Survivin基因靶向RNA干擾重組表達載體的構建和測序【摘要】目的：利用RNA干擾(RNAi)技術，以survivin為靶基因,設計構建重組表達載體，并進行測序鑒定.方法：設計具有短發夾結構的兩條DNA序列，經退火成互補雙鏈，再克隆至載體中構建重組表達載體，轉化DH5α菌株，提取質粒行酶切鑒定后，并進行序列測定.結果：將合成的DNA序列退火后克隆到載體上，經酶切和測序鑒定確實為所需序列.結論：Survivin靶向RNA干擾重組表達載體的構建成功，可利用所得的小RNA序列干擾survivin基因的mRNA轉錄，供抗腫瘤研究參考.

【關鍵詞】survivin基因；RNA干擾；重組表達載體

0引言

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近幾年發展起來的新技術.用小片段RNA二聚體(smallinterferingRNA,siRNA)對高等哺乳動物細胞進行轉導，成功排除了長片段雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在哺乳動物細胞內引起非特異性干擾的現象，但其主要障礙是長于30nt的雙鏈RNA將激活抗病毒機制，導致非特異性的RNA轉錄降解.而體外合成21nt的siRNA能夠成功地特異性抑制哺乳動物的基因表達［1-3］.本實驗我們針對凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP)基因家族的survivin基因的短發夾結構RNA(smallhairpinRNA,shRNA)構建重組表達載體，為體外和體內抗腫瘤研究提供平臺.

1材料和方法

材料

含有人H1啟動子的pSilencer質粒為美國Ambion公司產品，由西南醫院皮膚科王繼文博士贈送.克隆用大腸桿菌DH5α由本校燒傷科實驗室董征學碩士贈送.限制性內切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4DNA連接酶、核酸分子質量標準λHindⅢdigest,DL2000均為TaKaRa公司產品.質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒均為美國Omega公司產品.

方法

基因干擾片段shRNA的設計與合成氯化鈣法制備DH5α大腸桿菌感受態細胞凍存于-70℃備用；擴增和純化質粒根據Genbank中報道的survivin基因核苷酸序列(NoNM001168)，參考shRNA設計原則進行設計［4］，最后選擇出三條片段作為survivin基因干擾片段.以間隔序列連接干擾片段正向和反向序列，兩端加酶切位點，最后得到具有回文結構和發夾結構(hairpinsiRNA)的干擾片段序列，并將其送北京賽百盛生物試劑公司合成.

表達載體的構建將每對要退火的兩條片段分別取2μL與46μL退火緩沖液混合，利用PCR儀加熱至95℃3min，然后70℃水浴,自然冷卻至室溫.用45μL的無酶去離子水稀釋5μL的退火雙鏈，使其終濃度為8mg/L.載體經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切.將退火片段與經酶切后的載體按摩爾比3∶1的比例進行連接反應，同時設立陰性對照和質粒的陽性對照反應，置16℃過夜.將連接產物各取4μL分別接種于100μL的DH5α感受態細胞中進行轉化.挑取單菌落擴增培養，質粒小量抽提試劑盒進行質粒試抽提.用限制性內切酶BglⅡ分別對重組質粒進行單酶切(此位點為目的序列所特有的酶切位點)鑒定.得到的重組質粒分別命名為,,

重組質粒測序鑒定將鑒定證實后的三個重組質粒各取1管菌液送大連寶生物工程有限公司測序.所用引物為M13+.

2結果

載體雙酶切鑒定回收酶切產物行12g/L瓊脂糖凝膠電泳后，可見環狀質粒已被切開,大片段約為kb，小片段為61bp因太小而無法檢測.

篩選重組質粒，pSilencer，pSilencer培養板上均有細菌克隆長出，形態和大小基本一致；質粒的陽性轉化對照有大量細菌克隆長出；陰性對照培養板上無細菌克隆長出，連接轉化可能成功.

單酶切鑒定重組質粒第2孔經BglⅡ單酶切的，因該質粒無此酶切位點故仍保持環狀結構；第4，6，8孔為經BglⅡ單酶切的三個重組質粒，因該重組質粒含有此酶切位點故可被酶切成線狀結構.

重組質粒測序鑒定測序結果均包含目的序列(圖3）.

3討論

腫瘤不僅是細胞增殖和分化異常的疾病，同時也是凋亡異常的疾病.腫瘤中細胞凋亡現象很可能是機體對抗腫瘤的主動措施，因此細胞凋亡在腫瘤的發生發展及治療中起著關鍵性的作用.細胞凋亡(apoptosis)受多個基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族.其中，survivin基因是IAP基因家族的新成員.1997年Ambrosini等［5］利用效應細胞蛋白酶受體1cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆得到的新基因.SurvivinN端含有一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列(BIR)分子，其中含有對抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通過這些氨基酸殘基與Caspase3和Caspase7結合抑制Caspase的活性，在COOH端有一個由40個氨基酸組成的α螺旋結構，通過α螺旋結構與細胞分裂微管結合，從而抑制細胞凋亡.Survivin基因特異性表達于人和鼠的胚胎發育組織，在終末分化的成人組織中不表達，而在轉化細胞株和人體內大多數惡性腫瘤組織中明顯表達［6］.它與細胞凋亡和增殖、腫瘤血管的生成密切相關，還參與細胞周期凋控，并影響著腫瘤的發生發展.因此，以survivin為靶點的腫瘤基因治療成為腫瘤治療研究的重要方面.

測序鑒定

抑制基因表達的方法很多，目前研究使用較多的主要有反義RNA技術、RNA干擾技術、基因敲除等.反義RNA技術的使用量較大，抑癌效率低.而RNAi則具有選擇余地大和擴增放大效應［7］，只需微量特異的dsRNA即可產生明顯的抑癌效果，具有抑制作用強、穩定性高、細胞攝取相對容易等優點.除了技術方面的差別，兩者的作用機制也不同.RNAi技術中siRNA序列選擇余地大，21~23nts中如果改變一個核苷酸，就可以使該siRNA序列不對靶向mRNA起作用，因此RNAi可以應用于單個核苷酸突變基因的抑制表達.以質粒為載體將siRNA導入細胞內，所形成的siRNA專一作用于靶向基因的細胞系可用于較長時間的功能研究［8-9］.RNAi技術與基因敲除技術相比，后者往往需要較長時間才能了解所缺失功能基因后的生物學現象，而前者則在轉染細胞48h后即可了解抑制靶向基因表達后的生物學現象.

質粒包括一種人H1RNA聚合酶Ⅲ啟動子，利用相對單一的啟動子和終止序列產生大量的小RNA.同時，位于啟動子下游的shRNA是為了在RNAi質粒進入宿主表達后，單鏈的RNA配對形成短的dsRNA，引發RNA干擾.而且，該載體中含有可供篩選的潮霉素耐藥基因和氨卞青霉素耐藥基因，利于陽性重組子的克隆篩選.因此，我們根據Genbank中報道的survivin基因核苷酸序列，參考shRNA設計原則設計出了三條阻斷survivin基因表達的RNAi序列，并成功克隆至載體，為進一步研究體內外抗腫瘤治療提供新方法.

【參考文獻】

［1］ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells［J］.Nature,2001,411(6836):494-498.

［2］CaplenNJ,ParrishS,ImaniF,etal.SpecificinhibitionofgeneexpressionbysmalldoublestrandedRNAsininvertebratesystems［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(17):9742-9747.

［3］ElbashirSM,MartinezJ,PatkaniowskaA,etal.FunctionalanatomyofsiRNAsformediatingefficientRNAiinDrosophilamelanogasterembryolysate［J］.EMBOJ,2001,20(23):6877-6888.

［4］TuschlT,ZamorePD,LehmannR,etal.TargetedmRNAdegradationbydoublestrandedRNAinvitro［J］.GenesDev,1999,13(24):3191-3197.

［5］AmbrosiniG,AdidaC,AltieriDC.Anovelantiapoptosisgene,surviving,expressedincancerandlymphoma［J］.NatMed,1997,3(8):917.

［6］AdidaC,CrottyPL,McGrathJ,etal.Developmentallyregulatedexpressionofthenovelcancerantiapoptosisgenesurvivinginhumanandmousedifferentiation［J］.AmJPathol,1998,152(1):43.

［7］SuiGH,SoohooC,ShiY,etal.ADNAvectorbasedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(8):5515-5520.

［8］MelloCC,ConteDJr.RevealingtheworldofRNAinterference［J］.Nature,2004,431(7006):33