回歸教材重難點06微生物的選擇、培養與計數【★01教材方位直擊】本題主要考查微生物的篩選與培養及相關實驗探究，要求考生識記培養基的成分、種類及作用；掌握分離微生物常用的兩種方法及操作過程；掌握探究實驗的原則，能結合圖中信息知識答題，同時本章節會經常以流程圖，來考查微生物的分離和培養，土壤中尿素分解菌的分離與計數與纖維素分解菌等微生物分離的原理及方法，是常考的內容，同時也會伴隨著滅菌方法的考察，學生要準確記憶培養基的種類及作用，同時對于微生物計數的計數，學生要能掌握直接計數法和間接計數法的計數原理，準確掌握并運用公式進行計算。【★02重難點背誦歸納】易錯點01．培養基（1）概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養物質。（3）營養成分：水、無機鹽、碳源、氮源，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質及氧氣的要求。2．無菌技術（1）目的：獲得純凈培養物。（2）關鍵：防止外來雜菌的入侵。（3）不同對象的無菌操作方法[連線]：營養物質定義作用主要來源碳源凡能提供所需碳元素的物質構成生物體的細胞物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質無機化合物：CO2、NaHCO3等；有機化合物：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物質合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽等；有機化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生長因子生長必不可少的微量有機物酶和核酸的組成成分維生素、氨基酸、堿基等水在生物體內含量很高不僅是優良的溶劑而且可維持生物大分子結構的穩定外界攝入無機鹽為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素細胞內的組成成分，生理調節物質，某些化能自養菌的能源，酶的激活劑無機化合物易錯點02：微生物的純化1.方法：（1）平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。（2）稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。稀釋操作時：每支試管及其中9mL水、移液管均需滅菌；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。（3）涂布平板時：稀釋涂布平板的操作比較復雜，且各個細節均需保證“無菌”，應特別注意：①酒精燈與培養皿的距離要合適。②吸管頭不要接觸任何其他物體。③吸管要在酒精燈火焰周圍使用。2.注意事項：（1）倒平板操作：①培養基滅菌后，需冷卻至50℃左右時才能倒平板，原因是瓊脂在44℃以下凝固。②培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全打開。③整個操作過程要在酒精燈火焰旁進行，避免雜菌污染。④平板冷凝后要倒置的原因：防止皿蓋上的冷凝水珠落入培養基，造成污染。⑤若倒平板時，培養基濺在皿蓋和皿底之間的部位，這個平板應丟棄。（2）平板劃線操作：①第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒接種環滅菌，劃線操作結束仍需灼燒接種環。②灼燒接種環之后，要等其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。③劃線時最后一區域不要與第一區域相連。④劃線用力要大小適當，防止用力過大將培養基劃破。3．平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較項目優點缺點適用范圍平板劃線分離法可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離不能計數適用于好氧菌稀釋涂布平板法可以計數，可以觀察菌落特征吸收量較少、較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延適用于厭氧菌和兼性厭氧菌4.兩種菌種保存方法的比較項目臨時保藏法甘油管藏法適用對象頻繁使用的菌種長期保存的菌種培養基類型固體斜面培養基液體培養基溫度4℃－20℃方法菌落長成后于冰箱中保存，每3～6個月將菌種從舊的培養基轉移到新鮮培養基上將培養的菌液與等體積滅菌后的甘油混合均勻后于冷凍箱內保存缺點菌種易被污染或產生變異易錯點03：微生物的選擇分離與計數1.選擇培養基是指通過培養混合的微生物，僅得到或篩選出所需要的微生物，其他不需要的種類在這種培養基上是不能生存的。2.分解纖維素的微生物的分離的實驗原理：（1）土壤中存在著大量纖維素分解酶，包括真菌、細菌和放線菌等，它們可以產生纖維素酶。纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。故在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長。（2）在培養基中加入剛果紅，可與培養基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被分解后，紅色復合物不能形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，從而可篩選纖維素分解菌。3.統計菌落數目的方法：（1）顯微鏡直接計數法：①原理：利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物數量；②方法：用計數板計數；③缺點：不能區分死菌與活菌。（2）間接計數法（活菌計數法）：①原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。②操作：a.設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。b.為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。③計算公式：每克樣品中的菌株數=（c÷V）×M，其中c代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL），M代表稀釋倍數。【★03真題好題演練】真題演練：1.（2021·河北省）葡萄酒生產過程中會產生大量的釀酒殘渣（皮渣）。目前這些皮渣主要用作飼料或肥料，同時研究者也采取多種措施拓展其利用價值。回答下列問題：（1）皮渣中含有較多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前將原料干燥、粉碎的目的分別是__________，萃取效率主要取決于萃取劑的__________。萃取過程需要在適宜溫度下進行，溫度過高會導致花色苷__________。研究發現，萃取時輔以纖維素酶、果膠酶處理可提高花色苷的提取率，原因是____________________。（2）為了解皮渣中微生物的數量，取10g皮渣加入90mL無菌水，混勻、靜置后取上清液，用稀釋涂布平板法將0.1mL稀釋液接種于培養基上。104倍稀釋對應的三個平板中菌落數量分別為78、91和95，則每克皮渣中微生物數量為__________個。（3）皮渣堆積會積累醋酸菌，可從中篩選優良菌株。制備醋酸菌初篩平板時，需要將培養基的pH調至__________性，滅菌后須在未凝固的培養基中加入無菌碳酸鈣粉末、充分混勻后倒平板，加入碳酸鈣的目的是______________________________。培養篩選得到的醋酸菌時，在缺少糖源的液體培養基中可加入乙醇作為__________。（4）皮渣堆積過程中也會積累某些兼性厭氧型乳酸菌。初篩醋酸菌時，乳酸菌有可能混入其中，且兩者菌落形態相似。請設計一個簡單實驗，區分篩選平板上的醋酸菌和乳酸菌_________。（簡要寫出實驗步驟和預期結果）【答案】（1）利于萃取劑溶解花色苷、使原料與萃取劑充分接觸（2）性質和使用量（3）分解（4）纖維素酶、果膠酶可破壞細胞壁，有利于提高花色苷的提取率（5）8.8×106（6）中性或偏堿（7）使培養基不透明，從而使醋酸菌菌落周圍出現透明圈（8）碳源（9）實驗步驟：將平板置于無氧環境下繼續培養，觀察菌落形態和透明圈大小

預期結果：若菌落繼續生長，且透明圈增大，則為兼性厭氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能繼續生長，透明圈不再擴大，則為醋酸菌菌落【解析】（1）天然食用色素花色苷可用萃取法提取，萃取劑與水應不混溶，萃取前將原料干燥，有利于萃取劑溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料與萃取劑充分接觸；萃取效率主要取決于萃取劑的性質和使用量。萃取過程需要在適宜溫度下進行，溫度過高會導致花色苷分解。萃取時輔以纖維素酶、果膠酶處理，可破壞細胞壁，有利于提高花色苷的提取率。（2）為了解皮渣中微生物的數量，取10g皮渣加入90mL無菌水，混勻、靜置后取上清液，用稀釋涂布平板法將0.1mL稀釋液接種于培養基上。104倍稀釋對應的三個平板中菌落數量分別為78、91和95，則三個平板中平均菌落數為（78+91+95）÷3=88，每克皮渣中微生物數量為88÷0.1×104=8.8×106個。（3）醋酸菌屬于細菌，制備醋酸菌初篩平板時，需要將培養基的pH調至中性或弱堿性，滅菌后在未凝固的培養基中加入無菌碳酸鈣粉末、充分混勻后倒平板，加入碳酸鈣可使培養基不透明，醋酸菌產生的醋酸可分解碳酸鈣，產生透明圈，根據這一特點可篩選出醋酸菌，在缺少糖源的液體培養基中醋酸菌以乙醇為碳源，先把乙醇氧化為乙醛，再把乙醛氧化為乙酸。（4）醋酸菌為好氧菌，與兼性厭氧型的乳酸菌菌落形態相似，且二者產生的代謝產物均可使碳酸鈣分解，區分篩選平板上的醋酸菌和乳酸菌，可將平板置于無氧環境下繼續培養，觀察菌落形態和透明圈大小。若菌落繼續生長，且透明圈增大，則為兼性厭氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能繼續生長，透明圈不再擴大，則為醋酸菌菌落。2.（2021·湖南省）大熊貓是我國特有的珍稀野生動物，每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12~38kg。大熊貓可利用竹子中8%的纖維素和27%的半纖維素。研究人員從大熊貓糞便和土壤中篩選纖維素分解菌。回答下列問題：（1）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即_________。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以_________為唯一碳源的固體培養基上進行培養，該培養基從功能上分類屬于_________培養基。（2）配制的培養基必須進行滅菌處理，目的是_________。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是_________。（3）簡要寫出測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數的實驗思路_________。（4）為高效降解農業秸稈廢棄物，研究人員利用從土壤中篩選獲得的3株纖維素分解菌，在37℃條件下進行玉米秸稈降解實驗，結果如表所示。在該條件下纖維素酶活力最高的是菌株_________，理由是_________。菌株秸稈總重（g）秸稈殘重（g）秸稈失重（%）纖維素降解率（%）A2.001.5124.5016.14B2.001.53235014.92C2.001.4229.0023.32【答案】（1）C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶（2）纖維素（3）選擇（4）為了殺死培養基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）（5）不接種培養（或空白培養）（6）將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1mL涂布到若干個平板（每個稀釋度至少涂布三個平板），對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數（7）C（8）接種C菌株后秸稈失重最多，纖維素降解率最大

【解析】（1）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以纖維素為唯一碳源的固體培養基上進行培養；培養基從功能上分類可分為選擇培養基和鑒別培養基，故該培養基從功能上分類屬于選擇培養基。（2）配制培養基的常用高壓蒸汽滅菌，即將培養基置于壓力100kPa、溫度121℃條件下維持15～30分鐘，目的是殺死培養基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。為檢測滅菌效果可對培養基進行空白培養，即將未接種的培養基在適宜條件下培養一段時間，若在適宜條件下培養無菌落出現，說明培養基滅菌徹底，否則說明培養基滅菌不徹底。（3）為測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數，常采用稀釋涂布平板法，在適宜的條件下對大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌進行純化并計數時，對照組應該涂布等量的無菌水。將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1mL涂布到若干個平板（每個稀釋度至少涂布三個平板），對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數。（4）測定酶活力時可以用單位時間內、單位體積中反應物的減少量或產物的增加量來表示。由表格可知，在適宜的條件下，C菌株在相同的溫度和時間下，秸稈失重最多，纖維素降解率最大，說明該菌株的纖維素分解菌產生的纖維素酶活力最大。3.（2021·浙江省）回答下列（一）小題：（一）某環保公司從淤泥中分離到一種高效降解富營養化污水污染物細菌菌株，制備了固定化菌株。（1）從淤泥中分離細菌時常用劃線分離法或________法，兩種方法均能在固體培養基上形成________。對分離的菌株進行誘變、________和鑒定，從而獲得能高效降解富營養化污水污染物的菌株。該菌株只能在添加了特定成分X的培養基上繁殖。（2）固定化菌株的制備流程如下；①將菌株與該公司研制的特定介質結合；②用蒸餾水去除________；③檢驗固定化菌株的________。菌株與特定介質的結合不宜直接采用交聯法和共價偶聯法，可以采用的2種方法是________。（3）對外，只提供固定化菌株有利于保護該公司的知識產權，推測其原因是________。【答案】（1）涂布分離（2）單菌落（3）篩選（4）未固定的細菌（5）降解富營養化污水污染物的能力（6）包埋法和吸附法（7）特定介質能為菌株繁殖提供X【解析】1.分離純化細菌最常用的方法是劃線分離法（平板劃線法）和涂布分離法（稀釋涂布平板法）。接種的目的是使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，并在培養基表面形成單個細菌繁殖而成的子細胞群體——菌落。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。2.固定化酶（insolubleenzyme）就是將水溶性的酶用物理或化學的方法固定在某種介質上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。固定化的方法有吸附法、共價偶聯法、交聯法和包埋法等。3.植物組織培養的原理是植物細胞具有全能性，其具體過程：外植體→愈傷組織→胚狀體→新植體，其中脫分化過程要避光，而再分化過程需光。4.在植物組織培養時，通過調節生長素和細胞分裂素的比值能影響愈傷組織分化出根或芽。（一）分析題意可知，本實驗目的是從淤泥中分離到一種高效降解富營養化污水污染物的細菌菌株，制備固定化菌株。（1）分離純化細菌最常用的方法是劃線分離法或涂布分離法，兩種方法均能在固體培養基上形成單菌落。為了獲得能高效降解富營養化污水污染物的菌株，還需對分離的菌株進行誘變處理，再經篩選和鑒定。（2）固定化的方法有吸附法、共價偶聯法、交聯法和包埋法等。由于菌株與特定介質的結合不宜直接采用交聯法和共價偶聯法，故可以采用的2種方法是包埋法和吸附法。（3）由于該菌株只能在添加了特定成分X的培養基上繁殖，可推測特定介質能為菌株繁殖提供X，故該公司對外只提供固定化菌株，有利于保護該公司的知識產權。4.（2021·全國甲卷）加酶洗衣粉是指含有酶制劑的洗衣粉。某同學通過實驗比較了幾種洗衣粉的去漬效果（“+”越多表示去漬效果越好），實驗結果見下表。加酶洗衣粉A加酶洗衣粉B加酶洗衣粉C無酶洗衣粉（對照）血漬++++++++油漬++++++++根據實驗結果回答下列問題：（1）加酶洗衣粉A中添加的酶是__________；加酶洗衣粉B中添加的酶是__________；加酶洗衣粉C中添加的酶是__________。（2）表中不宜用于洗滌蠶絲織物的洗衣粉有__________，原因是___________。（3）相對于無酶洗衣粉，加酶洗衣粉去漬效果好原因是___________。（4）關于酶的應用，除上面提到的加酶洗衣粉外，固定化酶也在生產實踐中得到應用，如固定化葡萄糖異構酶已經用于高果糖漿生產。固定化酶技術是指___________。固定化酶在生產實踐中應用的優點是_________（答出1點即可）。【答案】（1）蛋白酶（2）脂肪酶（3）蛋白酶和脂肪酶（4）加酶洗衣粉A和加酶洗衣粉C（5）蠶絲織物的主要成分是蛋白質，會被蛋白酶催化水解（6）酶可以將大分子有機物分解為小分子有機物，小分子有機物易溶于水，從而將污漬與洗滌物分開（7）利用物理或化學方法將酶固定在一定空間內的技術（8）固定在載體上的酶可以被反復利用，可降低生產成本（或產物容易分離，可提高產品的產量和質量，或固定化酶穩定性好，可持續發揮作用）【解析】加酶洗衣粉是指含有酶制劑的洗衣粉，目前常用的酶制劑有四類：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶。其中，應用最廣泛、效果最明顯的是堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。堿性蛋白酶能將血漬、奶漬等含有大分子蛋白質水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污跡容易從衣物上脫落。（1）從表格中信息可知，加酶洗衣粉A對血漬的洗滌效果比對照組的無酶洗衣粉效果好，而血漬含有大分子蛋白質，因此，加酶洗衣粉A中添加的酶是蛋白酶，同理，加酶洗衣粉B中添加的酶是脂肪酶；加酶洗衣粉C對血漬和油漬的洗滌效果比無酶洗衣粉好，油漬中有脂肪，因此，加酶洗衣粉C中添加的酶是蛋白酶和脂肪酶。（2）蠶絲織物中有蛋白質，因此，表中不宜用于洗滌蠶絲織物的洗衣粉有加酶洗衣粉A、加酶洗衣粉C，原因是蠶絲織物主要成分是蛋白質，會被蛋白酶催化水解。（3）據分析可知，相對于無酶洗衣粉，加酶洗衣粉去漬效果好的原因是：酶可以將大分子有機物分解為小分子有機物，小分子有機物易溶于水，從而將污漬與洗滌物分開。（4）固定化酶技術是指利用物理或化學方法將酶固定在一定空間內的技術，酶既能與反應物接觸，又能與產物分離，所以固定在載體上的酶還可以被反復利用。所以固定化酶在生產實踐中應用的優點是：降低生產成本（或產物容易分離，可提高產品的產量和質量，或固定化酶穩定性好，可持續發揮作用）。好題演練：1．（2022·陜西渭南·）進行垃圾分類收集可以減少垃圾處理時間，降低處理成本。科研小組欲分離及培養若干種微生物用于處理濕垃圾，如剩菜剩飯、骨頭、菜根菜葉、果皮等食品類廢物。請分析回答：（1）科研小組從土壤中篩選產脂肪酶的菌株時，配制的培養基需要以__________為唯一碳源。制備固體培養基的步驟是；計算→稱量→溶化→__________→__________。接種微生物最常用的方法是__________。（2）獲得產脂肪酶的菌株后，在處理含油垃圾的同時，可獲得單細胞蛋白，實現污染物資源化。現獲得可產脂肪酶的A、B兩種菌株，并進行了培養研究，結果如圖1所示。據圖分析，應選擇菌株__________進行后續相關研究，理由是______________________________。（3）科研小組從土壤中篩選淀粉分解菌時，加碘液染色后，選擇培養基上出現了A、B和C三種菌落（如圖2所示）。若要得到淀粉酶活力最高的菌株，應選擇__________（填“A”“B”或“C”）菌落進一步純化。經檢測A菌落為硝化細菌，A菌落能在此培養基上生長且沒有形成透明圈的原因是____________________。（4）在微生物分解處理垃圾的過程中，纖維素分解菌能夠分泌纖維素酶，該酶可將纖維素分解為葡萄糖。纖維素酶由三種復合酶組成，其中__________酶可將纖維二糖分解為葡萄糖。【答案】（1）脂肪滅菌倒平板稀釋涂布平板法和平板劃線法（2）B該菌株增殖速度快，且脂肪剩余比例小，降解脂肪能力強（3）C硝化細菌為自養細菌，能夠利用空氣中的二氧化碳合成有機物，但硝化細菌不能產生淀粉酶，所以無透明圈（4）葡萄糖苷【分析】分析圖1可知，菌株A的細胞密度增殖速率低于菌株B，脂肪剩余量菌株A高于菌株B。從圖2中可知，ABC三種菌株中，BC菌落周圍出現透明圈，而A菌落周圍未出現透明圈。（1）科研小組從土壤中篩選出產脂肪酶的菌株時，需設置只利于產脂肪酶的菌株生長，而其他雜菌生長受抑制的培養基，因此配制的培養基需要以脂肪為唯一碳源。制備固體培養基的步驟是：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。微生物接種最常用的方法是平板劃線法和稀釋涂布平板法，其次還有穿刺接種和斜面接種。（2）據圖1分析可知，菌株B增殖速度快，且脂肪剩余比例小，降解脂肪能力強，故應選擇菌株B進行后續相關研究。（3）科研小組從土壤中篩選淀粉分解菌時，加碘液染色后，選擇培養基上出現了A、B和C三種菌落，淀粉遇碘液會變藍，而淀粉酶能夠分解淀粉，則不同產酶活力的菌株周圍會形成不同直徑的透明圈，淀粉酶活力越強的菌株周圍的透明圈越大，因此若要得到淀粉酶活力最高的菌株，應選擇C菌落進一步純化，這是因為C菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值最大。經檢測A菌落為硝化細菌，A菌落能在此培養基上生長且沒有形成透明圈的原因是硝化細菌為自養細菌，能夠利用空氣中的二氧化碳合成有機物，但硝化細菌不能產生淀粉酶，所以無透明圈。（4）纖維素酶由三種復合酶組成，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。2．（2021·河南·）培養基是人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養基質。基本培養基能滿足野生型菌株的最低營養要求，一些突變型菌株因合成能力出現缺陷，需要在補充培養基（基本培養基中添加所缺陷的營養物質）上才能正常生長，可以滿足各種營養缺陷型的該微生物生長的培養基稱為完全培養基。回答下列問題：（1）培養基一般都含有__________四類成分；制備固體培養基的步驟包括計算、稱量、溶化、__________、倒平板；其中“計算”的依據是____________________。（2）借助完全培養基和基本培養基，采用影印法培養可以篩選出合成能力有缺陷的突變型菌株，過程如圖所示。用__________（填工具）將菌液接種到完全培養基上；由基本培養基上得到的結果推測，菌落__________最可能是合成能力有缺陷的突變型菌株。（3）為鑒定某突變型菌株的具體缺陷類型，將其涂布接種于以下5組添加了不同類型氨基酸的基本培養基中，觀察其生長狀況。結果該菌株只能在A、C兩組培養基中生長，則該菌株為__________（填氨基酸名稱）營養缺陷型菌株。簡述如何臨時保存所鑒別出的菌株：______________________________。組別氨基酸組合A組氨酸蘇氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸B精氨酸蘇氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸C酪氨酸谷氨酸賴氨酸色氨酸丙氨酸D甘氨酸天冬氨酸甲硫氨酸色氨酸絲氨酸E半胱氨酸亮氨酸苯丙氨酸丙氨酸絲氨酸【答案】（1）碳源、氨源、水和無機鹽滅菌培養基的配方比例和用量（2）涂布器2、7（3）谷氨酸將鑒別出的菌株接種到試管的固體斜面培養基上，待菌落長成后放在4℃的冰箱中保藏（以后每3～6月轉移一次，將菌種轉移到新鮮的培養基上）【分析】微生物常見的接種的方法：①平板劃線法：將已經熔化的培養基倒入培養皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養．在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數逐漸減少，最后可能形成單個菌落。②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經過大量稀釋后，均勻涂布在培養皿表面，經培養后可形成單個菌落。（1）培養基一般都含有碳源、氨源、水和無機鹽四類成分；制備固體培養基的步驟包括計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板；其中“計算”的依據是培養基的配方比例和用量。（2）篩選菌株用稀釋涂布平板法，用涂布器將菌液接種到基本培養基上；營養缺陷型不能生長，故2、7最可能是合成能力有缺陷的突變型菌株。（3）該菌株只能在A、C兩組培養基中生長，說明兩組培養基都含有該菌需要的氨基酸，即谷氨酸。臨時保存所鑒別出的菌株方法為：將鑒別出的菌株接種到試管的固體斜面培養基上，待菌落長成后放在4℃的冰箱中保藏（以后每3～6月轉移一次，將菌種轉移到新鮮的培養基上）。3．（2021·四川·樹德中學）生物興趣小組試圖探究牛和山羊的瘤胃中的微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下實驗，并成功篩選到能降解尿素的細菌（目的菌）。培養基成分如表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答問題：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g瓊脂15g溶解后自來水定容到1000mL（1）分解尿素的細菌能分泌____________酶，能將尿素分解成_______________。以尿素為唯一氮源的培養基因為________________________________具有選擇作用。（2）用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有___________（答出兩點即可）。（3）實驗是否需要振蕩培養來提高溶氧量：______（“是”或“否”），原因是______________。轉為固體培養時，常采用___________法接種，獲得單菌落后繼續篩選。（4）分離分解尿素的細菌實驗時，甲同學從培養基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落。甲同學實驗結果差異的原因可能有__________（填序號）。①取樣不同②培養基污染③操作失誤④沒有設置對照（5）要想增加該實驗的說服力，還應該怎么做？_____________________。（6）為進一步確定取自瘤胃中液體的適當稀釋倍數，將接種的培養皿放置在37℃恒溫培養箱中培養24?48h，觀察并統計具有紅色環帶的菌落數，結果見表，其中___________倍的稀釋比較合適。稀釋倍數103104105106107菌落數>5003672483618【答案】脲NH3和CO2能利用尿素的細菌能在該培養基上生長，不能利用尿素的細菌不能生長為細菌生長提供無機鹽，作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定否瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡平板劃線法或稀釋涂布平板①②③一是設置對照實驗，用該培養基不接種樣品觀察；再配制一組完全培養基，接種該樣品培養觀察。二是最后要對該微生物進行鑒定，用酚紅指示劑鑒定該微生物的菌落，看指示劑是否變紅106或105【分析】1.培養基選擇分解尿素的微生物的原理：培養基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發育繁殖，而受到抑制，所以用此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。2.培養基的基本成分包括水、無機鹽、碳源和氮源，此外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。3.微生物常見的接種的方法：①平板劃線法：將已經熔化的培養基倒入培養皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數逐漸減少，最后可能形成單個菌落。②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經過大量稀釋后，均勻涂布在培養皿表面，經培養后可形成單個菌落。4.選擇培養基是在培養基中加入相應的特殊營養物質或化學物質，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。【詳解】（1）土壤中的部分細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶；尿素在脲酶的催化下可以分解成NH3和CO2；以尿素為唯一氮源的培養基具有選擇作用是因為只有能合成脲酶的細菌才能利用尿素，能在該培養基上生長，不能利用尿素的細菌不能生長。（2）用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，可以為細菌生長提供鉀、鈉、磷等無機營養，同時，二者構成緩沖對，作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定。（3）根據題意，目的菌為來自于牛和山羊的瘤胃中的微生物，因此，實驗中不需要振蕩培養來提高溶氧量，因為瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡。轉為固體培養時，為了獲得單菌落，常采用平板劃線法或稀釋涂布平板法進行接種，獲得單菌落后再繼續篩選。（4）根據生物實驗應遵循對照原則、等量原則、單一變量原則和控制無關變量原則，A同學的實驗結果比其他同學多，可能是培養基污染造成的，還可能是A同學實驗操作過程中污染造成的，也可能是與其他同學所取土壤樣品不同造成的：土樣不同可能導致計數偏差，①正確；培養基污染會導致菌落數增加，②正確；操作失誤可能增加微生物的數量和種類，菌落會增多，③正確；沒有設置對照不會增加菌落數目，④錯誤。因此，A同學的實驗結果產生的原因可能是①②③。（5）微生物培養過程中，為了實驗結果具有說服力，常需設置對照實驗，用該培養基不接種樣品觀察；再配制一組完全培養基，接種該樣品培養觀察；另外，為了對分離的菌種進行進一步鑒定，還要用酚紅指示劑鑒定該微生物的菌落，看指示劑是否變紅。（6）在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品進行培養，以保證獲得菌落數在30～300之間、適于技術的平板。由表可知，106或105倍的稀釋比較合適。4．（2021·四川遂寧·）幽門螺桿菌（Hp菌）因為其導致胃痛、胃癌，成為最臭名昭著的細菌之一。它是一種異養微厭氧菌，胃里面還有胃酸（pH為1.5左右），絕大部分的細菌都適應不了。在患者體內采集樣本并制成菌液后，進行分離培養。實驗基本步驟如下：請回答下列問題：（1）上述培養過程中，能夠“濃縮”幽門螺桿菌的步驟是____。梯度稀釋操作時如何防止雜菌污染____。（2）有的化工廠會產生尿素廢水，研究者提出用幽門螺桿菌來處理廢水，如果該方法可行，根據題干信息可知，該處理過程對溫度和氧氣的要求是____。（3）實踐證明有一種尿素分解菌比幽門螺桿菌處理尿素廢水的能力強很多，最可能的原因是前者比后者產生的____多，科學家用分配色譜法分離該物質主要是利用了該物質與其他物質的____不同。在凝膠色譜柱的裝填過程中，裝柱前需要根據色譜柱的內體積計算需要的凝膠量的原因是___。（4）為了證明不分餐能導致胃幽門螺桿菌交叉傳播，研究者提取了某胃炎患者家庭的100g剩菜，加入無菌水稀釋。取上述稀釋液分別接種到3個適宜的培養基中置于適宜的條件下進行培養，三個平板上胃幽門螺桿菌菌落數均介于30～300之間且相差不大，求平均值得到菌落數為B個。根據上述情景不能計算出每克剩菜中的幽門螺桿菌的數量，原因是______。【答案】選擇培養試管口和移液管應該在離火焰1-2cm處（或者火焰附近）37℃左右、低氧（或無氧）脲酶相對分子質量干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大因為不知道稀釋倍數和接種體積【分析】1.分解尿素細菌的分離原理：（1）能合成脲酶的細菌才能分解尿素。（2）配制以尿素為唯一氮源的培養基，能夠生長的細菌就是能分解尿素的細菌。2.梯度稀釋操作時，無菌操作很關鍵。【詳解】（1）據圖分析可知，“選擇培養”為“濃縮”幽門螺桿菌的過程。梯度稀釋操作時，無菌操作很關鍵，要注意試管口和移液管應該在離火焰1-2cm處（或者火焰附近）進行實驗操作。（2）胃幽門螺桿菌是一種異養微厭氧菌，生活環境具有胃酸（pH為1.5左右），故用幽門螺桿菌來處理廢水應該在37℃左右、低氧（或無氧）環境中進行。（3）能合成脲酶的細菌才能分解尿素，若一種尿素分解菌比幽門螺桿菌處理尿素廢水的能力強很多，最可能的原因是前者比后者產生的脲酶多。科學家用分配色譜法分離該物質主要是利用了該物質與其他物質的相對分子質量不同。根據色譜柱的內體積計算需要的凝膠量的原因干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大。（4）不知道稀釋倍數和接種體積，無法計算出每克剩菜中的幽門螺桿菌的數量。5．（2022·江西吉安·）工業企業每年都會產生大量高濃度工業廢水，工業廢水進入水體，其中的酚類會被酚降解菌分解。從活性污泥中分離高效降解酚類的菌株并計數的過程如圖所示。回答下列問題：（1）酚類降解菌的富集培養基含有蛋白胨、K，HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中蛋白胨可為微生物生長提供的營養物質有________；實驗中對所用的培養皿、培養瓶等玻璃制品應采用____法進行滅菌；對配制好的培養基應采用_______法滅菌。（2）用______吸取1mL培養的菌液注入含______的試管中獲得101稀釋液，以此類推獲得105的稀釋液。（3）取稀釋倍數為105的菌液0.1mL采用________法接種到三個平板上，獲得的菌落數分別是105、125、115，則1mL菌液中含有酚類降解菌__________個。若菌落長滿整個平板，難以計數，最可能的原因是____________________________。【答案】碳源、氮源、維生素干熱滅菌高壓蒸汽滅菌無菌移液管9mL無菌水（稀釋）涂布平板1．15×108菌液稀釋度不夠【分析】1.微生物培養基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。對異養微生物來說，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作為營養要素成分時并不是起單一方面的作用。2.微生物常見的接種的方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法。【詳解】（1）蛋白胨營養豐富，可為微生物生長提供的營養物質有碳源、氮源、維生素等。實驗中對所用的培養皿、培養瓶等玻璃制品應采用干熱滅菌法進行滅菌；對配制好的培養基應采高壓蒸汽滅菌法滅菌；（2）一般用無菌移液管吸取菌液和培養液，所以用無菌移液管吸取1mL培養的菌液注入含9mL無菌水的試管中獲得101稀釋液，以此類推獲得105的稀釋液；（3）若要進行微生物的計數，需要用（稀釋）涂布平板法培養微生物，所以取稀釋倍數為10的菌液0.1mL采用（稀釋）涂布平板法接種到三個平板上，獲得的菌落數分別是105、125、115，則1mL菌液中含有酚類降解菌=C/V×稀釋倍數=（105+125+115）÷3÷0.1×105=1.15×108個。若菌液稀釋度不夠則菌落長滿整個平板，難以計數，因此若菌落長滿整個平板，難以計數，最可能的原因是菌液稀釋度不夠。6．（2021·廣東·）測定水樣是否符合飲用水衛生標準，常用濾膜法測定大腸桿菌的數目。流程如圖所示，濾膜法的大致流程：用濾膜過濾待測水樣→水樣中的細菌留在濾膜上→將濾膜轉移到伊紅美藍的培養基（EMB培養基）上培養→統計菌落數目。據圖回答問題：（1）過濾待測水樣用到的濾杯、濾膜和濾瓶首先需要進行___________________處理，保證實驗不受其他微生物干擾。與過濾有關的操作都要在___________________旁進行。（2）將完成過濾之后的濾膜緊貼在EMB培養基上，這屬于微生物培養中的_______________操作。從物理狀態角度分析，EMB培養基屬于_______________培養基，制備培養基時需要采用_______________法滅菌。（3）某生物興趣小組的某同學嘗試按照上述方法進行測定，無菌操作下將10mL待測水樣加入到90mL無菌水中，稀釋后的100mL菌液通過濾膜法測得EMB培養基上的菌落數平均為124，黑色菌落數平均為31，則推測1升待測水樣中的大腸桿菌數目為___________________個。（4）該同學進一步思考，利用濾膜法也可能用于測定待測水樣中其他微生物的數目。他取了兩份水樣，一份待測水樣來自變酸的果酒，從中檢測到兩種微生物，它們在結構上的主要區別是___________________。另一份來自某公園的觀賞湖，若要通過測量藍藻的數目來研究水華，培養基配方中則必須添加___________________（水、無機鹽、碳源、氮源）。【答案】（1）消毒滅菌酒精燈火焰（2）接種固體高壓蒸汽滅菌（3）3100（4）有無核膜為界限的（成形的）細胞核水、無機鹽、氮源【分析】濾膜法是檢測水樣中大腸細菌群的方法，將一定量水樣注入已滅菌的微孔薄膜的濾器中，經過抽濾，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼于伊紅美藍培養基上，經培養后計數和鑒定濾膜上生長的大腸菌群菌落即可推測計算出水樣中的大腸桿菌數；伊紅為酸性染料，美藍為堿性染料，大腸桿菌在伊紅-美藍培養基的菌落呈深紫色，并有金屬光澤。（1）過濾待測水樣需要用到濾杯、濾膜和濾瓶，其中需要對濾杯、濾膜和濾瓶進行消毒滅菌處理，與過濾有關的操作都要在酒精燈火焰旁進行，防止雜菌的污染。（2）將完成過濾之后的濾膜緊貼在EMB培養基上，這屬于微生物培養