血紅蛋白提取綿陽中學2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素2.血紅蛋白由________和__________構成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結合的__________基團

故，本課題可選用豬、牛等其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白!∴血紅蛋白呈紅色！一、基礎知識(一)蛋白質提取與分離的依據---根據蛋白質各種特性的差異：1.分子的形狀、大小2.電荷性質和多少3.溶解度4.吸附性質5.對其他分子的親和力凝膠色譜法

凝膠電泳法

(二)蛋白質提取與分離的方法:（1）原理：（2）材料：凝膠大分子通過多孔凝膠顆粒的____,路程__,移動__小分子穿過多孔凝膠顆粒的____,路程__,移動__1、凝膠色譜法(分配色譜法)間隙內部短長快慢根據相對分子質量的大小分離蛋白質凝膠：微小的多孔球體，內部有許多貫穿的通道。化學本質多為：多糖類化合物，如：葡聚糖或瓊脂糖。混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。凝膠色譜柱（層析柱）（3）凝膠色譜法分離過程

凝膠色譜法分離蛋白質過程的動畫演示:演示結束如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等－－洗脫液抵制外界酸和堿對溶液pH的影響，在一定范圍內保持pH穩定。（4）緩沖溶液◆作用：◆配制：通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成(2)電泳的原理：2、凝膠電泳法(1)電泳的概念注：帶電粒子向著_________________的電極移動。與其所帶電荷相反帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程利用待分離樣品中各分子帶電性質的差異，分子本身的大小和形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現各種分子的分離注：影響蛋白質分子運動速度的因素：

決定運動方向電場作用力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√√思考：蛋白質為什么帶有電荷？許多生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電電泳原理示意圖-----教材P66∴該電泳蛋白質遷移速率僅取決于分子大小（3）常用電泳方法瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳◆測定蛋白質分子量常用：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳注：

SDS的作用:消除凈電荷對遷移率的影響SDS能使蛋白質完全變性，解聚成單條肽鏈。形成“蛋白質－SDS復合物”，掩蓋了蛋白質間的電荷差別。且分子質量越大，電泳遷移速率越慢！課堂反饋1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質2．凝膠色譜法是根據（）分離蛋白質的有效方法。

A、分子的大小B、相對分子質量的大小

C、帶電荷的多少D、溶解度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動。

A、相同B、相反C、隨機BB4、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是（）A、相對分子質量較小的蛋白質行程較大B、相對分子質量較小的蛋白質行程較小C、行程與蛋白質的相對分子質量大小無關D、二者根本無法比較課題3血紅蛋白的提取和分離第二課時四川省綿陽中學鄧志華回憶復習------血液組成成分知識填空----血液組成成分：血液由______和_______兩部分組成。1.血細胞中____細胞數量最多，紅細胞中含量最多的有機化合物是_________________2.血紅蛋白由__________和________________構成的，其中每條肽鏈中都含有一個能與O2或CO2結合的___________基團，因其含有________而呈紅色。血漿血細胞紅血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

血紅素亞鐵血紅素

本課題可選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的紅細胞來分離血紅蛋白選材:思考：為什么以哺乳動物的紅細胞為材料？無細胞核，無細胞器等結構，血紅蛋白含量豐富，便于提取。二.實驗操作(1)紅細胞的洗滌(2)血紅蛋白的釋放(3)分離血紅蛋白溶液樣品處理粗分離純化純度鑒定透析除去分子較小的雜質通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度（1）紅細胞的洗滌血液100mL低速短時間離心紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min步驟1、樣品處理閱讀教材P67思考：洗滌的目的是什么？用什么水洗滌？洗滌干凈的標志是什么？重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色？3g檸檬酸鈉注意：紅細胞洗滌采用低速短時間離心！∵速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果！◆洗滌的目的------除去血漿蛋白等◆用什么水洗滌？-----0.9%的生理鹽水◆洗滌干凈的標志-----上清液沒有黃色答案：初次離心后的結果：步驟1“樣品處理”---(2)血紅蛋白的釋放1.用什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？2.采取了什么措施加速釋放過程？分析：①蒸餾水的作用是__________________________。②加入甲苯的作用是________________________。③充分攪拌的目的是________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞破裂閱讀教材P67思考：參觀-----磁力攪拌器步驟1“樣品處理”---(3)分離血紅蛋白溶液分離過程:紅細胞混合液高速離心10min如何除去小分子脂類物質？？過濾濾紙脂類物質血紅蛋白----過濾！收集濾液于分液漏斗得到下層紅色液體！透析袋步驟2、粗分離（即透析）20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL思考回答：透析的原理及目的分別是什么？透析的原理----半透膜的半透性(教材P67)透析目的----除去分子量較小的雜質！實際操作的透析袋（粗分離）透析過程動畫演示：演示結束步驟3、純化----凝膠色譜操作教材P68圖5－19（1）凝膠色譜柱的制作：（2）凝膠色譜柱的裝填：（3）樣品的加入和洗脫：

（1）凝膠色譜柱的制作：(見教材P67)①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好插入玻璃管的一端注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成整體如圖：裝配好的凝膠柱返回材料：交聯葡聚糖凝膠(G-75)（2）凝膠色譜柱的裝填：（見教材P68）步驟操作要求①②③④⑤50㎝操作壓，磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡打開下端，一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱閱讀教材P68回答：“G”表示？“75”表示？注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不能有氣泡存在返回（3）樣品加入與洗脫(見教材P68—P69)

加樣前：調節緩沖液面與凝膠面平齊注意：正確的加樣操作：1.不要觸及并破壞凝膠面2.貼壁加樣3.吸管管口沿管壁環繞移動注意：1、洗脫液面不能低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，攪亂洗脫次序，降低分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。

加樣后：樣品滲入凝膠床→洗脫→收集色譜柱制作成功的標準：紅色區帶均勻一致的移動

收集得到的純化后的血紅蛋白步驟4、血紅蛋白純度鑒定（見教材P69）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳方法：---詳情請觀看血紅蛋白提取和分離的視頻操作提示：（注意事項）1.紅細胞的洗滌：洗滌次數不能過少；須低速、短時離心。2.凝膠的預處理：短時間沸水浴，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標志：紅色區帶均勻一致地移動

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教材圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續血紅蛋白的提取純度。三、實驗結果分析與評價1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發生了哪些變化嗎？三、實驗結果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？如何判斷？

由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出。3、你能觀察到蛋白質的分離過程中，紅色區帶的移動嗎？請描述紅色區帶的移動情況，并據此判斷分離效果？三、實驗結果分析與評價知識小結血紅蛋白的提取和分離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定課堂鞏固練習1、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異