營養缺陷型菌株的篩選實驗七營養缺陷型菌株的篩選實驗七營養缺陷型等基本概念與營養缺陷突變有關的三類遺傳型個體：野生型：指從自然界分離到的任何微生物在其發生人為營養缺陷突變前的原始菌株。遺傳型表示法是[A+B+]

營養缺陷型：野生型菌株經誘變處理后，由于發生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產物的培養基中才能生長。

A營養缺陷型用[A-B+]表示，B營養缺陷型用[A+B-]表示原養型：一般指營養缺陷型突變經回復突變或重組后產生的菌株，其營養要求在表型上與野生型相同。遺傳型均用[A+B+]表示營養缺陷型等基本概念與營養缺陷突變有關的三類遺傳型個體：與營養要求有關的3種遺傳型關系與營養要求有關的3種遺傳型關系培養基的基本概念

（按營養需求成分分）與篩選營養缺陷型突變株有關的三類培養基：

基本培養基（MM）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養基。——不同菌株的要求不同，此試驗要先確定，非常重要。完全培養基（CM）：凡可滿足一切營養缺陷型菌株營養需要的天然或半組合培養基。補充培養基：凡只能滿足相應的營養缺陷突變株生長需要的組合或半組合培養基。培養基的基本概念

（按營養需求成分分）與篩選營養缺陷型突變株營養缺陷型的用途營養缺陷型在生產上和科學研究上用途很大，主要有兩方面應用：1、是作為研究代謝途徑和遺傳規律及育種技術不可少的標記菌種；2、可直接用于生產氨基酸、核苷酸等代謝產物——目的在于切斷某些代謝途徑以積累中間代謝產生或切斷一條代謝途徑而積累另一分支途徑的末端產生。——解除代謝途徑中的反饋抑制和阻遏。營養缺陷型的用途營養缺陷型在生產上和科學研究上用途很大，目的要求1、了解應用物理、化學因素對細菌進行誘變的方法。2、初步掌握誘變產生營養缺陷型菌株的篩選與鑒定的方法技術。體會其相應的科學理念。目的要求1、了解應用物理、化學因素對細菌進行誘變的方法。實驗原理

——誘變及誘變劑說明利用化學、物理等誘變手段誘發突變是遺傳學研究和育種工作的常用手段。主要有DNA堿基化學性質改變引起置換、插入移碼、大片段畸變、堿基二聚體形成等。最終引起遺傳信息在復制中的改變。本次實驗利用紫外線進行誘變處理（主要是形成嘧啶二聚體，引起后續DNA復制錯誤，達到誘變的目的）。誘變后需要暗培養（防止光復活作用）。紫外線劑的控制——紫外燈的功率、照射距離、照射時間。——（需要前期試驗確定，殺菌率在70%左右）實驗原理

——誘變及誘變劑說明利用化學、物理等誘變手段誘發突實驗原理

——營養缺陷型的培養生長情況營養缺陷型在完全培養基（CM）上生長良好，而在基本培養基（MM）上則不生長；未發生突變的野生型在兩種培養基上都能生長。——篩選的理論依據實驗原理

——營養缺陷型的培養生長情況營養缺陷型在完全培養基實驗原理

——營養缺陷型篩選的四個環節第一步：誘變劑處理第二步：淘汰野生型，濃縮缺陷型——基本培養基（使營養缺陷型由少數變為多數）

抗生素法：青霉素適用于細菌；制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法：適用于絲狀生長的真菌和放線菌高溫殺菌法：利用芽孢和營養體對熱敏感性的差異。第三步：檢出缺陷型第四步：鑒定營養缺陷型（此步因時間關系不再進行）實驗原理

——營養缺陷型篩選的四個環節第一步：誘變劑處理實驗材料菌種：大腸桿菌實驗培養基：肉湯液體培養基（CM）；肉湯固體培養基（CMA）；2倍肉湯液體培養基（2×CM）；基本液體培養基（MM）；基本固體培養基（MMA）；無N基本液體培養基（無N）；2倍含N基本液體培養基（2×N）實驗試劑：生理鹽水；青霉素鈉實驗器材：10mL帶蓋離心管、10mL吸管、90mm培養皿、15×150mm試管（帶硅膠塞）、1mL刻度吸管（或微量加樣槍和吸頭）實驗材料菌種：大腸桿菌實驗步驟1、菌種培養收集洗滌2、誘變劑處理3、淘汰野生型，濃縮缺陷型——基本培養基

抗生素法：青霉素適用于細菌；制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法：適用于絲狀生長的真菌和放線菌4、檢出缺陷型——夾層培養法5、鑒定營養缺陷型（此步驟因時間關系不再進行）——下學期《微生物學實驗》中有相關內容學習實驗步驟1、菌種培養收集洗滌1、菌種培養收集洗滌

（第一天）大腸桿菌接種于肉湯液體培養基，37℃靜止培養18~24小時（老師處理）。無菌取10mL培養液放入無菌15mL離心管中，3500轉/分鐘離心10分鐘，棄上清液，留下菌體沉淀。在上述沉淀中加入5mL無菌生理鹽水，懸浮沉淀（均勻），備用。1、菌種培養收集洗滌

（第一天）大腸桿菌接種于肉湯液體培養基2、誘變劑處理（第一天）吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL，放至60mm培養皿中，搖晃成薄層。將上述培養皿（連蓋）放在40W的紫外燈下，距離30厘米（處理前先開紫外燈穩定30分鐘），滅菌1分鐘，然后開蓋處理5分鐘。照射完畢后，先蓋上皿蓋，再關紫外燈。吸取3毫升2倍肉湯培養液到上述處理后的培養皿中。置于37℃恒溫培養箱內，避光培養12小時以上。——誘變后DNA復制形成純合子過程。注意紫外線防護（不要長時間暴露在其下）。2、誘變劑處理（第一天）吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL，放3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第二天）（1）吸5毫升紫外線處理過并重新培養的菌液，放入已滅菌的15mL離心管，3500轉/分離心10分鐘。（2）倒去上清液，加入5mL生理鹽水，打散混勻沉淀，如此重復離心洗滌三次，加生理鹽水到原體積（5mL）。（3）吸取經離心洗滌的菌液0.1毫升于5毫升無N基本培養液，37℃培養12~24小時。——缺營養情況下休眠菌體（饑餓處理）。3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第二天）（1）吸5毫升紫外線處3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第三天）（4）培養24小時后，按1∶1加入2N基本培養液5毫升（含青霉素鈉鹽2000單位/毫升），使青霉素鈉在菌液中的最終濃度約為1000單位/毫升，再放入37℃溫箱中培養。——利用青霉素只作用于生長的細胞，殺死在基本培養基中生長的野生型，留下休眠不生長的缺陷型。（5）培養24小時后，3500轉/分離心10分鐘，用基本液體培養基重復離心洗滌三次，懸浮于5mL基本培養液，備用。——去除青霉素鈉（第四天內容）3、淘汰野生型，濃縮缺陷型

（第三天）（4）培養24小時后，4、檢出缺陷型——夾層培養法

（第四天）取1無菌培養皿，倒入5mL滅菌溶化后基本固體培養基（MMA），鋪滿鋪平培養皿皿底，凝固后形成底層。——第一層取上一步驟處理好后的菌懸液0.1mL加入到5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養基（MMA）中（試管），快速搓動混勻后（快速），倒入上述有底層的培養皿中，鋪滿鋪平，冷卻凝固。——第二層冷卻凝固后，再倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養基（MMA），鋪滿鋪平，冷卻凝固。——第三層放入37℃恒溫培養箱中，培養48小時。4、檢出缺陷型——夾層培養法

（第四天）取1無菌培養皿，倒入培養好后，仔細觀察培養皿，標記已生長出的菌落。標記好后，倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃肉湯固體培養基（CMA），鋪滿鋪平，冷卻凝固。——第四層——第六天內容放入37℃恒溫培養箱中，培養48小時。——第八天內容再次仔細觀察培養好培養皿，前后對照標記，找出新生長出的菌落，此菌落可能是缺陷型菌落。如有新生長出的菌落，用無菌牙簽（接種針），挑取菌落，分別點接于含基本固體培養基（MMA）和肉湯固體培養基（CMA）培養皿上，放入37℃恒溫培養箱中，培養48小時。觀察，如果在基本固體培養基（MMA）無生長，而肉湯固體培養基（CMA）生長，則得到營養缺陷型菌株，保藏進行鑒定營養缺陷型。反之失敗。培養好后，仔細觀察培養皿，標記已生長出的菌落。夾層培養法及其結果示意圖夾層培養法及其結果示意圖5、鑒定營養缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養物而不能生長。生長譜法：在混有供試菌（待鑒定菌）的平板表面點加相應微量營養物，視某營養物的周圍有否長菌（微型菌落圈）來確定該供試菌的營養要求的一種快速、直觀的方法。下學期《微生物學實驗》再具體詳細介紹。5、鑒定營養缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養附：檢出營養缺陷型的方法介紹夾層培養法——四層培養基（三基本一完全）限量補充培養法——微量富（限）營養物逐個檢出法——滅菌接種針或牙簽，分別接種于基本培養基和完全培養基影印平板法——分別轉印于基本培養基和完全培養基上附：檢出營養缺陷型的方法介紹夾層培養法——四層培養基（三基本夾層培養法及其結果夾層培養法及其結果夾層培養法先在培養皿上倒一層MM瓊脂培養基，凝固后倒上一層含菌的MM瓊脂培養基，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養基，培養24hr，將出現的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養基，再培養。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。缺點：結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。夾層培養法先在培養皿上倒一層MM瓊脂培養基，凝固后倒上一層含限量補充培養法

——營養不同，生長差異該法有兩種情況：（1）目的是檢出營養缺陷型（廣泛）將富集培養后的細胞接種到含有0.01%蛋白胨的MM固體培養基上培養，野生型迅速長成大菌落，而生長緩慢的小菌落可能是營養缺陷型。（2）目的是定向篩選某種特定的缺陷型（特定）在基本培養基中加入某種單一（微量）的氨基酸、維生素或堿基等物質。限量補充培養法

——營養不同，生長差異該法有兩種情況：逐個檢出法（點接）用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種（先MM后CM，操作時要避免帶入CM培養基成分），依次在相應位置點種，然后一起培養，觀察其生長情況。此法結果明確，但工作量大。CMMM逐個檢出法（點接）用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落影印平板法（1）將一較培養皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。（2）完全培養基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。（3）將基本培養基平皿和完全培養基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。（4）將CM和MM在恒溫培養箱中培養。（5）二平皿相同