大腸桿菌分子克隆載體第1頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月一、E.coli克隆載體的種類

1.質(zhì)粒載體—復(fù)制起點(diǎn)來自一些天然質(zhì)粒。

2.噬菌體載體—λ，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。

3.COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝

4.噬粒載體（phagemid）—有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)粒或噬菌體方式復(fù)制。

第2頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月二、質(zhì)粒與質(zhì)粒載體

1.E．coli的質(zhì)粒種類

1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。

2)R因子（抗藥性因子）

可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝嚴(yán)緊型，質(zhì)粒較大，操作不便

3)F因子（性因子）第3頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2.質(zhì)粒的特點(diǎn)

1)

質(zhì)粒DNA復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)

2)

質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在

3)

質(zhì)粒DNA可以接合轉(zhuǎn)移

4)

質(zhì)粒的不相容性和不相容群

5)

質(zhì)粒DNA的消除—化學(xué)和物理法(吖啶染料，EtBr，高溫等)6)

質(zhì)粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色體中

3.質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移

1）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移過程

第4頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主轉(zhuǎn)移過程

第5頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移和復(fù)制

第6頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的必備條件

ⅰ.轉(zhuǎn)移起點(diǎn)(oriT),它是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移時的復(fù)制起點(diǎn)—順式作用（cis-action）

ii.細(xì)胞附屬物—性纖毛，由蛋白質(zhì)構(gòu)成—反式作用

ⅲ.轉(zhuǎn)移過程所需的全部酶類—反式作用

3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型

ⅰ.自我轉(zhuǎn)移（Self-transmissible）

ⅱ.輔助轉(zhuǎn)移（Donation）—可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒僅具備oriT，若無輔助質(zhì)粒，前者不會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。若輔助質(zhì)粒可提供所有反式作用的蛋白質(zhì)，前者便會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

ⅲ.重組轉(zhuǎn)移（conduction）—若質(zhì)粒無oriT，該質(zhì)粒只有整合到輔助質(zhì)粒DNA中，重組質(zhì)粒便可轉(zhuǎn)移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆載體，只要具備oriT即可，另外兩類功能基因可置于輔助質(zhì)粒上，該質(zhì)粒一般沒有oriT，因而可以減少后者進(jìn)入另一種細(xì)胞的頻率。

第7頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)移

R-重組DNA分子

第8頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.質(zhì)粒DNA的復(fù)制和調(diào)節(jié)控制

1)復(fù)制機(jī)制—復(fù)制方向、終止和方式

2)質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制—抑制劑模型：高拷貝質(zhì)粒需高濃度抑制劑，低拷貝質(zhì)粒需低濃度抑制劑，同一不相容群質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制劑可交叉相互作用。

3)

質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制例子:ColE1質(zhì)粒的復(fù)制及復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)

Borosetal.(1984)分離到一個pBR322突變體，其拷貝數(shù)可達(dá)1000/cell或65%總DNA，原因是在RNAI基因的3'端附近發(fā)生一次G→T顛換。第9頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA的復(fù)制過程

第10頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月5.大腸桿菌質(zhì)粒載體

1)常用質(zhì)粒載體的復(fù)制子

質(zhì)粒載體復(fù)制子來源拷貝數(shù)

pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-20

2)質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因

AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZα

3)多克隆位點(diǎn)區(qū)

大多數(shù)從pUC系列中的多克隆位點(diǎn)衍生出來的

第11頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

6.實(shí)例—pUC18和pUC19

pUC系列質(zhì)粒載體由Messingetal.構(gòu)建，具有三個顯著特點(diǎn)：

1）分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大

2）易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα3）多克隆位點(diǎn)區(qū)

ⅰ.多克隆位點(diǎn)成對地存在于pUC18和pUC19中，位點(diǎn)排列順序相同，但方向相反。這種排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入

ⅱ.產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列:兩端限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），與之相鄰的兩個限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四個限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’—突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。第12頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18和pUC19載體第13頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

如插入片段的5’段定向缺失:XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase;插入片段的3’-端亦可采用類似的方法進(jìn)行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase）不同載體中的多克隆位點(diǎn)區(qū)可以供不同目的片段的重組。又例如:pBS+多克隆位點(diǎn)區(qū)的排列順序是(見圖)：假設(shè)有一EcoRI→HindⅢDNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外的DNA片段（如終止子、啟動子），顯然，pUC系列載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點(diǎn)區(qū)就能滿足要求。

ⅲ.多克隆位點(diǎn)集中排列，有利于克隆片段的物理圖譜的繪制。除上述三個特點(diǎn)外，pUC系列載體還可用于表達(dá)外源基因（LacZα啟動子）。第14頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月pBS載體的結(jié)構(gòu)第15頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

三.

噬菌體載體

1.噬菌體λ載體

1）λ的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

i.一般結(jié)構(gòu)：48,502bp，線狀ds-DNA，兩端具有12n.t5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）該末端稱為cos位點(diǎn)，可被λ編碼的末端酶所識別（該酶由λ末端的兩個基因Nul和A編碼蛋白gpNul和gpA組成）

ii.基因結(jié)構(gòu)—46個基因，分為以下四類：

ⅰ)調(diào)控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—決定進(jìn)入溶源化還是裂解狀態(tài)

ⅱ)DNA復(fù)制：O、P、Qⅲ)λ重組：int、xis、redβ和gamⅳ)噬菌體顆粒形成與細(xì)胞裂解：頭(A-F)、尾(E-J)、S&R（細(xì)胞裂解）λ中部約1/3的DNA(b2)與λ存活無關(guān)。第16頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌λ噬菌體的基因和表達(dá)調(diào)控第17頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2)λ噬菌體基因的表達(dá)

i.最早期轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄起始于CI基因兩側(cè)的PL和PR啟動子，止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向轉(zhuǎn)錄物可継續(xù)通過O和P止于tR2。

ii.后早期轉(zhuǎn)錄：N蛋白可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止因子ρ失活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄通過tR1、tR2和tL進(jìn)入其余早期基因區(qū)域。

iii.后期轉(zhuǎn)錄：cro蛋白可與OL和OR結(jié)合，阻止RNA聚合酶與PL和PR結(jié)合，轉(zhuǎn)錄終止，此時已合成了足夠多的控制蛋白Q，它對P'R起激活作用，導(dǎo)致后期基因轉(zhuǎn)錄。

iv.DNA復(fù)制：因早期轉(zhuǎn)錄獲DNA復(fù)制蛋白O和P，雙向復(fù)制開始。

v.包裝：Nul和A蛋白與λDNA的cos位點(diǎn)的識別與切割，F(xiàn)I蛋白促進(jìn)DNA進(jìn)入頭部蛋白，DNA充滿后，gpw和gpFⅡ?qū)㈩^部封住，然后與尾部相連，形成噬菌體顆粒。第18頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月vi.裂解：基因R和S產(chǎn)物形成，細(xì)菌細(xì)胞裂解，噬菌體顆粒釋放。

vii.溶源反應(yīng)：CⅡ和CⅢ基因產(chǎn)物分別激活PE和PI的左向轉(zhuǎn)錄，致使CI和int基因表達(dá)，CI產(chǎn)物可阻止早期轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致后期基因表達(dá)受阻。對于裂解反應(yīng)和溶源反應(yīng)的選擇，取決于感染細(xì)胞中一系列宿主和噬菌體因子間錯綜復(fù)雜的精細(xì)平衡關(guān)系。*當(dāng)λDNA注入宿主細(xì)胞后，線狀DNA首先環(huán)化為環(huán)狀DNA，這種環(huán)化有以下幾點(diǎn)好處：

a.若為單向復(fù)制，不管從何處開始復(fù)制，全基因組均可全部復(fù)制

b.噬菌體DNA插入宿主染色體DNA，只需一次位點(diǎn)特異性重組

c.拓?fù)洚悩?gòu)酶易于對其進(jìn)行不足和過度加旋

d.受損的基因組增大了存活的可能性，因?yàn)殡p向復(fù)制不會受阻于損傷的DNA鏈，而單向復(fù)制就不能通過

第19頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

3)λDNA的復(fù)制第20頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月4)λDNA的包裝過程

l

頭—尾連接器由12分子gpB構(gòu)成中空結(jié)構(gòu)，groE1和groES負(fù)責(zé)裝配

l

pX由10個雜合的gpC和gpE構(gòu)成，使連接器定位

l

gpW和gpFⅡ結(jié)合在連接器上，防止DNA外泄，提供尾部粘著點(diǎn)末端酶由兩基因產(chǎn)物組成（Nul和A），gpNul2-gpA1(20,444x2+72,280=113,168)

該酶具有以下多種酶活性：1）特異DNA位點(diǎn)結(jié)合；2）特異位點(diǎn)切口形成；3）頭前體結(jié)合；4）gpFI結(jié)合；5）cos位點(diǎn)變性；6）DNA轉(zhuǎn)位；7）DNA序列掃描；8）ATP結(jié)合；9）ATP水解。

因此，頭部蛋白gpE和gpD以及包裝蛋白gpA是λDNA形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這一結(jié)論

第21頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月λDNA的包裝

第22頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

5）λDNA作載體的缺點(diǎn)和解決辦法

i.λ頭部只能容納自身DNA的78-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入3Kb外源DNA片段—除去所有與λ裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。

ii.同一種限制酶具有多個識別位點(diǎn)，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。

ⅲ.重組的λDNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞—利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。

6)λ載體的種類

i.插入型—即將外源DNA直接插入已構(gòu)建載體中，如λgt11，可以插入長達(dá)7Kb的DNA。這類載體被限制酶切成左右臂。

ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代載體中的一段DNA，而這段DNA常含有一定的標(biāo)記基因。這類載體常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。*有的取代型λ載體亦可用作插入型載體,如Charon4A第23頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌λ載體Charon4ASpi重組子的篩選

第24頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月7)λ載體的遺傳標(biāo)記基因和重組子篩選

由于λ載體或重組DNA是通過感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的，因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標(biāo)記。用于重組子檢測的遺傳標(biāo)記基因主要有l(wèi)acZ基因。不管是用插入或取代法，該標(biāo)記基因均會失活。

利用spi-選擇重組子：野生型λ不能在P2溶源化菌種中成活，稱之為spi+(sensitivetoP2interference)，這與red和gam基因有關(guān)。若用外源DNA將這些基因取代，形成的重組DNA分子可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。λ載體λ1059、λL47.1均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。第25頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.P1噬菌體載體

1)

基本結(jié)構(gòu)與特征

i.

基因組長88kb,在噬菌體顆粒中的DNA長100kb,呈線狀,其中約有12%的多余DNA;ii.

可以低拷貝質(zhì)粒形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中,又可以烈性噬菌體形式進(jìn)行復(fù)制;

iii.P1噬菌體包裝原理:漸進(jìn)滿頭機(jī)制（processiveheadfulmechanism）底物:滾環(huán)復(fù)制過程形成的頭尾相連串狀體

第26頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

包裝過程:始于一個長162bp的P1pac位點(diǎn)，識別和切割此位點(diǎn)的是P1編碼的pacase，切出的pac一端進(jìn)入預(yù)制頭部，當(dāng)其頭部充滿DNA后，DNA再次被切。第二次切割是隨機(jī)的，無特異性DNA序列。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個pac位點(diǎn)開始的。P1頭部可容110Kb。

pac位點(diǎn):一端含4個六聚體(5’TGATCA/G3’)，另一端則有三個，中間區(qū)域長90bp，pacase切點(diǎn)位于靠近90bp區(qū)的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點(diǎn)(dam→GATC),pacase只作用甲基化的pac位點(diǎn).第27頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌P1噬菌體基因組和包裝第28頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2)P1載體---pAd10sacBⅡ

i.優(yōu)點(diǎn)

i)

可克隆較大插入片段,可插入95Kb外源DNA，二倍于cos質(zhì)粒載體

ii)

較高的轉(zhuǎn)化頻率,1~2μg載體+2~4μg外源DNA→105轉(zhuǎn)化子

iii)

與YAC載體相比，它易于產(chǎn)生多拷貝的基因組片段;易于獲得大量特定的克隆DNA;克隆過程更可靠;克隆片段易于進(jìn)行次克隆

ii.結(jié)構(gòu)載體被二個loxP重組位點(diǎn)分隔為兩區(qū)—Ampr和Kanr區(qū)

Ampr區(qū)：來自pBR322的ori,pac位點(diǎn)(反時針包裝),來自腺病毒的11Kb填充片段(插入到ScaⅠ位點(diǎn))Kanr區(qū)：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1質(zhì)粒復(fù)制子和分離系統(tǒng)，P1裂解復(fù)制子，其活性受lac操縱基因啟動子控制第29頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌P1噬菌體載體pAd10sacBⅡ

第30頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月P1噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的示意圖pAd10sacBⅡScaI+BamHI

長臂+短臂加入外源DNA片段重組DNA分子離體包裝感染宿主細(xì)胞第31頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

SacB基因:編碼一種將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶，當(dāng)含該基因的細(xì)胞培養(yǎng)在2%以上蔗糖培養(yǎng)基中時,果聚糖積累在細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡

SacB基因被克隆到原Tetr

基因的BamHI-SalI間,在其上游加上E.coli基因啟動子,克隆位點(diǎn)BamHI位于這兩個DNA片段間,外源DNA片段插入時可進(jìn)行顯性篩選重組子為了使sacB基因自發(fā)突變減小到最小限度,sacB基因上游還有一個P1C1阻遏物結(jié)合位點(diǎn)與其啟動子重疊。凡是表達(dá)P1C1基因的細(xì)胞，sacB基因表達(dá)受阻，在無蔗糖條件下，這種細(xì)胞會生長得更好

iii.克隆策略

3.3kb短臂：含pac,loxP,無啟動子的sacB26kb長臂:含P1裂解復(fù)制子，Kanr，P1質(zhì)粒復(fù)制子，loxP位點(diǎn)第32頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月包裝:重組DNA分子先用pacase或抽提物Ⅰ酶切pac位點(diǎn)，然后用抽提物Ⅱ（含頭部和尾部）進(jìn)行包裝直至頭部充滿DNA，最后與尾部相連成有感染力的重組P1噬菌體顆粒。

iV.

重組DNA分子形成當(dāng)重組DNA分子進(jìn)入宿主細(xì)胞后，特異性位點(diǎn)重組發(fā)生在兩個方向相同的loxP位點(diǎn)，該過程由宿主細(xì)胞表達(dá)的重組酶（Cre）催化

v.宿主菌

E.coliNS3529菌株基因型recA-，lacⅠq，mcrABC，mrr:recA-:防止插入DNA片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排;lacⅠq

:抑制P1裂解復(fù)制子的激活,使P1質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源DNA分子重排;

mcr和mrr:抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段的選擇性丟失第33頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.M13和fd載體

1)

結(jié)構(gòu)特征—環(huán)狀ssDNA，病毒顆粒呈絲狀

2)

復(fù)制過程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包裝無嚴(yán)格限制

3)生活史

a.

病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和A蛋白附著于性纖毛頂端（E.coli中F因子提供）

b.

病毒DNA和A蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大部分衣殼蛋白則留在細(xì)胞膜上

c.

病毒DNA變?yōu)殡p鏈復(fù)制形式（RF）,衣殼蛋白可能為DNA復(fù)制提供附著位點(diǎn)

d.

RF進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，形成單鏈，同時基因與蛋白質(zhì)結(jié)合

e.

ssDNA環(huán)化，并形成線狀的DNA—基因與蛋白質(zhì)復(fù)合物

f.

病毒DNA穿膜時，基因與蛋白質(zhì)被附著于膜上的衣殼蛋白取代，完整病毒從細(xì)胞中釋放，釋放時不殺死細(xì)胞，但因感染細(xì)胞生長緩慢，仍然可見噬菌斑第34頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月M13噬菌體的生活史

第35頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）基因結(jié)構(gòu)基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復(fù)制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成