葡甘聚糖酶高產菌株Q1發酵條件優化及酶的分離純化_王強（常用版）(可以直接使用，可編輯完整版資料，歡迎下載）

葡甘聚糖酶高產菌株Q1發酵條件優化及酶的分離純化_王強葡甘聚糖酶高產菌株Q1發酵條件優化及酶的分離純化_王強（常用版）(可以直接使用，可編輯完整版資料，歡迎下載）·86·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport葡甘聚糖酶高產菌株Q1發酵條件優化及酶的分離純化王2強1，，李22222旭3，張旭姣1，，張慶芳1，，竇少華1，，金連豆1，，遲乃玉1，*（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產力促進中心，遼寧大連116025）摘要：該研究以海洋來源的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Q1為出發菌株，通過單因素實驗對葡甘聚糖酶產生菌Q1發酵條件進行優化，并將菌株Q1發酵所得上清液經硫酸銨沉淀、透析、超濾離心和SephadexG-100凝膠過濾層析，得到電泳純的葡甘聚糖酶，并研究其部分酶學性質。結果表明，最佳發酵條件為魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏添加量為0.2%，蛋白胨添加量為0.4%、氯化鈉添加量0.4%、培養溫度26℃、轉速160r/min、接種量5%、初始pH7.0、裝液量100mL/250mL。在此條件下，葡甘聚糖酶酶活為241.61U/mL。葡甘聚糖酶相對分子質量為41.3ku；酶最適作用底物為葡甘聚糖。關鍵詞：葡甘聚糖酶；發酵條件；優化；分離純化中圖分類號：TQ925文章編號：0254-5071（2021）05-0086-06Optimizationoffermentationconditionsofhighglucomannanase-producingstrainQ1andseparationandpurificationoftheenzymeWANGQiang1,2,LIXu3,ZHANGXujiao1,2,ZHANGQingfang1,2,DOUShaohua1,2,JINLiandou1,2,CHINaiyu1,2*(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,DalianUniversity,Dalian116622,China;2.LiaoningTechnologyofMarineMicrobiologicalEngineeringResearchCenter,Dalian116622,China;3.DalianProductivityPromoteCenter,Dalian116025,China)Abstract：UsingBacillussubtilisQ1frommarineasoriginalstrain,thefermentationconditionsoftheglucomannanase-producingstrainQ1wereop-timizedbysinglefactorexperiments.Theglucomannanasefromthesupernatantliquorwaspurifiedusingammoniumsulfateprecipitation,dialysis,ultrafiltrationandgelfiltrationchromatogramofSephadexG-100,anditsenzymaticpropertieswereresearched.Theresultsshowedthattheoptimumfermentationconditionswereasfollows:konjakuflour0.75%,beefextract0.2%,peptone0.4%,sodiumchloride0.4%,culturetemperature26℃,rotatespeed160r/min,inoculum5%,initialpH7.0,liquidvolume100ml/250ml.Undertheconditions,theenzymeactivitywasupto241.61U/ml.Therelativemolecularmassoftheglucomannanasewasdeterminedtobe41.3ku.Theoptimumsubstrateoftheenzymewasglucomannan.Keywords：glucomannanase;fermentationconditions;optimization;separationandpurification葡甘聚糖酶（glucomannanase）是一種能將葡甘聚糖葡甘聚糖是魔芋的主要成分，降解為葡甘低聚糖的外泌酶。由甘露糖和葡萄糖單元按1.6∶1.0的摩爾比通過β-1,4-糖苷鍵相連的天然多糖高分子[1-2]。葡甘低聚糖是由葡萄糖和甘露糖組成的雜聚寡糖，最初從酵母的細胞壁中提取獲得[3]。生物酶法降解葡甘聚糖可通過兩種途徑：一種是采用微生物代謝產生的葡甘聚糖酶酶解；另一種是從魔芋塊莖中直接提取葡甘聚糖酶酶解。目前常采用的方法是微生物酶解葡甘聚糖，因為酶在微生物中普遍存在，具有極佳的催并且微生化活性，可顯著提高反應速度1×106～1×1010倍[4]，物具有分布廣、種類齊全、易于大量制取等特點[5]。目前國內外對于葡甘聚糖酶的研究仍處于起步階段，葡甘聚糖酶產量低，酶活不高[6]，對葡甘聚糖酶產生菌篩收稿日期：2021-02-23分離、鑒定及酶學性質研究得到的產葡甘聚糖酶微生物選、海洋葡甘聚糖酶的研究在國內鮮現。大多來源于土壤[7-10]，本研究從海泥和海水樣品中篩選出一株葡甘聚糖酶高產枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）Q1，以Q1為出發菌株，通過單因素實驗優化Q1產酶條件，粗酶液經硫酸銨鹽析、透析和超濾、SephadexG-100凝膠柱層析進行分離純化，并進行酶學性質的研究。目的是增加葡甘聚糖酶產量，提高酶催化效率，降低生產成本，為葡甘聚糖酶的工業化應用奠定基礎。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1菌種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）Q1：篩選自大連周邊基金項目：國家高技術研究發展計劃‘863計劃’項目（2007AA021306）作者簡介：王強（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物酶制劑研究。*通訊遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向為微生物酶制劑研究。研究報告中國釀造2021年第35卷第5期·總第291期87·海域的海泥、海水樣品，現由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。1.1.2培養基保藏培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，瓊pH7.0，121℃滅菌20min。脂2%，種子培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，pH7.0，121℃滅菌20min。發酵培養基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，魔芋粉0.5%，pH7.0，121℃滅菌20min。1.1.3主要試劑蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；魔芋粉：大連凱美化工工程配套；葡甘聚糖：合肥博美生物科技有限責任公司；其余試劑均為國產分析純。1.2儀器與設備LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；LTI-700恒溫培養箱：上海愛朗儀器；HZP-250全溫振蕩培養箱：上海精宏實驗設備；HD-1360超DYY-6C電泳凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造；儀：立德泰勀（上海）科學儀器；AL-204電子天平：梅特勒-托利多儀器；GelDocXR+凝膠成像系統：廣州市龍煜生物科技。1.3方法1.3.1培養方法菌株活化：將保存于4℃條件下的斜面菌株接種到保28℃培養24h，以備后續實驗使用。藏培養基中，種子液制備：將已經活化好的菌株接種到種子培養基中，28℃、150r/min振蕩培養24h，作為一級種子液；接種到種子培養基中，將一級種子液以5%接種量，28℃、150r/min振蕩培養24h，作為二級種子液。1.3.2甘露糖標準曲線的制作稱取100mg無水甘露糖（105℃干燥至恒質量），用適量蒸餾水將其溶解，并定容至100mL。取25mL具塞試管10支，分別加入質量濃度1mg/mL甘露糖溶液0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL，并加蒸餾水補足至1.0mL，加入3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）試劑[11]，混合均勻。100℃水浴顯色5min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20mL，于波長540nm處測定其吸光度值。以甘露糖質量濃度（x）為橫坐標，OD540nm值（y）為縱坐標繪制甘露糖標準曲線，線性回歸方程為y=0.5615x，R2=0.9991。1.3.3葡甘聚糖酶酶活測定方法[12]0.9mL0.4%葡甘聚糖底物中，加入適當稀釋的酶液0.1mL，30℃水浴10min，立即放入100℃水浴5min，終止反應，然后加入2.0mLDNS試劑，100℃顯色5min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20mL，于波長540nm處測定吸葡甘光度值，根據甘露糖標準曲線及酶活公式計算酶活。聚糖酶活定義：在上述反應條件下，葡甘聚糖底物每分鐘[13]釋放1μmol甘露糖的酶量為1個酶活單位（U）。相對酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比。1.3.4發酵條件優化（1）不同碳源對酶活的影響分別選用0.5%的不同碳源（魔芋粉、可溶性淀粉、蔗糖、瓜爾豆膠、比目糖、木聚糖），將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，28℃、150r/min振蕩培養55h后測定酶活，每次做3組平行實驗，下同。（2）魔芋粉添加量對酶活的影響以魔芋粉為碳源，改變培養基中魔芋粉添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%），將二級種子液以5%接種量，接種到28℃、150r/min振蕩培養55h后測定酶活。發酵培養基中，（3）不同氮源對酶活的影響以復合氮（牛肉膏+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨、氯化銨+蛋白胨、氯化銨+硝酸鈉）作為氮源，將二級種子液以5%接28℃、150r/min振蕩培養55h種量，接種到發酵培養基中，后測定酶活。（4）牛肉膏與蛋白胨配比對酶活的影響改變牛肉膏與蛋白胨配比（0.1%∶0.4%、0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%、0.2%∶0.4%、0.2%∶0.3%、0.3%∶0.3%、0.3%∶0.4%、0.1%∶0.1%），將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，28℃、150r/min振蕩培養55h后測定酶活。（5）氯化鈉添加量對酶活的影響氯化鈉添加量分別為（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，28℃、150r/min振蕩培養55h后測定酶活。（6）初始pH對酶活的影響初始pH分別設置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，28℃、150r/min振蕩培養55h后測定酶活。（7）培養溫度對酶活的影響26℃、28℃、30℃、32℃、37℃的恒溫搖床中，在24℃、將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，150r/min振蕩培養55h后測定酶活。（8）轉速對酶活的影響在不同轉速（130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min）恒溫搖床中，將二級種子液以5%接種量，接種到發酵培養基中，26℃振蕩培養55h后測定酶活。（9）裝液量對酶活的影響分別按不同裝液量（50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL、150mL/250mL、175mL/250mL）裝入發酵培養基，將二級種子液以5%接種量接種到發酵培養基中，26℃、160r/min振蕩培養55h后測定酶活。·88·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport（10）接種量對酶活的影響分別設置不同接種量（3%、4%、5%、6%、7%）的發酵26℃、160r/min振蕩培養55h后測定酶活。培養基，1.3.5酶的分離純化（1）粗酶液制備將菌株Q1二級種子液以5%接種量接種到裝液量為100mL/250mL的發酵培養基中，26℃、160r/min振蕩培養55h，發酵液經4℃、6000r/min離心20min，上清液即為粗酶液。（2）硫酸銨沉淀參照硫酸銨鹽析溶解度表，向粗酶液中加入硫酸銨固體，使硫酸銨飽和度分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%，置于4℃冰箱中過10000r/min離心20min，沉淀分別用1mL磷酸緩沖液夜，（pH6.0）進行溶解。取每個飽和度的上清和沉淀分別測定酶活，并繪制鹽析曲線。（3）透析和超濾將鹽析得到的樣品裝入預先處理好的透析袋（截留分子質量14000u）中，4℃條件下透析，期間更換透析液，直至透析液中檢測無SO42-為止；將完成透析的樣品轉移到10ku超濾管中，4℃、4000r/min離心10min，測定酶活。（4）SephadexG-100凝膠過濾層析將凝膠柱、蛋白檢測儀、自動收集器和電腦正確連接，保持蛋白檢測儀T值為100；待基線平衡以后，將超濾后的（Ф1.6cm×60cm）濃縮酶液2mL加入SephadexG-100凝膠柱中，使洗脫速度保持在0.3mL/min；調節自動收集器，使每個試管的收集時間為4min，根據顯示器上的洗脫峰，收集相應試管洗脫液，測定酶活。1.3.6部分酶學性質（1）最適作用底物在酶最適作用條件下，分別以0.4%的淀粉、葡甘聚糖、瓜爾豆膠、魔芋粉作為底物，測定酶活，每次做3組平行實驗。（2）相對分子質量確定（sodium通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）確定葡甘聚糖酶相對分子質量。電泳條件為：12%分離膠濃度，5%濃縮膠濃度，30mA恒流電泳2.5h，考馬斯亮藍R-250染色1h，乙醇醋酸脫色6h，期間需要更換脫色液，直至凝膠變透明，出現清晰的條帶。2結果與分析2.1發酵條件優化2.1.1不同碳源對酶活的影響由圖1可知，當用魔芋粉作為碳源時，葡甘聚糖酶相對酶活達到100%，瓜爾豆膠次之為69%，而以可溶性淀粉、蔗糖、木聚糖、比目糖作為碳源時，相對酶活幾乎為零。因此，故該菌產生的葡甘聚糖酶為一種魔芋粉特異性誘導酶[15]，選擇魔芋粉為最適碳源。圖1碳源種類對酶活的影響Fig.1Effectofcarbonsourcetypesonenzymeactivity2.1.2魔芋粉添加量對酶活的影響魔芋粉主要成分是葡甘聚糖，葡甘聚糖具有凝膠性，濃度過高，會導致葡甘聚糖成為凝膠小球，不利于菌株Q1利用，影響酶的合成，而魔芋粉濃度過低則不利于酶的大由圖2可知，當魔芋粉添加量為0.75%時，相對酶活量合成。達到100%；魔芋粉添加量為0.25%、0.50%、1.00%時，葡甘聚由于不同研究中使用的魔芋粉糖酶相對酶活均不足80%，黏度以及純度各不相同，且不同菌株利用魔芋粉的能力有差別[16-17]。因此，選擇魔芋粉最適添加量為0.75%。圖2魔芋粉添加量對酶活的影響Fig.2Effectofkonjakuflouradditiononenzymeactivity2.1.3復合氮源對酶活的影響本研究中適合菌株Q1產酶的氮源組合為復合氮源，實驗過程中牛肉膏與蛋白胨添加量分別為0.1%與0.3%，氯化銨與蛋酵母膏與蛋白胨的添加量分別為0.1%與0.3%，白胨的添加量分別為0.1%與0.3%，氯化銨與硝酸鈉的添加以牛肉膏與蛋白胨為量分別為0.1%與0.3%。由圖3可知，復合氮源時，葡甘聚糖酶相對酶活達到100%；酵母膏與蛋白胨為復合氮源時，相對酶活次之，為79%，氯化銨與蛋白胨作為復合氮源時，相對酶活最低，僅為67%。因此，選擇牛肉膏與蛋白胨復合氮源為最適氮源。研究報告中國釀造2021年第35卷第5期·總第291期89·由圖5可知，氯化鈉添加量在0.1%～0.4%時，葡甘聚糖酶相對酶活呈上升趨勢，氯化鈉添加量為0.4%時，相對酶活氯化鈉添加量＞0.4%時，相對酶活呈下降趨勢。達到100%，說明濃度過高或過低都不利于菌株產酶，適量氯化鈉對Q1產酶有促進作用。因此，氯化鈉最適添加量為0.4%。2.1.6初始pH對酶活的影響菌株生長需要適合的pH，產物合成也需要適宜的pH[19]。由圖6可知，初始pH值為7.0時，相對酶活達到100%；初始pH值為6.0時，Q1產酶相對酶活達到80%，pH5.0、pH8.0、圖3復合氮源種類對酶活的影響pH9.0時，相對酶活不高，均在60%左右，說明該菌具有一定的耐酸性。因此，菌株發酵最適初始pH值為7.0。Fig.3Effectofcompoundnitrogensourcetypesonenzymeactivity2.1.4牛肉膏與蛋白胨配比對酶活的影響由圖4可知，當牛肉膏與蛋白胨配比為0.2%∶0.4%時，葡甘聚糖酶相對酶活達到100%；當牛肉膏與蛋白胨配比0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%時，相對酶活均分別為0.1%∶0.4%、當牛肉膏與蛋白胨質量比分別為0.2%∶0.3%、不足60%；0.1%∶0.1%、0.3%∶0.4%、0.3%∶0.3%時，相對酶活也呈下降趨勢，說明氮源濃度過低不利于酶的大量合成，氮源濃度過高對菌體生長有一定抑制作用，影響酶的合成[18]。因此，當最適合菌體生長。牛肉膏與蛋白胨的配比為0.2%∶0.4%時，圖6初始pH對酶活的影響Fig.6EffectofinitialpHonenzymeactivity2.1.7培養溫度對酶活的影響由圖7可知，在26℃時，葡甘聚糖酶相對酶活為100%，此后，隨著溫度的升高，相對酶活越來越低，說明菌株Q1是低溫菌，高溫條件會影響其生長，進而影響其產酶。本實驗優化的培養溫度低于熊郃等[20-21]研究所得的培養溫度，可能是因為菌株Q1是從海洋樣品中篩選得來，海洋環境溫度較低。因此，最適培養溫度為26℃。圖4activity牛肉膏與蛋白胨質量比對酶活的影響Fig.4Effectofbeefextractandpeptonemassratioonenzyme2.1.5氯化鈉添加量對酶活的影響圖7培養溫度對酶活的影響Fig.7Effectofculturetemperatureonenzymeactivity2.1.8轉速對酶活的影響轉速主要調節發酵過程中的通氧量，轉速過低，通氣圖5氯化鈉添加量對酶活的影響量小，發酵液溶氧不夠，不利于菌體生長繁殖及酶的合成；轉速過快，會導致菌體自溶[22]。由圖8可知，轉速在130～Fig.5Effectofsodiumchlorideadditiononenzymeactivity·90·2021Vol.35No．5SerialNo．291ChinaBrewingResearchReport160r/min之間時，相對酶活逐漸增加；轉速為160r/min時，相對酶活達到100%；轉速＞160r/min時，相對酶活開始下最適轉速為160r/min。降。因此，由圖10可知，當接種量為3%～4%時，葡甘聚糖酶相對酶活較低，均不足60%；接種量為5%時，相對酶活達到100%，之后隨著接種量的增加，相對酶活反而下降，由于通氣量和營養物質等因素的限制，所以發酵液中的菌體數最適接種量為5%。量不宜過多。因此，2.2酶的分離純化2.2.1硫酸銨鹽析曲線從圖11可知，當硫酸銨的飽和度達到45%的時候，沉淀中開始測得葡甘聚糖酶酶活，而上清液中的葡甘聚糖酶酶活開始下降，當硫酸銨的飽和度達到75%的時候，上清液中幾乎沒有葡甘聚糖酶的活性，而沉淀中的葡甘聚糖酶酶活達到最高，因此可以確定硫酸銨分段鹽析沉淀葡甘聚圖8轉速對酶活的影響糖酶的范圍為45%～75%。Fig.8Effectofrotatespeedonenzymeactivity2.1.9裝液量對酶活的影響由圖9可知，裝液量為100mL/250mL時，葡甘聚糖酶相對酶活達到100%；裝液量為50～75mL/250mL時，相對酶活為70%左右，說明此時溶氧量相對適宜，對菌體產酶有較好的促進作用。裝液量為100～175mL/250mL時，酶活呈現下降趨勢，說明此時溶氧量較少，影響菌株產酶。因此，最適裝液量為100mL/250mL。圖11硫酸銨鹽析曲線Fig.11Curveofammoniumsulfatesalting-out2.2.2SephadexG-100凝膠過濾層析由圖12可知，超濾后的酶液經過SephadexG-100凝膠過濾層析，出現5個蛋白吸收峰，但經過酶活測定發現，僅在16#～34#管的收集液中有葡甘聚糖酶活性。將收集的葡甘聚糖酶液保存于4℃冰箱中，進行后續酶學性質的研究。圖9裝液量對酶活的影響Fig.9Effectofliquidvolumeonenzymeactivity2.1.10接種量對酶活的影響圖12SephadexG-100凝膠過濾層析Fig.12GelfiltrationchromatogramofSephadexG-1002.2.3酶部分性質圖10接種量對酶活的影響（1）酶最適作用底物魔芋粉和瓜爾豆膠的主要成分都是葡甘聚糖，但葡甘Fig.10Effectofinoculumonenzymeactivity研究報告中國釀造2021年第35卷第5期·總第291期91·聚糖含量不同，導致葡甘聚糖酶對其水解程度不同。由圖13可知，以葡甘聚糖作用底物時，葡甘聚糖酶相對酶活達到100%，魔芋粉次之為83%，可溶性淀粉作為底物時，相對酶活最低，僅為8%，故葡甘聚糖酶最適作用底物為葡甘聚糖。糖酶酶活為241.61U/mL。參考文獻：[1]RATCLIFFEI,WILLIAMSPA,VIEBKEC,etal.Physicochemicalcharacterizationofkonjacglucomannan[J].Biomacromolecules,2005,6(4):1977-1986.[2]鐘燕，索化夷.魔芋葡甘聚糖的功能及在食品領域的應用[J].中國彪.酵母細胞壁多糖對免疫功能的作用機制[J].釀造，2021，33（8）：6-9.[3]李春松，戴晉軍，李飼料研究，2021（2）：22-23.[4]STEWARTKK,EBELRE.Chemicalmeasurementsinbiologicalsys-tems[M].Beijing:Wiley-Interscience,2000:32-33.廣西大[5]董桂清.產葡甘聚糖酶菌株的篩選及酶的分離純化[D].南寧：學碩士論文，2007.楊三東，周大寨，等.發酵生產魔芋葡甘聚糖酶[J].中國生物[6]周海燕，圖13酶最適作用底物工程雜志，2005，25（3）：65-68.[7]曲麗娜.β-甘露聚糖酶的發酵優化和性質研究[D].濟南：齊魯工業大學碩士論文，2021.吳風，劉峰，等.乳白耙菌β-葡甘聚糖酶產酶條件優化[J].[8]鄔建國，食品工業科技，2021，37（7）：88-90.[9]王靜.β-甘露聚糖酶的制備與分離純化的研究[D].南京：南京林業磊，高成華，等.一株產甘露聚糖酶菌株的分離鑒定及大學碩士論文，2021.翟[10]廖婷婷，酶的純化與性質[J].微生物學報，2021，51（11）：1520-1526.李志波，徐君飛.產酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶[11]張居作，2021，33（11）：63-66.活性研究[J].中國釀造，[12]馮娜，趙君，趙敏.β-甘露聚糖酶產生菌DY-14的發酵條件及分離純化[J].黑龍江醫藥，2021（3）：397-401.[13]李江華，房俊，鄔顯章.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的搖瓶發酵條件[J].江蘇食品與發酵，2002，12（4）：16-18.湖南農業大學碩士論[14]陳思洋.發酵法生產魔芋葡甘聚糖酶[D].長沙：文，2021.[15]許劍，孫學哲，陳強，等.一株產常溫葡甘聚糖酶的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閻麗萍 高維平(化學工程系)究3欒國顏 閻麗萍 高維平(化學工程系)摘要介紹了一種從松節油中提蒎烯蒎烯的新型分離工藝并對工藝條件進行了優化研究確定了最佳工藝條件1關鍵詞松節油;分離;蒎烯;共沸蒸餾中國分類號 TQ02813引言0節油是世界上產量最大的一種天然精油,年產量約30萬噸,我國年產松節油約6噸,居世界第二位1松節油的主要成分蒎烯蒎烯,除此之外,還含有少量的莰烯苧烯雙戊烯松油烯等萜烯和倍半萜1,2蒎烯蒎烯是香料工業的重要原料,純度很高蒎烯價格不亞于黃金31國松節油主要用于生產油漆溶劑樟腦冰片選礦油等,從70年代起部分作香料的原料加以利用,但處理量小,尚有1萬噸的積壓1因此,充分利用我國豐富的松節油資源,開發更多的香料品種,是勢在必行的1松節油中分離提蒎烯蒎烯,國外使用的工業化方法是采用傳統的精餾法以設備技術先進的英國BA公司和美國的iden公司為例,均是采用一百多層理論板的高效精餾塔進行分離的,這樣高的塔必須配備電腦和高級自動化儀表控制,才能保證精餾過程的正常運行1這種傳統的精餾方法,存在設備復雜操作困難投資和管理費用大能耗大單位時間內的產量不高等缺點,不適合一些中小企業采用1國內目前采用的分離方法是理論板為55～67層的重復精餾3,4,該法存料利用率低,效果不理想1本研究開發一種新型分離工藝,利用理論板數僅為24～30(精餾柱為08m長三角料柱)層的間歇精餾塔,分兩步的簡便分離過程,即可提取純度較高的蒎烯蒎烯實驗還對工藝條件進行了優化研究1該分離工藝不僅目的產品質量好,分離要求的條件也極易滿足,很適合一些小廠生產1收稿日期:19971007第一作者:男,1964年生研究生講師3參加實驗工作的還有93級畢業生周廣喜恭孝梅金英虎—11 —實驗部分11.1 實驗原理及工藝過程統的蒸餾是以溶液中各組分的揮發度不同作為分離的依據,之所以分離松節油困難實驗部分11.1 實驗原理及工藝過程統的蒸餾是以溶液中各組分的揮發度不同作為分離的依據,之所以分離松節油困難,是因蒎烯蒎烯屬同分異構體,沸點差小,揮發度接近,利用普通精餾法很難以較小的理論板數使之分開1本工藝采用特殊的精餾方式,即添加第三組分,使之與原組分形成恒沸物的共沸精餾法,人為地進非理想化處理,使該體系的汽液平衡時的汽液熱力學曲面間距擴大,達到有利分離的目的1實驗用松節油為某廠生產中的副產物,含雜質成分較多酸性較強1本實驗根據原料特點采用雙塔工藝11.1.1 初餾先對原料松節油進行初餾1主要除去蒎烯更重的組分,從塔頂獲蒎烯和蒎烯的混合物1為了提高拔出率及減少高溫蒸餾造成的副產物增加,初餾過程采用了減壓操作11.1.2 共沸精餾餾獲得蒎烯蒎烯的混合物作為共沸塔的原料,按一定比例添加第三組分NL1同樣,采用減壓蒸餾1從塔頂獲蒎烯的恒沸物;塔底獲蒎烯的恒沸物1然后經分層水洗等處理即可得到產蒎烯蒎烯11.2 實驗儀器和材料11D1型接觸調壓器21東風牌DM型連續可調控溫電熱套31C501型超級恒溫器41J型阿貝折光儀51SHC循環水多用真空泵61夾套式填料精餾塔(自制)7101型干燥箱817氣相色譜儀1.3 實驗裝置實驗裝置見圖111.4 實驗步驟1.4.1 松節油初餾91臺式自動平衡記錄儀101DMB色譜數據處理機111其它儀器溫度計:200℃,300℃四口燒瓶:1000L量筒:100L分液漏斗:250L燒杯:800L,600L,400L,200L(1)(2)(3)(4)(5)按圖1的裝置圖組裝儀器1加料1用燒杯量取約600L松節油加入四口燒瓶,放幾粒沸石,旋緊塞子1加熱1打開電源開關,調節電熱套及調壓器電壓,控制釜溫及加熱套溫度1抽真空1打開循環水式多用真空泵,通過放空閥調節真空度1塔頂出現蒸汽時,通冷凝水,并根據蒸汽量控制水流大小1—12 —(6)全回流一段時間,待穩定后,通過回流量調節,控制塔頂溫度85～130℃,從塔頂采蒎烯蒎烯的混合物,同時取樣用色譜或折光儀分析其純度17)當塔頂蒸汽量很少時,可以停止實驗1(8)將電熱套及調壓器電壓調至零伏,關掉電源(6)全回流一段時間,待穩定后,通過回流量調節,控制塔頂溫度85～130℃,從塔頂采蒎烯蒎烯的混合物,同時取樣用色譜或折光儀分析其純度17)當塔頂蒸汽量很少時,可以停止實驗1(8)將電熱套及調壓器電壓調至零伏,關掉電源,停真空泵和冷凝水1(9)抽取釜液,取樣分析11.4.2共沸精餾(1)加料1用燒杯量取約400L初餾液,按油劑比=5～12:1的比例加入NL,投入幾粒沸石,旋緊塞子1(2)熱1關電熱套及壓度11.套;2.瓶;3.柱;4.管;5.器;6.器;7.計;8.器圖1實驗裝置圖(3)抽真空1開真空泵檢查是否漏氣,通過放空閥調節真空度1(4)塔頂出現蒸汽時,通冷凝水,并根據蒸汽量控制水流大小1(5)全回流一段時間,待塔穩定后,通過回流量調節,控制塔頂溫度100～114始采出;餾出液用分液漏斗靜止分層,并取樣分析;回收NL備循環使用1(6)當塔頂蒸汽很少時,可以停止實驗1(7)將電熱套及調壓器電壓調至零伏,關掉電源,停真空泵和冷凝水1(8)抽取釜液,用分液漏斗靜止分層并取樣分析11.4.3 工藝條件的優化針對不同的真空度油劑比進行了最佳工藝條件篩選實驗1℃,開實驗結果與討論22.1 實驗結果實驗結果見表1～表6,圖2～圖41表1實驗松節油中各組分含量(重量)表3初餾餾出液中組分含量(重量)蒎烯蒎烯號3蒎烯蒎烯序號重組分序142.8537.4619.69173.02726.9723號1廠表2松節油的折光率測定樣品標號折光率1折光率2折光率3平均值相對誤差1相對誤差2相對誤差311.49941.49951.49921.499400.0067-0.0133—13 —圖2原料液氣相色譜圖圖3初餾餾出液氣相色譜圖表4不同操作條件共沸精餾氣相色譜分析結果真空度(Ma)原料配比(油劑比)餾出液蒎烯餾出液蒎烯釜液蒎烯釜液蒎烯序號123456780.0850.0910.0800.0660.0980.0510.0800.0808:18:110:19:18:圖2原料液氣相色譜圖圖3初餾餾出液氣相色譜圖表4不同操作條件共沸精餾氣相色譜分析結果真空度(Ma)原料配比(油劑比)餾出液蒎烯餾出液蒎烯釜液蒎烯釜液蒎烯序號123456780.0850.0910.0800.0660.0980.0510.0800.0808:18:110:19:18:18:16:110:188.08