臨床PCR檢驗標本的采集、處理、保存及核酸提取方法

江西省腫瘤醫院陳文學檢驗誤差的發生率1997年，一位意大利著名檢驗專家對急診檢驗誤差發生的種類和發生率進行了統計。結果顯示，約有68.2%的檢驗誤差發生在檢驗前期，而來自檢驗中期和檢驗后期的誤差率分別為13.3%和18.5%。2007年，這位專家又進行了類似的統計，結果顯示，檢驗前期的誤差發生率仍高達61.9%正確采集、運送、保存臨床標本

的重要性質量保證關鍵性環節解決涉及實驗室檢驗的醫患糾紛的方法之一核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關鍵的部分核酸提取的成敗關系到臨床PCR檢驗的正確與否臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環節標本采集標本采集時間對擴增檢測結果的影響（過早或過晚都可能會出現假陰性結果）

標本采集部位的準備（適度消毒）

標本的類型和采集量（衣原體上皮細胞）采樣質量的評價（評價方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學分析）

采樣及運輸容器（一次性無菌器材,防腐劑,抗凝劑）

標本采集中的防污染（一次性無菌容器，防止混入操作者頭發，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌）

標本運送

樣本一經采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。樣本中如加入了適當的穩定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。實驗室應根據待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應的規定。臨床標本的處理和保存血清（漿）全血外周血單個核細胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織血清（漿）DNA測定，可按照一般的血清標本處理程序，對測定影響不大。RNA測定，標本的獲取和保存方式對測定結果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴禁使用肝素，因其對PCR擴增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除)全血標本，抗凝后6小時內分離血漿，如使用血清標本，則需盡快(2小時內)分離血清，標本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，較長期保存應在-70℃下。全血以全血作為待測標本時,必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測,可4℃下短期保存,如用于RNA檢測，則應在取血后，盡快提取RNA。外周血單個核細胞

外周血單個核細胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細胞分離液分離制備；二是使用紅細胞裂解液,裂解全血中的紅細胞,經生理鹽水數次洗滌,即可得到單個核細胞。外周血單個核細胞如暫不提取核酸,可保存于-70℃下.痰痰屬于分泌物,臨床上常用作為結核桿菌DNA測定標本。痰標本中含有大量粘蛋白和雜質,故在核酸提取時,需對樣本進行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化標本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下。痰標本處理的基本模式通用模式簡單模式痰標本處理通用模式（1）通用標本處理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：4-6mol/L鹽酸胍（GuHCl）50mmol/LTris-HCl,pH7.525mmol/LEDTA0.5%十二烷基肌酸鈉（Sarkosyl

）0.1~0.2mol/Lβ-巰基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)一定體積的痰1.5倍體積的USP溶液,震蕩30-40s10-15ml蒸餾水，室溫放置5-10min5000g室溫離心10-15min，棄上清500ul無菌0.05%Tween80溶解或重懸20000g室溫離心10-15min，棄上清加入5倍10%chelex-100，混勻，90℃溫育40min20000g室溫離心5min取5ul用于PCR擴增痰標本處理簡單模式

試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1mol/LNaOH、50μg蛋白酶K和0.05%TritonX-10050ul痰6000g離心10分鐘，棄上清加入裂解液50ul，60℃溫育30min90℃溫育30min加入Tris-HCl中和以上反應混合物取5ul用于PCR檢測痰標本處理中要注意的問題痰標本在沒有加入內標以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采用這種方法提取，有可能會在提取過程中，出現一種可修飾DNA的酶，在最后一步提取中，與核酸一起洗提出來，從而抑制其后的擴增。在PCR主反應混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此類抑制物產生的效果。棉拭子在使用PCR方法檢測性病病原體時,臨床標本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置5～10分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,則需保存于-70℃下.膿液膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結核桿菌)核酸測定的標本,粘稠的膿液可采用痰標本的處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗2～3次后,即可用于DNA提取。對于用于非分枝桿菌測定的膿液標本,如過于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標本的保存條件同樣為-70℃。體液臨床體液標本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。乳汁

乳汁有時也可作為標本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測。

乳汁中分枝桿菌DNA的提取試劑準備①裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,2%TritonX-100,4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）,0.3mol/L醋酸鈉。②玻璃珠：（直徑：425-600um）乳汁標本離心6000rpm，5min，棄上清脂質和沉淀用750ul裂解液重懸重懸液移入含100mg玻璃珠離心管攪拌煮沸5min，離心14000rpm，3min650ul上清轉移到另一離心管中，等體積異丙醇沉淀70%乙醇洗滌沉淀，干燥50ulTris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR擴增組織

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加入適量的生理鹽水,然后,邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標本室溫下可保存數日,4℃可保存6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進行DNA提取。臨床標本的濾紙上保存臨床標本置于經過處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保存數月至數年，如靶核酸為RNA，則可穩定數周。保存在濾紙上的標本，保存時間長，還可因為標本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面的擴增檢測造成影響。不管是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。臨床標本中PCR反應抑制物內源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產物、白細胞內的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

外源性的:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標本容器或采樣器材上含有的抑制物。肝素的作用機理

肝素對MLV逆轉錄酶和TAQDNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標本中的肝素可結合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對標本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。肝素的作用機理每μg核酸標本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。在標本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃2小時)可去除肝素的抑制作用。血紅蛋白、乳鐵蛋白血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細胞和白細胞內的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關。研究鐵的抑制效應時，發現其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性IgG

IgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用使用煮沸作為標本處理方法或使用PCR前的熱啟動,將增強IgG對PCR反應的抑制去除或減輕抑制的一些方法NaOH處理可中和臨床標本中的TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標本，因為NaOH處理可使DNA大量丟失。去除或減輕抑制的一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對TaqDNA聚合酶的抑制效應，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加TaqDNA聚合酶的擴增能力，使其對糞便和肉類標本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。單鏈DNA結合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA的增強效應。核酸純化核酸分離純化技術起源于二十世紀五十年代，在七十年代和八十年代中傳統的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應用和推廣。傳統的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理靶核酸可以與宿主細胞整合，核內游離及胞漿內各種構形存在于細胞內，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內，如果上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結合于核酸的蛋白質，從而將靶核酸從細胞內釋放出來。核酸的分離純化

核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質去除。經典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。DNA提取的經典方法即所謂的”酚-氯仿提取法”

RNA提取的獨特性臨床標本及實驗室環境中,存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。如何避免RNase對標本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關鍵之所在。

RNA提取所用器皿的處理經高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無RNase,可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA.實驗室用的普通玻璃器皿經常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。RNA提取所用溶液的準備

對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。可能的話,溶液均應用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意的是,DEPC可與胺類迅速發生化學反應,因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液。RNA提取中RNase污染的控制實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：在準備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應戴一次性手套。在RNA提取實驗中，應勤換手套。RNA提取的常用方法

表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。異硫氰酸胍結合氯仿-酚提取法

核酸提取的改良方法

旋轉離心柱