生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白質技術目標（要求）有效分離準確鑒定合理分析預分離同質均一LaserCaptureMicro-dissection，是直接在光學顯微觀察的基礎上，利用激光能量對特定的組織或細胞類型進行切割，從而獲得均一性的樣品。激光捕獲顯微切割（LCM）技術提到激光時腦海中的第一印象？軍事激光測距直接摧毀激光制導激光應用醫療：最早的激光醫療應用：1961年12月在哥倫比亞長老會醫院用紅寶石激光器進行了視網膜腫瘤治療；腫瘤治療；眼科手術：視網膜焊接、近視治療；美容；外科手術等?？蒲校喝⒊上?、非線性光學等需要高相干性、大功率光源的項目；可控核聚變；光鑷、冷凍原子激光應用工業應用：切割：速度快、無接觸、精度高、切縫光滑；焊接：焊接點均勻、美觀、精度高；表面處理；芯片刻蝕等。激光應用其他條碼掃描照明、成像通訊娛樂激光應用激光LASER(LightAmplificationbyStimulatedEmissionofRadiation)輻射的受激發射光擴大錢學森建議將“光受激輻射”改稱“激光”。受激吸收自發輻射受激輻射受激吸收當原子中的電子處于低能級時，吸收光子的能量后從低能級躍遷到高能級光吸收。低能級E1高能級E2光子

E2E1h

自發輻射原子在沒有外界干預的情況下，電子會由處于激發態的高能級E2

自動躍遷至低能級E1，這種躍遷稱為自發躍遷。自發輻射光子頻率受激輻射當原子中的電子處于高能級時，若外來光子的頻率恰好滿足時，電子會在外來光子的誘發下向低能級躍，并發出與外來光子一樣特征的光子受激輻射。E2E1全同光子h

實驗表明，受激輻射產生的光子與外來光子具有相同的頻率、相位和偏振方向。在受激輻射中通過一個光的作用，得到兩個特征完全相同的光子，如果這兩個光子再引起其它原子產生受激輻射，就能得到更多的特征完全相同的光子光放大，激光。

光放大粒子數正常分布和粒子數反轉

lasercapturemicrodissection(LCM)1995年Liotta教授等進一步發展的非接觸性激光顯微切割技術（non-contactlasermicrodissectionofmembrane-mountednativetissue）使得顯微切割實現了高度精確、無污染、快速和自動化將熱敏的乙酸乙烯薄膜覆蓋在組織切片上，用激光束(100mJ～200mJ)直接照射需要的細胞群，薄膜受熱而與下面的組織緊緊粘住，掀開薄膜就可將靶組織粘在薄膜上，可用于PCR第一代激光微切割技術

第一代技術特點1，切割速度慢，不適合大面積收集2，不適合RNA和蛋白質的研究。

第二代激光微切割技術LaserMicrobeamMicrodissectionLMMLaserPressureCatapultingLPC-基于第一代的缺點，開創性地采用紫外激光沿樣品外緣切割的工作方式，利用激光離焦面的沖擊力，將分離后的樣品向上彈射收集系統特性：無接觸方式捕捉樣本，避免污染無熱傳送，無損DNA、RNA和蛋白結構或或細胞的存活能力激光切割精度小于1微米可將不同種類的細胞，自動分類切割到不同的離心管內德國CarlZeiss公司PALM激光顯微切割系統熒光激發模塊第三代技術特點：全自動系統，速度快適應蛋白分析的需求無接觸的樣品收集方式樣品收集器可快速更換收集管多樣品收集，可以通過軟件控制自動選擇樣品收集器的收集管LivingCellCuttingChromosomeCuttingSingleCellCuttingCuttingLargeAreas適用的組織樣品快速簡單、有效減少交叉污染樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的樣品的完整性。對制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣形態上（普通染色）表型或功能上（熒光染色）（同質性）LCM優點和特性二、二維凝膠電泳技術二維電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)，又稱雙向電泳第一向:等電聚焦分離，第二向:SDS兩種不同性質等電點分子量分辨率遠高于其他任何一種單一的電泳方法，是目前分析混合蛋白質樣品最有效的手段。雙向電泳實驗流程樣品制備（Samplepreparation）固相預制膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）膠條的平衡（IPGstripequilibration）膠條轉移第二向SDS電泳（SDSelectrophresis）凝膠的染色及檢測（Detection/Staining）圖像分析（Softwareanalysis）雙向電泳實驗流程1、樣品制備最關鍵的一步;處理方法多種多樣遵循基本的原則：1)溶 全部溶解待分析樣品2)去 完全去除核酸、盡量去除高豐度蛋白3)防 化學修飾、聚集、沉淀1、樣品制備順序抽提法：

第一步：Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：標準IEF樣品液溶解高疏水性蛋白；第三步：含復合表面活性劑的蛋白溶解液膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。1、樣品制備樣品中核酸的去除

對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質形成復合物后會出現假象遷移和條紋。

解決方法：不含蛋白酶的核酸內切酶進行降解合成載體兩性電解質（SCA）同核酸結合形成復合物，通過超速離心來去除復合物1、樣品制備防止化學修飾、聚集和沉淀添加酶抑制劑防蛋白質水解，目前多用PMSF、EDTA/EGTA或甲苯磺酰賴氨酸氯甲酮（TLCK）/甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）等

低溫防聚集、沉淀2.IPG膠條重泡脹(rehydration)和上樣(loading)一般采用預制的IPG干膠條（商品化），需要用重泡脹液(rehydrationsolution)使其重性水化膨脹成凝膠，使樣品能夠充分進入凝膠內，完成上樣?？捎弥嘏菝浺涸谑覝亟?2h后上樣，或在低電壓(30v)下室溫12h,使IPG干膠條邊水化膨脹邊上樣。IPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，預試驗確定。3.第一向等電聚焦

(isoelectricfocusing,IEF)聚焦時間的優化

理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復性所需最佳時間是IEF分離達到穩定態所需的時間。聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現。過度聚焦會造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經驗來確定。4.IEF后膠條的平衡一維結束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質與SDS完整結合，從而在SDS時電泳能順利進行。5.膠條向第二向轉移將IEF后的膠條轉移到垂直板聚丙烯酰胺上，用1%的瓊脂糖封閉，從而使膠條上的蛋白轉移到第二向分離膠中，根據分子量大小將pI接近的蛋白進行進一步分離。同普通SDS類似。無需濃縮膠？在IPG膠條中蛋白質區域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。注意：進行第二向SDS時，要求恒溫，但溫度不要低于15℃，否則會引起凝膠收縮，影響蛋白從膠條向第二向凝膠的轉移。6.SDS7.2D膠的染色理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩定（stability）：兼容性（synergy）：有機染料和銀染:會減少膠內蛋白質產量。膠體考馬斯亮藍染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍銀染:線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。缺點是：對某些種類的蛋白質染色效果差，對其后的蛋白質測序和質譜分析造成影響。負染:

能專門提高PAGE膠上蛋白質的回收率，但不能用于膜上染色。結果表現為膠面著色而蛋白質點透明。速度快（5~15min），蛋白質的生物活性能保持。它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提取以及質譜分析。有機熒光團染料

包括共價結合和非共價結合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS膠內蛋白質進行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數量級。8.圖像分析在用雙向電泳進行差別表達蛋白質組分析時，需要利用軟件對產生的2D膠進行差別分析，以尋找差別表達蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的ImageMaster2DElite或ImageMaster2DPlanium分析軟件。ImageanalysiswithImageMasterPlatinum差別分析(Differentialanalysis)表達增高的點（Up-regulatedspots）表達降低的點（Down-regulatedspots）只在樣品或對照品中出現的特異性點差別分析示意圖Sample1aSample1bSample1cPresentin(a)and(c)not(b)Presentonlyin(a)Strongerin(b)than(a)or(c)europeanbiotechnologist//introduction-to-2d-gel-electrophoresis/視頻ggene/html/video/2009/0807/1968.htmlggene/html/video/2009/0807/1967.htmlggene/html/video/2009/0807/1966.html三、生物質譜技術原理:將樣品離子化,根據不同的質量和電荷差異確定分子量的技術應用:蛋白質序列分析蛋白質修飾分析最重要的鑒定技術（支柱）1.概述化合物分子受到電子流沖擊后，形成的帶正電荷分子離子及碎片離子，按照其質量m和電荷z的比值m/z（質荷比）大小依次排列而被記錄下來的圖譜，稱為質譜。質譜分析法（MassSpectrometry,MS）是在高真空系統中測定樣品的分子離子及碎片離子質量，以確定樣品相對分子質量及分子結構的方法。同位素質譜、無機質譜、有機質譜、生物質譜發展概況:第一臺質譜儀是英國科學家阿斯頓（F.W.Aston，1877—1945）于1919年制成的。發現了多種元素同位素研究了53個非放射性元素發現了天然存在的287種核素中的212種第一次證明原子質量虧損。他為此榮獲1922年諾貝爾化學獎。從20世紀60年代開始，質譜就廣泛應用于有機化合物分子結構的測定。生物質譜，要求測定上萬甚至是上百萬相對分子質量的生物分子，以往的質譜只要求測定幾十到2000的相對分子質量。應用于生物大分子需要將之制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子，同時又不喪失其結構形狀。70年代，解吸技術的出現成功地將蛋白分子轉化成氣相離子。80年代電噴霧電離(ESI)和軟激光解吸(SLD)電離技術的發展則使得質譜方法應用于高分子量蛋白分子的研究。2.質譜儀組成進樣器離子化源質量分析器離子檢測器控制電腦數據分析系統MS:AtoolforproteinidentificationESIMALDIIonTrap,TOF,FT,QTOF真空系統質譜儀的離子源、質譜分析器及檢測器必須處于高真空狀態（離子源的真空度應達10?3～10?5Pa，質量分析器應達10?6Pa），若真空度低，則：（i）大量氧會燒壞離子源的燈絲；（ii）會使本底增高，干擾質譜圖；（iii）用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電，等等。3.離子源電子碰撞快原子轟擊電噴霧離子化基質輔助激光解吸附3.1、基質輔助激光解吸電離蛋白激光(高能)只有碎片沒有基質蛋白激光(高能)離子化基質

ProteinH+3.2、電噴霧電離（ESI）ElectrosprayIonization(ESI)HighVoltageSampleFlowNebulizerGaschargeddropletsform++++–++–++–++++++++++++++IonsreleasedToMSVacuumInterface*BroadrangeofimplementationsbasedonflowrateandpolarityofcompoundclassSpray4.質量分析技術飛行時間質譜time-of-flight,TOF四極桿質譜quaddrupole,Q離子阱質譜irontrap,IT傅立葉變換離子回旋共振質譜fouriertransformioncyclotron,FrICR4.1Time-of-Flight(TOF)飛行時間E=?m1

12=?m2

22

1>

2(m1<m2)(m:molecularweight

:velocity)由于每一個離子在電場中得到了相同的能量,小分子會比大分子飛的更快.IonSource(MALDI)Detectorm1m2Faster如何測量質量??離子源(MALDI)檢測器離子飛行管L測量飛行的時間V(15-25kV)t =time-of-flight(s)m =massoftheion(kg)q =chargeonion(C)V0 =acceleratingpotential(V)L =lengthofflighttube(m)E=?m

2=qV0?m(L/t)2=qV0

m=2qV0(t/L)2

質量數可以由到達檢測器的時間差而計算出MALDI-TOF12344.2四級桿質量分析器三重四極桿質量分析器Triplequadrupolemassanalyzer

CID:CollisionInducedDissociationforacquiringMolecularweightandStru