反相高效液相色譜法測(cè)定巖黃連藥材中巖黃連堿的含量【摘要】目的建立巖黃連藥材中巖黃連堿的含量測(cè)定方法。方法采用反相高效液相色譜法，以乙腈∶水為流動(dòng)相，流速為1ml/min,檢測(cè)波長為347nm，柱溫20℃，進(jìn)樣量為20μl,外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果巖黃連堿在4～μg內(nèi)峰面積與對(duì)照品的進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=2×106X-5(r=98)。平均回收率分別為%,%,%，RSD分別為%，%，%。結(jié)論所建立的RP-HPLC含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。為控制藥材巖黃連質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】巖黃連堿反相高效液相色譜法

Abstract：ObjectiveTodevelopanewmethodfordeterminationofthecontentofdehydrocavidineinCorydalissaxicolacontentofdehydrocavidineinC.saxicolaBuntingwasdeterminedbyRP-HPLC，usingacetonitrile-water(V∶V＝50∶50,％potassiumdihydrogenphosphateand%sodiumlaurylsulfate)asmobilephase,1ml/min,with347nmofdetectionwavelength,thetemperaturewas20℃.Theinjectionvolumewas20μlandtheexternalstandardwasused.ResultsThelinearrangewaswithin4～μgandthecorrelationcofficientwasaveragerecoveryandRSDwere%，%，%and%，%，%,methodissimple,accurate,specificandprecised.ItissuitableforthethequalitycontroloftheCorydalissaxicolaBunting.

Keywords：Dehydrocavidine;RP-HPLC

巖黃連CorydalissaxicolaBunting，又名石生黃堇，紫堇科紫堇屬多年草本植物［1～3］。具有顯著的抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和安定作用，是桂西北山區(qū)常用消炎止痛、排毒、治療急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一種中草藥［2，3］，其化學(xué)成分含有［4］：脫氫卡維丁(dehydrocavidine),小檗堿，(±)cavidine，(±)thalictrifoline,dehydrocavidine，(-)13β-hydroxystilopine，(+)四氫巴馬汀［(±)tetrahydropalmatine］，(-)斯庫來堿［(-)scoulerine］，白屈菜紅堿，(-)四氫非洲防己胺［(-)tetrahydrocolumbamine］，原阿片堿,卡維丁,延胡索甲素等多種生物堿，其主要活性成分為巖黃連堿，生物堿含量高低直接影響藥材質(zhì)量和療效。巖黃連植物分布局限于石灰?guī)r山區(qū)，屬石山特有種［3］。目前，國內(nèi)外對(duì)巖黃連的研究主要集中在巖黃連總生物堿的成分分析［5］，引種栽培［2～6］和藥理作用［7～10］的研究，而對(duì)不同地區(qū)的巖黃連中巖黃連堿含量差異的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要建立了巖黃連中巖黃連堿含量測(cè)定方法，并對(duì)不同地區(qū)的巖黃連中巖黃連堿含量進(jìn)行測(cè)定，為巖黃連質(zhì)量考查提供參考，這對(duì)于指導(dǎo)巖黃連的標(biāo)準(zhǔn)化種植及合理采收具有重要意義。

1儀器與試藥

儀器LC-9000D高效液相色譜儀，SartoriusME215S(德國賽多利斯)電子天平，B3200S超聲處理器,RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

試劑乙腈(色譜純,美國TEDIA公司,Lot506126),甲醇(色譜純,天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，磷酸二氫鉀，十二烷基硫酸鈉，水為高純水，HCl,氨水，氯仿。

試藥巖黃連堿對(duì)照品；藥材巖黃連供試品。

2方法與結(jié)果

色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈∶水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為347nm，理論塔板數(shù)按巖黃連堿峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取巖黃連堿對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每毫升含25μg巖黃連堿的溶液，即得。

供試品溶液的制備取本品約10g，剪碎，加入20倍量1％HCl溶液，煎煮30min，取水提液，藥渣再重復(fù)上一步驟，過濾，合并兩次水提液，加氨水調(diào)pH至10，析出沉淀，過濾得清膏，80℃干燥2h，加入20倍量氯仿回流提取30min，過濾，得黃綠色澄清液體，將濾液減壓蒸餾，揮干氯仿，精密加入ml流動(dòng)相超聲溶解，μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，稀釋25倍(取1ml用流動(dòng)相定容至25ml容量瓶)，即得。

陰性對(duì)照溶液的制備以項(xiàng)的流動(dòng)相為陰性對(duì)照溶液。

陰性干擾實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μl注入液相色譜儀中，色譜圖見圖1。由色譜圖可知，在與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰出現(xiàn)，而陰性液在此峰位無吸收，對(duì)本品中巖黃連堿的測(cè)定無干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定稱取巖黃連堿mg，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。吸取上述對(duì)照品貯備溶液，，，，ml，分別置ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別作為對(duì)照品溶液(濃度分別為，，，，μg/ml）,按色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定(進(jìn)樣量20μl)。以巖黃連堿對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則回歸方程為：

Y=2×106X-5(r=98)

結(jié)果表明：當(dāng)進(jìn)樣量在4～μg范圍內(nèi)時(shí)，巖黃連堿進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照品的HPLC圖

表1線性關(guān)系

圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密度實(shí)驗(yàn)取“”項(xiàng)下對(duì)照品，分別連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果巖黃連堿峰面積值的RSD小于2%。結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)表明，本法的精密度良好。

表2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密量取同一供試品(東蘭縣隘洞鎮(zhèn)拉板村)9份，按“”項(xiàng)方法操作，分別進(jìn)樣20μl，測(cè)得巖黃連堿色譜峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果見表3。

表3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一份供試品溶液(東蘭縣隘洞鎮(zhèn)拉板村)，每隔一定時(shí)間測(cè)定1次，共測(cè)定5次。結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)表明，在12h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。

表4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率實(shí)驗(yàn)稱取巖黃連堿對(duì)照品約10mg，精密稱定,置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按“”項(xiàng)下方法制備已知含量樣品(東蘭縣隘洞鎮(zhèn)拉板村)，分別加入上述巖黃連堿對(duì)照品溶液，，ml，按擬訂的方法制備供試品溶液，共平行制備9份，分別進(jìn)樣測(cè)定，按下式計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。

回收率=測(cè)得量-樣品量加入對(duì)照品量×100%

表5加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果見表6。

表6巖黃連藥材含量測(cè)定

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用巖黃連堿為季胺類生物堿，極性較大，用普通的離子抑制色譜法無法達(dá)到良好的分離。因此采用了離子對(duì)色譜法，加入十二烷基硫酸鈉作為離子對(duì)試劑，抑制其解離，能達(dá)到良好的分離效果。最后我們發(fā)現(xiàn)以乙腈－水為流動(dòng)相，改變流動(dòng)相配比進(jìn)行最佳流動(dòng)相的選擇，結(jié)果表明，巖黃連堿在乙腈∶水為流動(dòng)相與相鄰組分峰分離度R1．5，達(dá)到分離要求，能完全滿足色譜峰定量要求。

不同產(chǎn)地藥材含量測(cè)定結(jié)果表明，東蘭縣達(dá)文村示范基地所產(chǎn)巖黃連中巖黃連堿含量最高，東蘭縣隘洞鎮(zhèn)拉板村所產(chǎn)含量次之，而東蘭縣蘭木鄉(xiāng)同仕村所產(chǎn)含量最低。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的酸提堿沉法提取巖黃連中巖黃連堿，制成清膏后采用甲醇、醋酸乙酯和氯仿進(jìn)行回流提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氯仿回流其提取率大于用乙醇、醋酸乙酯提取，最后采用了氯仿作為提取溶劑。

【參考文獻(xiàn)】

［1］何金祥．巖黃連莖基腐病的分離鑒定及防治［J］.廣西植物，2003,23(5)：473．

［2］蔣水元，胡興華，趙瑞峰．巖黃連引種栽培研究［J］.廣西植物，2002，22(5)：469．

［3］文和群，許兆然，，等．中國南部石灰?guī)r稀有瀕危植物名錄［J］.廣西植物，1993，13(2)：110．

［4］柯珉珉．巖黃連有效成分的研究［J］.藥學(xué)通報(bào)，1980：15(6)：41．

［5］柯珉珉，張憲德，吳練中，等．巖黃連有效成分的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1982，24(3)：289．

［6］陳祖強(qiáng)．廣西栽培與野生巖黃連的質(zhì)量比較研究［J］.廣西植物，1993，13(2)：188．

［7］陳重陽，趙一