mek抑制劑曲美替尼在v-ki-ras2kirsen大鼠結直腸癌細胞中耐藥機制的研究

人類1.3的癌癥與ras變異有關。1材料和方法1.1細胞培養和給藥K-RAS基因突變型CRC細胞株LS174T(G12D）、DLD-1(G13D）、HCT116(G13D）均購自上海細胞庫。MEK抑制劑Trametinib(M8697-10UG）、JAK2/STAT3抑制劑魯索替尼（Ruxolitinib,SAB4300123）或LY5(GW21465）均購自美國Sigma-Aldrich公司，臨用前使用RPMI1640培養液稀釋到終濃度。RPMI1640培養基（61870044）、胎牛血清（FBS,12662011）均購自美國GibcoBRL公司；p-STAT3(Y70562214）、STAT3(KHO0481）、p-ERK1/2(KHO058）、GAPDH抗體（EPR16891）均購自美國CellSignaling公司。DMSO(DZ0231）購自AMRESCO公司。1.2基因的培養和代代相傳將LS174T、DLD-1、HCT116細胞株置于含10%FBS的RPMI1640培養液中，在5%CO1.3細胞蛋白分析采用Westernblot法。用Trametinib(1、5、10μM濃度）處理LS174T、DLD-1、HCT116細胞，檢測其STAT3上游蛋白JAK2、JAK3、Src等是否激活。預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞3遍，蛋白裂解液提取細胞核和細胞質蛋白；然后進行蛋白濃度測定，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質樣品，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，電泳。免疫反應：封閉，孵育一抗，洗滌，孵育二抗，洗滌；應用化學發光成像系統對信號進行評價。實驗重復3次。1.4hct116細胞p-stat3采用Westernblot法。分別用Trametinib(5μM）、Ruxolitinib(2.5μM）/LY5(1μM）或Trametinib(5μM)+Ruxolitinib(2.5μM）/LY5(1μM）處理HCT116細胞24h，檢測其p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表達。實驗步驟同1.3，重復3次。1.5hct116細胞的生長采用磺酰羅丹明B蛋白染色實驗。分別用Trametinib(5μM）、LY5(1μM）或Trametinib(5μM)+LY5(1μM）處理HCT116細胞24h，去上清液，按細胞密度1000個/孔接種于60mm孔盤中，再用新鮮的培養基培養2周。10%冷的三氯乙酸固定細胞，4℃放置1h，反復用蒸餾水洗，待自然干燥。每孔加入冰醋酸配制的磺酰羅丹明B溶液100μl，室溫下染色15min，流水緩慢洗去染液，空氣下自然干燥。在100倍顯微鏡下觀察。以DMSO為參照，計算細胞增殖率。實驗重復3次。1.6hct1106和ld-1的細胞移動率采用細胞遷移劃痕實驗。先用記號筆在6孔板上均勻地劃橫線，然后按細胞密度1×101.7hct116、dld-1細胞生存率檢測采用MTT實驗。分別用Trametinib(1或5μM）、LY5(0.5或1μM）、Trametinib(1或5μM)+LY5(0.5或1μM）處理HCT-116、DLD-1細胞；無藥物處理、常規培養的HCT-116、DLD-1細胞作為陰性對照。在37°C、5%CO1.8統計處理應用SPSS19.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2結果2.1traminib對k-ras突變crc細胞中stat3的激活作用在HCT116、LS174T和DLD-1細胞中，Trametinib可明顯抑制ERK1/2的磷酸化，同時誘導p-STAT32.2hct1106細胞的p-stat3在HCT116細胞中，Trametinib+Ruxolitinib/LY5可同時阻斷p-STAT32.3各組細胞增殖率比較Trametinib、LY5、Trametinib+LY5組細胞增殖率分別為62.11%、31.30%和9.95%，差異有統計學意義（P<0.05），其中Trametinib+LY5組明顯低于單藥組（均P<0.05），見圖3。2.4胞遷移率比較在HCT116細胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5組細胞遷移率分別為69.8%、52.8%、7.2%，差異有統計學意義（P<0.05）；在DLD-1細胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5組細胞遷移率分別為66.0%、62.0%、4.0%，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。2.5各組細胞生存率比較在HCT116、DLD-1細胞中，Trametinib+LY5組細胞生存率明顯低于單藥組，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表1～2。3k-ras基因突變型crc治療crc的臨床研究到目前為止，化療和靶向藥物治療是晚期CRC的主要治療方法。靶向治療CRC的EGFR單克隆抗體主要為帕尼單抗、西妥昔單抗，與內源性配體競爭性抑制EGFR轉導，從而發揮抗腫瘤作用。有研究證明EGFR單克隆抗體對K-RAS基因突變型CRC患者無效K-RAS抑制劑作用于RAS/Raf/MEK/ERK細胞信號傳導通路上游基因，其成功開發進一步促進了對K-RAS基因突變的CRC治療研究。30多年來，科學家們認識到RAS編碼蛋白的基因突變是最強大的癌癥驅動因素之一鑒于MEK抑制劑Trametinib在臨床治療轉移性黑色素瘤和不能手術治療的黑色素瘤患者的優勢，科學家提出采用K-RAS下游ME