提綱磁性微球磁性微球結構、分類及特點磁性微球的制備磁性微球分離技術免疫磁株免疫磁珠結構與性質免疫磁株的特點免疫磁珠的分類免疫磁珠的制備免疫磁珠分離技術免疫磁珠技術的應用免疫磁珠在食品安全檢測中的應用免疫磁珠與其它檢測手段的聯用免疫磁珠技術在其他領域的應用免疫磁珠技術的優缺點及發展望一磁性微球是通過一定方法將磁性無機粒子與有機高分子結合形成的具有一定磁性及特殊結構的體積在幾納米到幾十微米之間的復合微球。高分子磁性微球表面具有眾多表面功能基團，同時具有磁響應性，在外加磁場作用下具有磁導向功能。目前已廣泛用于生物醫學、細胞學和分離工程等領域。二磁性微球結構、分類及特點磁性核材料多為Fe、Co、Pt、Ni等金屬及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、鐵鈷合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4應用最多。構成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質。天然高分子有明膠、球蛋白、牛血清白蛋白、聚賴氨酸、淀粉和多種聚糖如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、果膠等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。這些材料可單獨用，也可復合使用。磁性微球表面可根據需要賦予不同的功能基團(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—環氧基、—CHCl等)，使其表現具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負電荷等不同物理性質。同時具有磁響應性，在外磁場作用下具有磁導向性。導電聚合磁微球聚合磁微球對磁性微球的要求：粒徑均勻、大小合適、比表面積大、吸附力強、具有強的超順磁性、懸浮均勻穩定性好、不易聚集沉淀、表面具有多種活性基團、理化性質穩定、具有較好生物相容性、對細胞、機體、活性物質損傷小。由于環氧基、氯甲基功能基團非常活躍，不需連接其他活性基團即可與生物配基（如抗體、抗原等）偶聯，及其他基團的微型磁珠在生物學、醫學方面應用較為廣泛。三磁性微球的制備

磁性微球制備方法：共沉淀法、懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子轉移自由基聚合法等。1.共沉淀法

金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通過單體聚合反應得到PS-AAEM顆粒分散劑，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）顆粒的分散劑中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉積，制得PS-AAEM為核心、Fe3O4粒子為殼層的磁性微球。微球的磁性能通過改變FeCl2和FeCl3的濃度或改變PS-AAEM核心的尺寸來控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3與葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超聲連續作用下水浴加熱，制得以Fe3O4為核、dextran為殼的磁性微球。楊玉東等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O與配體（如二亞乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）組成的混合液體加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制備了葡聚糖為殼、氧化鐵為核的磁性微球。吸取上清液:取1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側深人液面，輕輕吸走上清液。是通過一定方法將磁性無機粒子與有機高分子結合形成的具有一定磁性及特殊結構的體積在幾納米到幾十微米之間的復合微球。具有均勻性、超順磁性及保護性外殼，由磁性載體微球和免疫配基結合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。方法簡便，可用于土壤中細菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。除在菌落周圍有一環外.2anti-Fab抗體法：用anti-Fab抗體與磁珠偶聯抗體競爭目的細胞，是磁珠與目的細胞解離，用磁場除去游離磁珠，即可獲得非標記細胞。ComparationofseveralDNAextractionmethodsIMB技術在醫學領域有廣闊應用前景，它可以檢測腫瘤細胞，如骨髓中腫瘤細胞的檢測、淋巴結中腫瘤細胞的檢測。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測從環境來源的副溶血性弧菌。幾種DNA分離方法的比較吸取50μL免疫磁珠懸液.每個樣品更換1支加樣吸頭，質控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。十二免疫磁珠在食品安全檢測中的應用結果用該方法對甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng／mL。制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配機溶液中使磁珠與抗體充分吸附結合，然后分離免疫磁珠分散于緩沖溶液中可以使用。在CT-SMAC平板上，典型菌落為不發酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現較暗的灰褐色;發酵山梨醇的菌落為紅色;在改CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。結果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。當目的細胞含量特別低，無法直接進行陽性分選時，可采用陰性分選發先出去其他雜細胞，當目的細胞富集到一定程度時在采用陽性分選發篩選目的細胞。利用IMB可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,IMB為難于從環境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。2聚合法制備磁性微球過程異相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、懸浮液聚合三種。該法是將磁性粒子用表面改性劑、偶聯劑、引發劑等處理后分散到含有聚合物單體的溶劑中進行聚合反應。通常以磁性粒子為活性中心進行單體聚合。四磁性微球分離技術MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是將免疫學+細胞生物學+磁力學結合為一體，利用磁性微球表面功能基團的專一親和特性或多孔吸附特性吸附特定組分，然后用外力磁場作用將吸附了特定物質的磁珠加以分離，再經過洗脫磁珠上吸附的目標物質的一種新型分離技術，具有廣泛的用途。

幾種DNA

分離方法的比較ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

傳統法鰲合樹脂法玻璃粉法磁珠法免疫親和法DNA提取酚/氯仿等溶劑抽提Chelex100樹脂吸附玻璃粉吸附離心分離磁珠吸附磁場分離抗原抗體反應磁場分離適用范圍大多數標本DNA提取純化培養及各種臨床標本土壤標本冰凍、陳舊組織冰凍、陳舊組織，樣本含量很少的標本方法評價DNA純度高、含量多，但較費時，步驟繁瑣，用有機溶劑，有損操作者健康。可用于培養標本和各種臨床標本細菌及部分病毒核酸的提取。方法簡便，可用于土壤中細菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。簡單、快速，整個過程不到2h，可獲得較純DNA。適于少量樣本。DNA純度高，含量多，適于樣本含量少標本，單克隆抗體的制備是關鍵。五免疫磁珠免疫磁珠（IMB）也稱免疫磁性微球，是在磁性微球表面偶聯上免疫配基的一種磁性微球，是將磁性微球技術和免疫學相結合的特殊磁性微球。六免疫磁珠的結構與性質免疫磁珠核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子材料，最外層是免疫配基。免疫配基

免疫配基通過生物高分子的功能基團結合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現出的物理性質也不同，從而可結合不同的免疫配基，如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必須具有生物專一性的特點，而且載體微球與配基結合要不影響或改變配基原有的生物學特性，保證磁珠的特殊識別功能。免疫磁珠的性質具有均勻性、超順磁性及保護性外殼，由磁性載體微球和免疫配基結合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形狀具有均一性，可使靶物質迅速有效地結合到磁珠上，可使新生成復合物在磁場中具有相同磁響應性，且行為一致。磁珠球形結構可消除與不規則形狀粒子間的非特異性結合，順磁性可使磁珠置于磁場時顯示其磁性，并做定向移動，從磁場移出時磁性消除，磁珠分散，可方便地進行分離和磁性導向。保護性殼可防止磁性內核漏出或被載液腐蝕；免疫配基可專一性結合反應體系中相應的抗原、抗體、核酸等生物活性物質。七免疫磁株的特點磁性微球與免疫配基結合牢固。不影響或改變免疫配基原有的生物特性和特異性。免疫微球的識別專一性。在磁場中具有順磁性，離開磁場磁性消失，易于分散。

由于聚苯乙烯磁性微球強度高、表面易進行化學維修飾，是比較理性的制造免疫磁珠的材料。八免疫磁珠的分類

根據磁珠在磁場中受力大小及磁珠體積，分為小磁珠和大磁珠。大磁珠：1-5um，粒徑較大、懸浮穩定性差、易沉淀、比表面積小、吸附能力低、吸附活性配基少、對細胞影響大，特別是陽性分選時需將磁珠與細胞解離后方可進行下一步實驗。但磁力強，無需特殊分離柱即可實現樣品分離，分離速度快、過程簡單、成本低。小磁珠：50nm以下，粒徑較小、懸浮穩定、比表面積大、表面吸附活性配基多，只有細胞體積的萬分之一，對細胞表型和功能影響小，不影響細胞的后續培養。但磁力弱，需特殊分離柱才能實現樣品分離，分離速度慢，成本高九免疫磁珠的制備免疫磁珠的制備是將磁性微球和抗體等配基結合而成。磁性微球與抗體的連接方式有共價結合和吸附結合兩種方式。共價結合：依靠磁珠表面的活性基團如-CHO、-COOH等與抗體Fab段上的-NH2共價反應和結合吸附結合：依靠磁珠巨大的比表面與抗體見得非特異性吸附而結合。共價結合的牢固度遠遠大于吸附結合牢固度。制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配機溶液中使磁珠與抗體充分吸附結合，然后分離免疫磁珠分散于緩沖溶液中可以使用。十免疫磁珠分離技術免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)分離技術：是一種以特異的抗原抗體反應為基礎的免疫學磁性微球檢測和分離技術。它是以抗體包被的微球磁珠為載體，通過抗體與反應介質中特異性抗原結合，形成抗原—抗體復合物，此復合物在外加磁場作用下發生定向移動，從而達到分離抗原的目的。

基本原理：磁性微球經過一定處理后,將抗體結合到磁珠上,形成免疫磁性微球（標記磁珠）,標記磁珠的抗體與特異性抗原結合形成抗原—微球復合物,該復合物在磁場中具有與其它組分不同的磁響應性,在磁力作用下,該復合物發生力學移動,從而達到分離抗原的目的。以細胞分離為例圖解免疫磁珠技術的原理免疫磁珠標記方法1直接磁珠和直接標記法通過物理吸附和共價鍵結合直接將特意性抗體與磁珠耦合，然后再與相應細胞結合，形成細胞-抗原-抗體-磁珠復合物，在外磁場下直接分離目的細胞。快速、簡單、特異性和細胞得率高，靈敏度低，需制備相應的偶聯抗體磁珠。2簡介磁珠和間接標記法使用anti-lg等與磁珠偶聯，通過Anti-lg再使磁珠與二抗體偶聯，分離細胞時，先使細胞與一抗特異性結合，然后在與一抗標記磁珠結合，形成細胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠復合體，在外磁場下分離目的細胞的方法。該法增加了細胞的洗滌步驟，特異性也會降低。該法一般用于①沒有直標磁珠抗體②需用幾種抗體去除多種細胞③目的細胞上特異性抗原分子表達水平低。每個樣品更換1支加樣吸頭，質控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。免疫磁珠與其它檢測手段的聯用同時還能捕獲受損傷靶細菌。免疫磁珠可借助親和素——生物素系統與非蛋白結合（如各種DNA、RNA大分子）。在磁場中具有順磁性，離開磁場磁性消失，易于分散。方法簡便，可用于土壤中細菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。磁性微球表面可根據需要賦予不同的功能基團(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—環氧基、—CHCl等)，使其表現具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負電荷等不同物理性質。接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養由于環氧基、氯甲基功能基團非常活躍，不需連接其他活性基團即可與生物配基（如抗體、抗原等）偶聯，及其他基團的微型磁珠在生物學、醫學方面應用較為廣泛。且在其周圍形成一個暈環。免疫磁珠技術在其他領域的應用制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配機溶液中使磁珠與抗體充分吸附結合，然后分離免疫磁珠分散于緩沖溶液中可以使用。coliO157∶H7，滿足流行病學的研究要求和提高控制力度。2）分離

將Eppendorf管固定在磁架的管孔中。將Eppendorff管按樣品和質控菌株進行編號，每個樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在菌落中心部位的深層也形成黑點。是通過一定方法將磁性無機粒子與有機高分子結合形成的具有一定磁性及特殊結構的體積在幾納米到幾十微米之間的復合微球。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在()XA瓊脂平板上菌落相似。構成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質。幾種DNA分離方法的比較1800輕緩擺動磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁極。MACS微珠直標微珠多選微珠間標微珠免疫磁珠分選方法陽性分選：運用特異性抗體偶聯磁珠直接從細胞混合物中分離目的細胞的分選方法稱為positiveselection.陽性分選中磁珠標記的細胞即為目的細胞。該法簡單、快速、細胞得率和純度較高。如采用anti-CD14磁珠分選CD14+巨噬細胞。陰性分選：用抗體偶聯磁珠去除無關細胞，使目的細胞得以純化和分離的分選方法稱為negativeselection.陰性分選中磁珠標記的細胞為非目的細胞。如分離CD4+T細胞時，由于沒有專用的CD4+T細胞分選磁珠，可通過anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119標記磁珠去除CD8+T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、巨噬細胞、粒細胞等，最終而獲得較純的CD4+T細胞。因此陰性分選法適用于：①從細胞混合物中去除某種類型細胞。如腫瘤細胞。②缺乏針對目的細胞篩選的特異性抗體磁珠時。③抗體和目的細胞結合可能誘導細胞活化，影響后續細胞功能分析時。復合分選：將陰性分選和陽性分選相結合的分選方法。當目的細胞含量特別低，無法直接進行陽性分選時，可采用陰性分選發先出去其他雜細胞，當目的細胞富集到一定程度時在采用陽性分選發篩選目的細胞。免疫磁珠與細胞解離1過夜培養法：常用方法。將結合磁珠細胞置于10%胎牛血清培養基中37℃5%CO2細胞培養箱中培養16-24h，磁珠可從細胞上脫落，再通過磁場除去游離磁珠，即可獲得裸細胞。2anti-Fab抗體法：用anti-Fab抗體與磁珠偶聯抗體競爭目的細胞，是磁珠與目的細胞解離，用磁場除去游離磁珠，即可獲得非標記細胞。3酶解法：通過木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠與細胞解離，再通過磁場除去游離磁珠，獲得裸細胞。免疫磁珠分離裝置

免疫磁珠分離裝置由超強磁鐵分離器和分離柱組成。磁鐵和分離柱的型號多樣，配合0.5ml、1.5ml微量離心管，15ml及50ml離心管或試管，和96孔或384孔培養板中樣品的分離，以滿足不同試驗要求。十一免疫磁珠分離技術的應用分離抗原抗體分離蛋白和多肽分離多糖物質分離DNA和RNA分離細胞和病毒靶向釋藥系統的載運食品有害微生物分析與檢測磁珠法分離抗體、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA、RNA操作過程示意圖每個樣品換用1支無菌加長吸管。35℃士1℃培養22h-48h。1直接磁珠和直接標記法吸取50μL免疫磁珠懸液.金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應生成磁性高分子微球的方法。結果用該方法對甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng／mL。報告加20μL準備好的免疫磁珠。以細胞分離為例圖解免疫磁珠技術的原理免疫磁珠分離裝置由超強磁鐵分離器和分離柱組成。磁性核材料多為Fe、Co、Pt、Ni等金屬及其氧化物。Notzon等用IMB-熒光PCR檢測肉類中的沙門氏菌，實驗包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴增，12～13h即可完成檢測過程，IMB-熒光PCR在檢測自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。2）篩選

李斯特氏菌在CHROMagar顯色培養基上菌落為藍色.免疫磁珠可以看作是親和層析技術中的微型配基，體，在基質上固相化抗體或抗原后，形成特異性吸附后，再進行磁性親和抽屜不需離心過濾，用于分離和純化相應的生物大分子。利用IMB可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,IMB為難于從環境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。且在其周圍形成一個暈環。簡單、快速，整個過程不到2h，可獲得較純DNA。在檢測時間方面可將常規檢測方法中的72小時檢測周期縮短至40小時，而且能有效減輕過程交叉污染;吸取上清液:取1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側深人液面，輕輕吸走上清液。1%，且50%的巨核細胞具有生物活性，分離的巨核細胞超微結構保持完整，可用于巨核細胞的分子生物學等方面研究。μMACSVitalvirusHiv分離試劑盒分離標記造血細胞表面的Hiv-1病毒CD44H異型細胞免疫磁珠標記細胞示意圖免疫磁珠分離細胞及病毒示意圖十二免疫磁珠在食品安全檢測中的應用免疫磁珠對病毒細胞具有特異選擇性，因此能用于食品有害微生物的檢測。免疫磁珠技術與常規檢驗方法相比具有檢測迅速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景干擾，提高了精準性。同時還能捕獲受損傷靶細菌。目前，免疫磁珠技術已廣泛用于食品樣品中致病微生物的檢測。大腸桿菌O157的檢測傳統分離E.coliO157∶H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時長、工作量大等缺點。采用免疫磁珠技術，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coliO157∶H7，滿足流行病學的研究要求和提高控制力度。現在這種免疫磁珠的方法已經被英國公共健康服務實驗室認定為標準的分離方法，我國也已將免疫磁珠法對大腸桿菌O157的檢測納入國家標準（GB/T4789.36-2008）和出入境檢驗檢疫行業標準(SN/T1059.5-2006)。已有市售的專用免疫磁珠銷售。檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質225mL免疫磁珠捕獲涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落5個~10個，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSIMUG-LST陽性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕獲法檢測O157∶H7程序陰性血清學試驗非O157細菌生化試驗報告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h1增菌

2免疫磁珠捕獲與分離

1.將Eppendorff管按樣品和質控菌株進行編號，每個樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支Eppendo-rff管的蓋子，每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠懸液。

2.取mEC+n肉湯增菌培養物1mL，加人到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10s。每個樣品更換1支加樣吸頭，質控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。

具體操作該法增加了細胞的洗滌步驟，特異性也會降低。其中Fe3O4應用最多。檢樣免疫磁珠技術與常規檢驗方法相比具有檢測迅速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景干擾，提高了精準性。3酶解法：通過木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠與細胞解離，再通過磁場除去游離磁珠，獲得裸細胞。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2O共價結合的牢固度遠遠大于吸附結合牢固度。現在這種免疫磁珠的方法已經被英國公共健康服務實驗室認定為標準的分離方法，我國也已將免疫磁珠法對大腸桿菌O157的檢測納入國家標準（GB/T4789.吸取50μL免疫磁珠懸液.Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養基分離貝類中產TDH的副溶血性弧菌O3:K6。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。IMB技術檢測沙門氏菌的優點②缺乏針對目的細胞篩選的特異性抗體磁珠時。Hudson等研究表明，將免疫磁珠技術與PCR結合，24h內即可檢出火腿中的單增李斯特菌。1mL轉種10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）加20μL準備好的免疫磁珠。每個樣品更換1支加樣吸頭，質控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配機溶液中使磁珠與抗體充分吸附結合，然后分離免疫磁珠分散于緩沖溶液中可以使用。除在菌落周圍有一環外.通常以磁性粒子為活性中心進行單體聚合。

3.結合:在18℃~30℃環境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在DynalMXl樣品混合器上轉動或用手輕微轉10min，使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。4.捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3min內不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時，在Eppendorff管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。

5.吸取上清液:取1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側深人液面，輕輕吸走上清液。當吸到液面通過免疫磁珠聚集物時，應放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內含有磁珠，則應將其放回到Eppendorff管中，并重復4步驟。每個樣品換用1支無菌加長吸管。6.洗滌:洗滌免疫磁珠混合物，重復上述步驟

4~6和4~5。7.免疫磁珠懸浮:將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。8.涂布平板:用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50μL免疫磁珠懸液分別轉移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板一側，再用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，用接種環劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉平板，于36℃士10℃培養18---24h。菌落識別在CT-SMAC平板上，典型菌落為不發酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現較暗的灰褐色;發酵山梨醇的菌落為紅色;在改CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。

初步生化試驗:在CT-SMAC和改良CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上挑取5個~10個典型或可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，于36℃士1℃培養18

h~24

h。必要時進行氧化酶試驗和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應呈黃色，產氣或不產氣，不產生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產生者為陽性結果，有熒光產生者為陰性結果;對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養瓊脂平板上分純，于36℃士1℃培養18

h~24

h，并進行鑒定。Fratamico等將兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，從食物增菌培養液中分離O157∶H7菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養基上，加入熒光素標記的O157∶H7抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL增菌培養液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂質體（IMB/IL）熒光試驗方法，可在8h內快速檢測出多種液態樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而傳統微生物學方法不能從陰性樣本中區分出E.coliO157∶H7感染樣本。單核細胞增生李斯特菌的檢測

傳統的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約5～14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而IMB技術的優點在于在較低的菌液濃度時也可以通過免疫磁珠的富集作用進行檢測，縮短了檢測時間并進一步降低了單增李斯特菌的檢測限。

2008年，我國將免疫磁珠檢測單核細胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗檢疫行業標準中(SN/T0184.3-2008)。檢樣25g(mL)對225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL轉種10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar顯色培養基，OXA/PALCAM瓊脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑選5個典型菌落接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養鑒定和確認試驗單增李斯特菌的檢測程序與方法1樣品制備2增菌3免疫磁珠分離((IMS）1)免疫捕獲

混增菌培養液.沉淀所有的粗糙食物殘渣.從增菌培養液中移取1mL上層液體(要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒)加人Eppendorf管中.加20μL準備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。2）分離

將Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800輕緩擺動磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的Eppendorf管管蓋,從磁極對面一側慢慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個樣品換一次槍頭;加1

mI滅菌的PBS

，并重新蓋好蓋子.將磁極從支架上移走，1800輕緩擺動磁架5次一6次,使管內各成分混合,后重新將磁極放回到支架上。重復該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開.并加100μL滅菌的PBS到管中，重懸磁珠。如實驗室沒有磁性分離器，可以用手搖代替.

4.分離培養1）分離培養吸取50μL免疫磁珠懸液.加到顯色培養基及任一選擇性培養基OXA、PALCAM瓊脂平板上.用無菌接種環劃線.35℃士1℃培養22h-48h。

2）篩選

李斯特氏菌在CHROMagar顯色培養基上菌落為藍色.且在其周圍形成一個暈環。李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長22

h后菌落呈現黑色.直徑為1mm.在其周圍形成一個黑色環。培養48h，菌落仍呈黑色.直徑2mm

--3mm.除在菌落周圍有一環外.在菌落中心部位的深層也形成黑點。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在()XA瓊脂平板上菌落相似。在CHROMagar顯色培養基及OXA或PALCAM瓊脂平板上挑取5個或更多可疑菌落.接種于TSA-YE瓊脂平板上.純培養后進鑒定。

5.鑒定和確認Skjerve等通過包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養的方法進行菌株鑒定，此法的敏感性為102～104cfu/mL樣品。Hudson等研究表明，將免疫磁珠技術與PCR結合，24h內即可檢出火腿中的單增李斯特菌。沙門氏菌的檢測Notzon等用IMB-熒光PCR檢測肉類中的沙門氏菌，實驗包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴增，12～13h即可完成檢測過程，IMB-熒光PCR在檢測自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。Blackburn等將用生物素標記的抗沙門菌多價多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達105cfu/g食物，總的檢測時間從5d減少至1~2d。復合分選：將陰性分選和陽性分選相結合的分選方法。2聚合法制備磁性微球過程以細胞分離為例圖解免疫磁珠技術的原理1%，且50%的巨核細胞具有生物活性，分離的巨核細胞超微結構保持完整，可用于巨核細胞的分子生物學等方面研究。當吸到液面通過免疫磁珠聚集物時，應放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。35℃士1℃培養22h-48h。IMB技術檢測沙門氏菌的優點捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。先將PCR雙鏈產物與生物素化的磁珠混合使兩者結合，然后進行堿性變性處理，使PCR雙股DNA成為單股DNA，可直接快速用于檢測PCR樣品中DNA或RNA分子并可進行測序。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。從增菌培養液中移取1mL上層液體(要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒)加人Eppendorf管中.將Eppendorff管按樣品和質控菌株進行編號，每個樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌免疫磁珠分離細胞及病毒示意圖此法的敏感性可達105cfu/g食物，總的檢測時間從5d減少至1~2d。簡單、快速，整個過程不到2h，可獲得較純DNA。Blackburn等將用生物素標記的抗沙門菌多價多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙門菌。檢樣免疫磁珠可以看作是親和層析技術中的微型配基，體，在基質上固相化抗體或抗原后，形成特異性吸附后，再進行磁性親和抽屜不需離心過濾，用于分離和純化相應的生物大分子。IMB技術檢測沙門氏菌的優點適用于各類食品基質中的沙門氏菌的快速檢測，能快速有效富集食品基質中的目標病原菌，且有良好的靈敏度和特異性，檢測限可達到1—10cfu/25g;在檢測時間方面可將常規檢測方法中的72小時檢測周期縮短至40小時，而且能有效減輕過程交叉污染;篩選結果既可以與常規的細菌生化和血清學聯用，也可以和顯色培養基、熒光PCR以及微生物全自動鑒定儀器等方法聯用，為食源性致病菌檢測和鑒定提供有效快速篩選技術。金黃色葡萄球菌的檢測陳伶俐等將人IgG結合到磁珠上，用該磁珠對樣品中的金黃色葡萄球菌進行快速分離檢驗。取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁場下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對照。結果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。對磁珠所涂平板的菌落進行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。應用此法分離檢驗此菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達100CFU，同時磁珠可保持活性達3周以上。副溶血性弧菌的檢測Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養基分離貝類中產TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測從環境來源的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環境及食品中產生TDH副溶血性弧菌，分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現象陽性,并產生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為03:K6。IMB技術檢測副溶血性弧菌的優點該方法與一般的細菌培養分離法相比,極大地提高了環境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMB可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,IMB為難于從環境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。其他致病菌的檢測志賀氏菌例：Islam等應用O抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠，快速檢測糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴增方法進行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯合法檢測志賀菌，較傳統的培養法敏感、快速(7h)。小腸結腸炎耶爾森氏菌例：Kapperud等用抗小腸結腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，并能將小腸結腸炎耶爾森氏菌與假結核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區別開來。十三免疫磁珠與其它檢測手段的聯用免疫磁珠與PCR的聯用

由于PCR技術靈敏度較低，將免疫磁珠技術和PCR技術相結合，建立了新的檢測系統——磁免疫PCR技術。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對樣品進行前處理，將菌進行富集裂解，再以iap基因的保守區域設計引物進行PCR，結果顯示該方法具有良好特異性，而且十分靈敏。免疫磁珠與ELISA的聯用

利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗體致敏，制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標記抗體為示蹤抗體，結合辣根過氧化物酶標親和素建立ELISA檢測系統，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結果用該方法對甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng／mL。免疫磁性捕獲ELISA檢測技術方便、快速、準確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質量控制提供一種新方法。免疫磁珠與發光檢測技術聯用

將磁珠技術與免疫熒光、放射免疫、發光免疫等相結合，可提高分析檢測的準確性和靈敏度。

免疫磁珠熒光微球十四免疫磁珠（IMB）技術在其他領域中的應用免疫檢測IMB技術在醫學領域有廣闊應用前景，它可以檢測腫瘤細胞，如骨髓中腫瘤細胞的檢測、淋巴結中腫瘤細胞的檢測。另外這種技術還可以對腫瘤進行磁導向治療和免疫磁性凈化治療。細胞分離細胞分離是免疫磁珠目前最主要應用的一個方面，傳統細胞分離技術有的比較費時，有的十分昂貴，由于免疫磁珠技術分離細胞時只需要抗體和磁鐵，既簡便靈敏又經濟快捷。如馬東初用GPⅡb/Шa血小板單克隆抗體結合磁珠分離人骨中的巨核細胞，其純度達到87.5%到97.1%，且50%的巨核細胞具有生物活性，分離的巨核細胞超微結構保持完整，可用于巨核細胞的分子生物學等方面研究。生物大分子純化

免疫磁珠可以看作是親和層析技術中的微型配基，體，在基質上固相化抗體或抗原后，形成特異性吸附后，再進行磁性親和抽屜不需離心過濾，用于分離和純化相應的生物大分子。為提純受體分子、DNA、RNA、DNA結合蛋白及mRNA等提供希望。分子生物學的應用免疫磁珠可借助親和素——生物素系統與非蛋白結合（如各種DNA、RNA大分子）。先將PCR雙鏈產物與生物素化的磁珠混合使兩者結合，然后進行堿性變性處理，使PCR雙股DNA成為單股DNA，可直接快速用于檢測PCR樣品中DNA或RNA分子并可進行測序。十五免疫磁珠技術展望優點:分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單，不需昂貴儀器設備,不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等,從而在微生物檢測方面具有很大的優勢。缺點：免疫磁珠敏感性不高，易于其他雜菌交叉反應，價格昂貴，應用受到一定限制。IMB發展的幾個方向高敏感性磁珠的制造技術降低磁珠生產成本免疫磁珠與其它檢測手段聯用技術免疫磁珠技術應用技術總的來說，免疫磁珠分離技術未來將在生物醫學、食品、農業科研、新藥開發等領域具有更加廣泛的發展前景。Thankyouattention！一磁性微球是通過一定方法將磁性無機粒子與有機高分子結合形成的具有一定磁性及特殊結構的體積在幾納米到幾十微米之間的復合微球。高分子磁性微球表面具有眾多表面功能基團，同時具有磁響應性，在外加磁場作用下具有磁導向功能。目前已廣泛用于生物醫學、細胞學和分離工程等領域。四磁性微球分離技術MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是將免疫學+細胞生物學+磁力學結合為一體，利用磁性微球表面功能基團的專一親和特性或多孔吸附特性吸附特定組分，然后用外力磁場作用將吸附了特定物質的磁珠加以分離，再經過洗脫磁珠上吸附的目標物質的一種新型分離技術，具有廣泛的用途。

幾種DNA

分離方法的比較ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

傳統法鰲合樹脂法玻璃粉法磁珠法免疫親和法DNA提取酚/氯仿等溶劑抽提Chelex100樹脂吸附玻璃粉吸附離心分離磁珠吸附磁場分離抗原抗體反應磁場分離適用范圍大多數標本DNA提取純化培養及各種臨床標本土壤標本冰凍、陳舊組織冰凍、陳舊組織，樣本含量很少的標本方法評價DNA純度高、含量多，但較費時，步驟繁瑣，用有機溶劑，有損操作者健康。可用于培養標本和各種臨床標本細菌及部分病毒核酸的提取。方法簡便，可用于土壤中細菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。簡單、快速，整個過程不到2h，可獲得較純DNA。適于少量樣本。DNA純度高，含量多，適于樣本含量少標本，單克隆抗體的制備是關鍵。免疫磁珠的性質具有均勻性、超順磁性及保護性外殼，由磁性載體微球和免疫配基結合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形狀具有均一性，可使靶物質迅速有效地結合到磁珠上，可使新生成復合物在磁場中具有相同磁響應性，且行為一致。磁珠球形結構可消