1裂解法提取質粒細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現在習慣上用來專(plasmid)。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進細類：于質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬松弛型。I2表達、純化和檢測為一體的整合系統。具有以下優點：有一個可以用化學物質 i宿主中；一個AmpiR基因以便于陽性克隆的篩選。DNA分子體外構建完成后，必須導入特定的宿主(受是所謂的感受態，即指受體(或者宿主)最易接受外源DNA片段并實現其轉3或-70℃保存(有效期6個月)。3.轉化:是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀化學的方法(熱擊法)；使用化學試劑(如CaCl)制備的感受態細胞，通過熱擊：4其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發生了從bilayer(雙層膜)結構向micelle (微囊)結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4NNaOH，即便是有SDS也無 5A(比如限制性酶切反應)，因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水會干擾電泳結果的。6超螺旋(超螺旋的圈數不同)所致。．大腸桿菌感受態細胞的制備(可臨用前準備，也可制備多管加甘油凍存(1)從新鮮的DH5α菌株平板上挑取一個單菌落，(接種到4mlLB液體培養lLB(4)棄上清，加入預冷的0.1MCaCl1ml后旋起菌體(在渦旋器上振蕩)，2(5)5，000rpm離心10min后棄上清，加入預冷的0.1MCaCl100ul。2(6)溫和混勻后4℃放置24-48h備用。(1)取制備好的感受態菌體，加入質粒5ul(可變)。s(3)取出后再冰浴5min；加入800ulLB液體培養基。(5)取10ul培養物涂布于含有抗生素的LB(由質粒的抗性決定)，37℃倒置7夾取100ul的吸頭挑取單菌落，之后把帶有菌落的吸頭放入帶有抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養3小時，記得加抗生素)。(在冰上)(6)向每個離心管中各加入150ul溶液Ⅲ，緩慢倒轉幾次混勻。(在冰上)(7)12，000rpm離心10min，轉移上清至一新離心管中。in(9)吸取上清(注意不要吸到中間層)到1.5ml離心管中，加入2倍體積預注：一般在第二步離心收集完菌體后再加入1mlSTE，充分洗滌菌體，12，000rpm，離心1~2min。泳脂糖具有多孔的網狀結構，不同大小的核酸分子利用凝膠的分子篩效應得以分8沸騰后拿出錐形瓶(注意不要燙住手)，用吸取50ul的EB(1：1000)加入錐形lTAE(3)待膠板放進電泳槽后向電泳槽內加入配好的電泳液，高度漫過膠板(4)點樣：拿出裁成長條的稱量紙光面向上(或一次性手套，)用10ul移液器吸取3ul的質粒，打在稱量紙上，再用10ul移液器吸取2ul的上樣緩沖液(5)電泳：接通電源，電壓設定在80v(可變)，開始電泳。(6)凝膠系統成相：等到指示劑快跑到膠板前沿時關閉電源，拿出膠板，通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。瓊脂脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1實驗指南)9(1)使用了過多的細菌，導致菌體未被有效裂解。解決方法：將細菌用(2)細菌懸浮不充分,存留小菌塊,導致菌體未被有效裂解。解決方法：注意多翻轉幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉(5)SolutionII長時間暴露于空氣中被CO2中和，導致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用經典堿裂解法抽提質粒DNA方法中的II液替代SolutionI使I用。(1)未在SolutionI中事先加入RNaseA1。解決方法：補加RNaseA1。(2)加入RNaseA1的SolutionI長期保存于室溫，導致RNaseA1活性RNaseARNA將細菌用量減半(2)宿主菌富含核酸內切酶。解決方法：增加一步RinseA洗滌步驟以(4)培養的細菌被雜菌污染。解決方法：重新挑取單菌落培養細菌。(2