9SN/T4656.—20239進出口紡織品生物安全檢驗方法H第9部分:腸出血性大腸桿菌O157:7H1

范圍本文件規定了進出口紡織品中腸出血性大腸桿菌

O157:H7的檢驗方法。本文件適用于進出口紡織品腸出血性大腸桿菌

O157:H7的檢驗。2

規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682

分析實驗室用水規格和試驗方法28SN/T1538. 培養基制備指南 第1部分:實驗室培養基制備質量保證通則28SN/T1538. 培養基制備指南 第2部分:培養基性能測試實用指南SN/T4656. 進出口紡織品生物安全檢驗方法 第8部分:通則13

術語、定義和縮略語13. 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。113..11ie紡織品生物安全

biosafetyoftextlie一般是指紡織品中攜帶的有害生物本身或其代謝產物對生態環境和人體健康產生的潛在威脅,及對其所采取的一系列有效預防和控制措施。123..12H c Hi i腸出血性大腸桿菌O157:7

Enterohemorrhagi

EscherH c Hi i腸出血性大腸桿菌

O157:H7是腸出血性大腸桿菌的主要致病菌株,是與公共衛生有關的最重要的出血性大腸桿菌的血清類型,是一種可引起人或牲畜腸出血性腹瀉等疾病的細菌性病原體。此病原細菌為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓的短桿菌,最適生長溫度為37℃,不發酵或遲緩發酵山梨醇,不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)產生熒光。133..13i實時熒光 PCRrealtmePCRi在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光化學物質的積累實時監測PCR擴增產物總量的方法。143..14lCt值 Cycethresholdl每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。14. 無菌規格板:0cm

。94. 無菌規格板:0cm

。923. 縮略語2下列縮略語適用于本文件。4 f 4MUG(-Methylumbeliery-βD-Glucuronide):-4 f 4p i id i li ip i id i li iiDNA

(eoxyrbonucecacd):脫氧核糖核酸。Taq(Thermusaquatcus):水生棲熱菌。i l

i idNTP(eoxyrbonuci l

i i4

材料和設備14. 無菌剪刀、鑷子。1234. 電子天平:感量0.1g。234. 無菌均質袋。4 44. 拍擊式均質器:004 4264. 無菌干燥棉拭子。67 58 394. 微量移液器:量程0.

μL~20μL,量程100μL~1000μL,量程17 58 394.

恒溫培養箱:6℃±1℃。4. 接種環。 31114.0

長波紫外光燈:65nm,功率≤6 31114.1

全自動微生物生化鑒定系統。4.2

載玻片。 :

5114.3

滅菌離心管

:

5114.4

PCR反應管。 2114.5

高速冷凍離心機:000r/min~13000 2114.6

熒光PCR儀。5

培養基和試劑除有特殊說明,所有實驗用試劑均為分析純;分子檢測實驗用水符合

GB/T6682中一級水的要求。1 22 C 33 44 55 66 771 22 C 33 44 55 66 77 88 95.

改良山梨醇麥康凱(T-SMAC)瓊脂:符合附錄

A中

A.。5.營養瓊脂:符合附錄

A中

A.。5.

吲哚培養基:符合附錄

A中

A.。5. 柯凡克試劑:符合附錄

A中

A.。5. MR-VP培養基:符合附錄

A中

A.。5. 甲基紅試劑:符合附錄

A中

A.。5. V-P甲、乙液:符合附錄

A中

A.。9 15. 西蒙氏檸檬酸鹽培養基:符合附錄

A中

9 1 L 11 1115.0

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨-MUG(ST-MUG):符合附錄

A L 11 1115.1

山梨醇發酵管:符合附錄

A中

A.2。5.2

生化鑒定試劑盒。25個采樣點,用無菌規格板

4.5)比照按每個采樣點20cm5個采樣點,用無菌規格板

4.5)比照按每個采樣點20cm

面積范圍均勻涂抹,每個采樣點用1個無菌9115.3

腸出血性大腸桿菌

O157和

H7診斷血清。115.4

滅菌雙蒸水。 / /2 i- i 0p15.5

DNA提取液:0mmol

LTrsHCl,2mmol / /2 i- i 0p1用商業化的DNA提取試劑盒。 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.6

10×PCR緩沖液:00 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.7

dNTP混合液(0mmol

L):每種核苷酸濃度10mmolL。5.8

引物和探針:引物和探針序列符合附錄B。5.9

TaqDNA聚合酶(U/μL)。 C25.0

標準菌株:大腸桿菌標準菌株(ICC10389或等效標準菌株),腸出血性大腸桿菌

O157:H7 C2C菌株(ICC21530或等效標準菌株)。C6

樣品制備1116. 樣品制備方法1116.. 稱量法( (( (12無菌方法打開送檢樣品,用無菌剪刀

4.1)均勻剪樣,在電子天平

4.2)上準確稱取剪下的( (( (1225g,剪碎后加入到盛有225mL

mTSB(5.1)的無菌均質袋

4.3)中,用拍擊式均質器

4.4)拍打1min~2min,充分混勻。6.. 多點采樣洗脫法(2((無菌方法打開送檢樣品,在樣品四周和中間均勻布控5個采樣點,用無菌規格板

4.5)比照每個采(2((樣點按4cm×5cm(0cm2)面積范圍剪裁,每20cm2

采樣面積為1份檢樣,每件樣品共采集5份檢樣,采樣面積為100cm2。將上述采集好的5份檢樣放入盛有200mLmTSB(5.1)的無菌均質袋

4.3)中,用拍擊式均質器

4.4)拍打1min~2min,充分混勻,得到一個樣品洗脫液。136.. 棉拭子涂抹法13(無菌方法打開送檢樣品,用

mTSB(5.1)濕潤無菌干燥棉拭子

4.6),在樣品四周和中間均勻布控(2(2 ((干燥棉拭子

4.6),在4cm×5cm(0cm2)面積范圍均勻涂抹,立即用無菌剪刀

4.1)剪去棉拭子(2 ((觸部分,將涂抹部分一起放入盛有50mLmTSB(5.1)的無菌均質袋

4.3)中混勻。26.樣品制備方法選擇原則2216.. 樣品制備一般依6.1.

方法為基準方法;2122 2 26.. 當樣品為面積較大或較厚實或多孔時,樣品制備應采用6.1.

方法。22 2 2檢樣品面積過大或過小,采樣點可按比例增加或減少。23 36.. 當樣品質地致密不容易剪碎制備;或樣品較貴重,客戶要求無損檢測的,23 3方法。24 26.. 采用6.1.1、6.1.

方法時如果被檢樣品大量吸水而導致不能吸出足夠樣品勻液轉種時24 2可適當增加直至足夠吸出轉種。39SN/T4656.—20239H17

方法一 腸出血性大腸桿菌O157:7傳統檢驗方法H17. 原理利用腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能發酵或遲緩發酵山梨醇的特性,接種含山梨醇的CT-SMAC瓊脂平板進行初篩分離;利用腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能分解4-甲基傘形酮-βD-葡萄糖醛酸苷(MUG)產生熒光(MUG試驗陰性)的特性,結合血清學實驗,準確判定腸出血性大腸桿菌

O157:H7。27. 檢驗程序2檢驗程序見圖1。H圖1

腸出血性大腸桿菌O157:7傳統檢驗方法程序H3317. 操作步驟3317.. 增菌1 (將按6.

制備好的樣品勻液放入36℃±1℃恒溫培養箱

4.8)中,增菌培養241 (327.. 分離32( 1 ((用無菌接種環

4.9)挑取7.3.

增菌液接種于兩個CT-SMAC

5.2)平板。放置36℃±1℃( 1 ((培養箱

4.8)培養24h±2h。培養結束后觀察各個平板上菌落生長情況,如無可疑或典型菌落生長,可直接報告樣品中腸出血性大腸桿菌

O157:H7未檢出;如有可疑或典型菌落長出,則挑取可疑或典型菌落純化后進行生化試驗和血清學試驗確認。CT-SMAC平板上腸出血性大腸桿菌

O157:H7典型菌落特征淡褐色中心、扁平透明、邊緣光滑。337.. 純化菌落33(分別挑取CT-SMAC選擇性平板上5個以上可疑或典型菌落,接種營養瓊脂

5.3)平板,于36℃±(1℃培養24h±2h純化,挑取純化后的菌落同時做如下確證實驗。49SN/T4656.—20239347.. 生化試驗343417... 吲哚試驗341(( 1342挑取7.3.

純化后的單個菌落接種吲哚培養基

5.4),置36℃±1℃培養24h±2(( 1342試劑

5.5)0.

mL,陽性反應出現紅色環,陰性為黃棕色環。腸出血性大腸桿菌

O157:H7能分解色氨酸產生吲哚,試驗陽性。7... MR-VP試驗( 3( 2 (挑取7.3.

純化后的菌落分別接種兩管

MR-VP培養基

5.6),6℃±1℃培養( 3( 2 (滴加甲基紅試劑

5.7)

滴~3滴,立即觀察結果;一管按6∶2的比例依次滴加

V-P甲、乙液

5.8)后30min內觀察結果。變紅色為陽性,不變色為陰性。腸出血性大腸桿菌

O157:H7能分解葡萄糖,加入甲基紅指示劑立即顯紅色,即

MR試驗陽性,滴加

V-P甲、乙液后顏色不變,即

VP試驗陰性。3437... 檸檬酸鹽試驗343(挑取7.3.

純化后的單個菌落接種西蒙氏檸檬酸鹽培養基

5.9)后36℃±1℃培養48h±2h,觀(察其顏色變化情況。腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能利用檸檬酸鹽為碳源,檸檬酸鹽試驗陰性。培養基顏色不變。3447... MUG試驗344(CC ((挑取7.3.3

純化后的單個菌落接種

LST-MUG

肉湯管

5.9),同時取大腸埃希氏標準菌(CC (((ICC10389或等效標準菌株)(5.20)菌液接種

LST-MUG

肉湯管做陽性對照,取腸出血性大腸桿菌O157:H7標準菌株(ICC21530或等效標準菌株)(5.20)菌液接種

LST-MUG

肉湯管

5.9)做陰性對照。于36℃±1℃培養24h±2h。培養結束后將LST-MUG肉湯管置長波紫外燈

4.10)下觀察,大腸埃希氏菌株

MUG陽性,有熒光產生;腸出血性大腸桿菌

O157:H7MUG陰性,無熒光產生。3457... 山梨醇發酵試驗345(挑取7.3.

純化后的單個菌落接種山梨醇發酵管

5.11),置36℃±1℃培養24h±2h后觀察是(否發酵。腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能發酵或遲緩發酵山梨醇,發酵管藍綠色或不變色。( (注:如選擇商品化生化鑒定試劑盒

5.12)或全自動微生物生化鑒定系統

4.11),可選擇7.3.

純化后的菌落( (對應操作說明書進行試驗。357.. 血清學試驗353517... 腸出血性大腸桿菌O抗原鑒定351( (( ((1取出腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.13),恢復室溫;取出干凈載玻片( (( ((1量移液器

4.7)吸取20μL腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.18)滴加于載玻片中央;用接種環4.9)挑取營養瓊脂平板上分純單個菌落于血清中,慢慢磨開使其混勻成乳狀液,靜置,min后觀察凝集情況。將載玻片傾斜搖動混合1min,并對著黑暗背景進行觀察,任何程度的凝集現象皆為陽性反應。3527... 腸出血性大腸桿菌

H抗原鑒定352( (用腸出血性大腸桿菌

H7診斷血清

5.13)代替腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.13),方法( (17.3.5.。159SN/T4656.—2023947. 結果報告4綜合以上生化試驗和血清學試驗結果,報告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。H18

方法二 腸出血性大腸桿菌O157:7實時熒光PCR法H18. 原理f4根據腸出血性大腸桿菌

O157:H7特有的rbE保守序列,設計一組PCR特異性引物和熒光雙標記f4探針(兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團)。PCR擴增時,反應體系中加入

DNA

模板、引物、探針、

種脫氧核苷酸酶。目標菌不存在時,探針完整,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收,沒有熒光信號產生;目標菌存在時,探針被

Taq酶酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條

DNA鏈,就有一個熒光分子形成,達到熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步,從而準確判定目標菌存在與否。28. 檢測程序2檢測程序見圖2。H圖2

腸出血性大腸桿菌O157:7實時熒光PCR法檢測程序H38. 操作步驟3318.. 樣品

DNA

模板的提取315 (( (( ((樣品增菌參照7.3.1,取1mL增菌液,放入1.

mL滅菌離心管

4.13)內,置高速冷凍5 (( (( ((4.15)內10000r/min離心5min,吸棄上清;加入1mL滅菌雙蒸水

5.14)混勻,高速冷凍離心機4.15)內10000r/min離心5min,吸棄上清;然后加滅菌雙蒸水

5.14)00μL混勻,置100

℃煮沸5min,高速冷凍離心機

4.15)內10000r/min離心2min,取上清作為

DNA

模板,可-20℃存放備(用。也可使用等效的商品化DNA提取試劑盒

5.15)并按其說明操作。(6組分1管試驗用量n

管試驗用量10×PCR緩沖液(5.16)2.5μLn×2.5μLdNTP混合液(10mmol/L)(5.17)1.0μLn×1.0μL上游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL下游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL探針(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)(5.19)0.5μLn×0.5μL滅菌雙蒸水(5.14)16.0μLn×16.0μL總體積23.0μLn×23.0μL注:上、下游引物終濃度為0.4μmol/L,探針終濃度0.4μmol/L。9SN/T4656.—20239323218.. DNA

擴增反應323218... 擴增準備(n根據樣本數量設定所需要的PCR反應管

4.14)數n(=1管空白對照+1管陰性對照+1(n對照+樣本數)。擴增反應體系見表1,按表1計算各試劑的使用量,按順序加入滅菌

PCR

反應管(24.14)內,顛倒混勻,000r/min離心10s,分裝至n

個PCR反應管內,每管(2表1

反應體系 對照、表1

反應體系 對照、陰性對照、陽性對照3228... 空白

空白對照:以水代替DNA模板。1陰性對照:以水代替樣品按8.3.

提取模板DNA作為PCR反應的模板。1( 1陽性對照:腸出血性大腸桿菌

O157:H7標準菌株

5.20)增菌后按8.3.

提取模板

DNA( 1段的陽性克隆分子DNA。3238... 加樣32310 1將8.3.

制備好的DNA模板、空白對照、陰性對照、陽性對照各取2.

μL10 12的反應管中,使反應體系達到25μL。蓋緊管蓋,混勻,000r/min離心10s。23248... 擴增3243 ( 3 9 9將8.3.2.

反應管置實時熒光PCR儀

4.16)中。反應參數:7℃5min,53 ( 3 9 96 4變性5s,0℃退火延伸40s,同時收集熒光,06 448. 結果分析4418.. 質控標準41C陰性對照:無擴增曲線,t≥40.;CC陽性對照:出現典型的擴增曲線,t<30.;否則,實驗視為無效。C79SN/T4656.—20239428.. 結果判定420a)

Ct≥40.,可判定樣品結果為陰性,可直接報告樣品未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。0b)

Ct≤35.,可判定該樣品結果為陽性;c)

35.0<Ct<40,建議樣本重做,重做結果如Ct≥40為陰性,否則為陽性。對于陽性結果,參見方法一進行確認。58. 結果報告5根據確認結果報告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。9

防止污染和廢棄物處理的措施應符合SN/T4656.8的規定。89SN/T4656.—20239附 錄

A(規范性)培養基和試劑1A. 培養基制備及質量保證12按SN/T1538.

和SN/T1538.

制備培養基并進行性能測試,如使用等效商品化脫水合成培養2基,使用前對其進行驗收并按其說明書使用。2 (21A. 改良胰蛋白胨大豆肉湯

2 (21A.. 成分0055000胰酪蛋白胨 17.g0055000大豆蛋白胨 3.gD-葡萄糖 2.g3號膽鹽 1.氯化鈉 5.g磷酸氫二鉀 4.g新生霉素鈉鹽溶液 1.

mL蒸餾水 1000mL22A.. 制法2221除新生霉素鈉鹽溶液外,準確稱取其余成分混合加入1000mL蒸餾水中,加熱溶解,室溫調節21至7.0±0.,21℃高壓滅菌15min。取出冷卻至50℃以下時,加入1mL新生霉素鈉鹽溶液,混勻備用。3 C31 S311A. 改良山梨醇麥康凱3 C31 S311A..山梨醇麥康凱(MAC)瓊脂A... 成分050蛋白胨 20.g050氯化鈉 5.g山梨醇 10.g3號膽鹽 1.g瓊脂 15.g中性紅0.3g結晶紫 0.01g蒸餾水 1000mL312A... 制法312除瓊脂、中性紅、結晶紫外,準確稱取其余成分混合加入1000mL蒸餾水中,加熱溶解,室溫調節1pH

至7.2±0.,加入瓊脂、中性紅、結晶紫,煮沸溶解,21℃高壓滅菌15min。199SN/T4656.—2023932321A..亞碲酸鉀溶液32321A... 成分5亞碲酸鉀 0.g5蒸餾水 200mL322A... 制法322準確稱取亞碲酸鉀溶于蒸餾水中,過濾除菌備用。33331A.. 頭孢克肟溶液33331A... 成分0頭孢克肟 1.

mg095%乙醇 200mL332A... 制法332將頭孢克肟溶解于95%乙醇中,靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管,儲存于-20℃,有效期1年。解凍后的頭孢克肟溶液不易在凍存,且在0℃~4℃下存放有效期2周。34A.. CT-SMAC平板制備34取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃的SMAC瓊脂,加入1mL亞碲酸鉀溶液和10mL頭孢克肟溶液,混勻后傾注平板。441A. 營養瓊脂441A.. 成分000蛋白陳 10.g000牛肉膏 3.g氯化鈉 5.g瓊脂 15.g蒸餾水 1000mL42A.. 制法421 1將上述成分混合后,加熱溶解,室溫調pH7.4±0.,分裝到玻璃容器內,21℃高壓滅菌201 1平板傾注15mL~20mL瓊脂,備用。551A. 吲哚培養基551A.. 成分00蛋白胨 10.g00氯化鈉 5.gDL-色氨酸 1.g蒸餾水 1000mL109SN/T4656.—2023952A.. 制法52521 /522A... 準確稱取除DL-色氨酸外其他成分加入1000mL蒸餾水中,攪拌均勻,靜置約10521 /522A...準確稱取DL-色氨酸加入約4mL1molL氫氧化鈉溶液中,完全溶解。523 4 1 1A...將兩液進行混合,加熱煮沸至完全溶解,調pH7.

±0.,分裝試管(523 4 1 15 1管1.

mL,21℃高壓滅菌15min,5 1661A. 柯凡克試劑661A.. 成分對二甲氨基苯甲醛 10.g戊醇 150mL濃鹽酸 50mL62A.. 制法62準確稱取對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,緩慢攪拌加入鹽酸,加熱至60℃,呈深黃色,靜置6h~7h,變成黃色即可使用。771A.MR-VP培養基771A.. 成分000胨 7.g000葡萄糖 5.g磷酸氫二鉀 5.g蒸餾水 1000mL72A.. 制法722 1稱取各成分溶于水中,加熱溶解,調pH6.9±0.,分裝試管,21℃高壓滅菌152 1881A. 甲基紅試劑881A.. 成分1甲基紅 0.g195%乙醇 300mL82A..