第十四章螺旋體（Spirochaete）概述定義：是一類細長，柔軟，螺旋狀，運動活潑的原核細胞型微生物。結構：與細菌相似，如有細胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，對抗生素敏感等，但無鞭毛。分布：存在于水、土壤、腐敗有機物；寄生于動植物、正常人口腔、正常陰道偶見。致病性螺旋體：主要有鉤端螺旋體屬、疏螺旋體屬、密螺旋體屬等3個屬。A密螺旋體屬

B鉤端螺旋體屬C疏螺旋體屬第一節鉤端螺旋體(Leptospira)

螺旋細密和規則(有幾十個)，一端/兩端彎曲使菌體呈鉤狀故名鉤端螺旋體。問號鉤端螺旋體：致病性。雙曲鉤端螺旋體：非致病性。一、微生物特性(一)形態染色G－，但不易著色。常用Fontana鍍銀染色法，被染成棕褐色。暗視野顯微鏡下可見活潑運動、折光性強而成白色的鉤端螺旋體。軸絲緊緊纏繞在原生質圓柱體表面呈螺旋狀，使鉤端螺旋體活潑地沿長軸旋轉運動。鉤端螺旋體(二)培養特性營養要求較高，常用含10％兔血清的柯索夫（Korthof）培養基（兔血清除促進鉤端螺旋體生長外，尚有中和代謝產物毒性的作用）。最適生長溫度為28℃～30℃，最適pH為7.2～7.6。人工培養基中生長緩慢。在液體培養基中，分裂一次需8～lOh，培養一周左右，呈現為半透明云霧狀生長（液面1cm的部位最豐富），但菌數僅相當于普通細菌的1/10—1/100。(三)分類

(1)抗原分類屬特異性蛋白抗原——只存在于鉤體屬中群特異性抗原——脂多糖型特異性抗原——多糖蛋白復合物根據抗原性不同問號鉤體分25個血清群、273個血清型。我國已發現致病性鉤體至少19群，74型。我國目前使用的問號鉤端螺旋體參考株有14群15型。

(2)DNA分類：問號狀鉤體分7個基因種血清學分群和分型應用顯微鏡凝集試驗和凝集素吸收試驗，問號狀鉤端螺旋體可分為25個血清群、273個血清型，其中我國至少存在19個血清群、74個血清型。我國目前使用的問號鉤端螺旋體參考株有14群15型。(四)抵抗力

對熱抵抗力弱，60℃、1min即死亡。0.2％來蘇、l：2000升汞、1％石炭酸經10～30min被殺滅。對青霉素敏感。鉤端螺旋體在夏秋季酸堿度中性的濕土或水中可存活20天以上，甚至數月之久，這在本菌的傳播上有重要意義。二、致病性與免疫性

引起人畜共患病，鼠類和豬是儲存宿主。傳染源和儲存宿主：鼠類、豬等。動物感染->多不發病->在腎臟長期繁殖->尿->排出->污染土壤和水源(疫水、疫土)。傳播途徑：－接觸疫水、疫土經口、皮膚粘膜感染。致病物質：溶血素－>溶血；細胞毒因子；內毒素樣物質二、致病性與免疫性

所致疾病：引起鉤端螺旋體病。鉤體可穿透完整皮膚粘膜侵入機體，并引起鉤體血癥，產生如內毒素等物質，出現發熱、頭痛、肌痛、眼結膜充血等中毒癥狀，患者有全身毛細血管損傷和微循環障礙，并引起CNS、心、肺、肝腎功能損害。感染后2周螺旋體可隨尿液排出。二、致病性與免疫性

臨床類型：由于血清型、毒力數量不同以及免疫水平差異，有以下類型①流感傷寒型；②黃疽出血型；③肺出血型；④腦膜腦炎型；⑤腎功能衰竭型；⑥胃腸炎型等類型。臨床類型：①黃疸出血型又稱外爾病(Well'sdiscase)

敗血癥、出血、黃疸與肝腎損害等。②流感傷寒型又稱沼澤熱(marshfever)

如流感或傷寒，較輕，內臟損害較少。出血是鉤體病最常見的臨床表現。免疫性

對同一血清型有牢固免疫力，主要為體液免疫。特異性抗體(

1～2w):調理，吞噬增強血流中:被清除腎臟內:不易被清除->尿中排菌:數周、數月、數年三、微生物學檢查標本采集直接檢查暗視野顯微鏡:活菌鍍銀染色:死菌分離培養：Korthof培養基培養動物試驗：豚鼠血清學試驗：查抗體1、標本采集鉤端螺旋體可從臨床標本、攜帶者和自然界的水中分離獲得。標本采集包括血液（發病1周）、尿（2周）和腦脊液（腦膜刺激癥），發病早期(1周內)血液的陽性率高，1周后尿和腦脊液等的陽性率高。感染6～10天取血可檢出抗體，在病程第3或4周達最高水平，此后抗體水平逐漸下降，血清學診斷則需在病程早期及恢復期分別采集血清，作雙份血清試驗。2、標本直接檢查

1．取急性期病人血以4000r／min離心45-60min，取1滴沉淀物置玻片上，加蓋玻片后作暗視野檢查。也可用Fontana

鍍銀染色法染色后觀察。2．核酸檢測采用同位素或生物素、地高辛標記的特異DNA探針法，檢出標本中鉤端螺旋體的核酸，較培養法快速、敏感。若先用PCR技術先行擴增，再用探針確定，則敏感度更加提高。3、分離培養

取鉤端螺旋體血癥期的病人血液2ml或發病后第2周的無菌弱堿性尿沉渣接種于Korthof培養基中，28℃孵育，因系需氧生長，故靠近培養液面呈半透明霧狀混濁。取培養物作暗視野檢查，觀察有無螺旋體生長。連續觀察30d，如無生長方判為陰性4、動物試驗動物是分離鉤端螺旋體的敏感方法，尤其適用于有雜菌污染的標本。方法是將標本接種于幼齡豚鼠或金地鼠腹腔。接種3～5d后，可用暗視野顯微鏡檢查腹腔液；亦可在接種后3～6d取心血檢查并作分離培養。動物死后解剖，可見皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾臟器中有大量鉤端螺旋體存在。5、抗體檢測1）、顯微鏡凝集試驗是常用的方法。(1)抗原制備：取標準菌株4—7天的培養物，每視野50～60條活鉤端螺旋體。(2)方法與結果：取病人血清以56℃，30min滅活后稀釋，每個稀釋度0．1ml血清中加入等量活菌抗原，30℃2h后，取1滴覆蓋玻片，暗視野顯微鏡下若有抗體存在，則鉤體凝集成團，數減少，菌體溶解。結果判定：50％以上菌體凝集或溶解為“2+”為血清效價。達1：300以上才有診斷意義或效價增高4倍以上，則可確診本病。還可作鉤體的定群、定型試驗。顯微鏡凝集試驗2）、酶聯免疫吸附試驗用ELISA法和IgM斑點-ELISA法等間接檢測鉤體病人血清中特異性抗體，用于該病的快速診斷。包被抗原用鉤端螺旋體培養物經超聲波破碎，15000r／min離心20min，用于包被的抗原濃度以20μg／ml為好。被檢血清OD值為陰性對照的2倍，即為陽性。四、防治原則

預防:防鼠、滅鼠家畜管理保護水源預防接種:死疫苗治療:青霉素、安比西林、慶大霉素、強力霉素等

第二節密螺旋體屬螺旋細密、規則兩端尖，數目多；包括致病性和非致病性兩大類。致病密螺旋體有蒼白和品他密螺旋體兩個種。蒼白密螺旋體又分3個亞種：蒼白亞種、地方亞種和極細亞種，它們分別引起梅毒、是性傳播疾病。地方性梅毒通過污染餐具傳染，雅司病經直接接觸患者皮膚受損部位而傳染，二者的臨床癥狀與梅毒相似，但不是性傳播疾病。品他密螺旋體引起人類品他病。一、梅毒螺旋體引起梅毒。人是惟一傳染源。先天性梅毒：通過胎盤由母體傳染胎兒，獲得性梅毒：經性接觸傳播。也可經輸血引起。（一）所致疾病獲得性梅毒，臨床上分為三期：Ⅰ期：感染后3周左右局部出現無痛性硬下疳。多見于外生殖器；感染性極強。Ⅱ期：發生于硬下疳出現后2~8周。全身皮膚、粘膜常有梅毒疹，全身淋巴結腫大；Ⅲ期：發生感染2年后，病變可損害全身組織和器官。基本損害為慢性肉芽腫，病損內螺旋體少但破壞性大。Ⅰ期（初期）梅毒：硬下疳Ⅱ期梅毒:梅毒疹Ⅱ期梅毒：梅毒疹Ⅲ期梅毒的潰瘍、壞死所致疾病先天性梅毒－又稱胎傳梅毒。引起胎兒全身性感染，多發于妊娠4個月之后。導致流產或死胎；呈現馬鞍鼻、先天性耳聾等特殊體征。先天性梅毒——鋸齒形牙（二）微生物特性

1．形態與染色有8～14個致密規則小螺旋，兩端尖直運動活潑，G-，但不易著染。Fontana鍍銀染成棕褐色。在光鏡下易于查見。在暗視野顯微鏡下，可觀察標本形態和運動方式。密螺旋體蒼白亞種

暗視野×40002.電鏡下觀察，有細胞壁和細胞膜。細胞壁外有包膜，細胞膜內為含細胞質和核質的螺旋形原生質圓柱體。繞著3—4根周漿鞭毛或內鞭毛，與運動有關。3.不能在無活細胞的人工培養基中生長繁殖。將Nichols有毒株接種家兔的睪丸,緩慢增殖,將其轉種含多種氨基酸的兔睪丸組織中,可失去致病力,稱Reiter株。4.抵抗力極弱。對溫度和干燥特別敏感，4℃3天死亡。保存4℃3天血液就無傳染梅毒的危險。梅毒螺旋體檢驗1.直接顯微鏡檢查

初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒疹、病灶滲出物或局部淋巴結穿刺液，將上述檢材置于玻片上用暗視野顯微鏡檢查，如見有呈現運動活潑，沿其長軸滾動、屈伸、旋轉、前后移行等的螺旋體即有診斷意義。2.核酸檢測用PCR技術直接檢測:臨床標本中梅毒螺旋體的特異性DNA片段，用于檢測的引物和探針是編碼外膜蛋白4．7kD的基因，其擴增產物經斑點印跡，或電泳以Southern印跡法鑒定。3.抗體檢測

(1)非密螺旋體抗原試驗（非特異性抗體檢測）多用牛心肌的心脂質（作為抗原，測定病人血清中的反應素（抗脂質抗體）。初期梅毒病灶出現后1-2周時，陽性率為53％～83％，二期梅毒的陽性率可達100％，晚期梅毒的陽性率58％-85％，胎傳梅毒的陽性率為80％-100％。1)性病研究所實驗室

(VDRL)玻片試驗所用VDRL抗原(0．03％心擬脂、0．21％卵磷脂、0．9％膽固醇，用無水乙醇配制)0．3ml加入裝有0．3ml緩沖鹽水的小瓶內(10—15ml容積)，加塞混勻。再加2．4ml緩沖鹽水即為抗原懸液，待檢血清經56℃30min滅活，滴加于玻片的漆圈內加等量抗原液，搖轉玻片5min充分混勻反應后觀察結果。有大片絮狀凝聚物為(3+)，中等凝聚物為(2+)，細小凝聚物為(+)，液體混濁為(—)。2)快速血漿反應素環狀

卡片試驗(RPR)用活性炭顆粒吸附VDRL抗原。與反應素結合形成黑色凝集塊，可肉眼觀察結果。取待檢血清加于環狀卡圓圈內，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋轉搖勻8min，觀察結果。在白色底板出現明顯黑色凝集顆粒為陽性，試驗結果用肉眼很容易判斷，不需顯微鏡，也易于推廣。以上兩實驗用于梅毒的初篩實驗(2)密螺旋體抗原試驗用密螺旋體抗原檢測病人血清中特異性抗體，由于梅毒螺旋體、雅司螺旋體等抗原性相似，所以用血清學試驗不可能區別這些密螺旋體及其所致疾病。

1)熒光密螺旋體抗體

吸收試驗(FTA-ABS)

先用吸收劑去除病人血清非特異性抗體，提高特異性，稀釋成不同稀釋度，加于預先涂有梅毒螺旋體抗原的玻片上，置濕盒內，37℃孵育30min，洗片后再用熒光素標記的羊抗人丙球蛋白抗體，在熒光顯微鏡下觀察。陽性者可見發熒光的梅毒螺旋體。FTA-ABS試驗具高度特異性和敏感性，在第一期梅毒的頭幾天就可測出特異性抗體。

2)梅毒螺旋體熒光抗體

雙染色試驗(FTA—ABS-DS)

用Nichol株梅毒螺旋體作抗原，用四甲基異硫氰酸若丹明結合的抗人球蛋白抗血清及異硫氰酸熒光素(FITC)結合的抗梅毒螺旋體球蛋白雙重染色，用間接免疫熒光技術檢測血清中的抗TPlgG抗體。FTA-ABS-DS法無論對早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特異性，且陽性出現時間早。一期梅毒陽性率達90％，晚期梅毒的陽性率為95％。對確診病人的敏感性和特異性分別為91．7％和92．o％，但技術要求較高，且較費時費錢，因此多用于實驗室試驗。3)抗梅毒螺旋體抗體的微量

血凝檢測(MHA-TP)

用抗原致敏紅細胞作間接血凝試驗是檢測抗體最簡易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋體(Nichols株)提取物去致敏經醛化處理的綿羊紅細胞，病人的血清先與非致病性Reiter細胞結合。血清若含有抗體則與這些細胞反應形成平鋪孔底的凝集；用非致敏紅細胞作對照，以除外非特異性凝集。4)ELISA用Nichols株為抗原，以超聲波擊碎。此法可用于各期梅毒診斷，靈敏度為96％，對感染血清靈敏度為95％。與熒光抗體雙吸收法(FTA-ABS-DS)比較，兩法符合率為96％。ELISA試劑具有價廉、保存時間久且穩定(4個月)等優點，是目前梅毒血清學診斷試驗的首選方法。

5)免疫印跡試驗

(immuno-blottingtest)將梅毒螺旋體抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)后，再將凝膠中的抗原經電轉移至硝酸纖維薄膜上，將膜切成1．5mm寬小條。試驗時加病人血清20μl(1：100稀釋)，置搖床上室溫過夜，次日用洗滌液洗3次后，加辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗血清(1：500稀釋)，室溫作用1小時后，加底物顯色5min后用蒸餾水沖洗，終止反應。出現藍色區帶為陽性。WHO推薦用VDRL、RPR法對血清進行過篩試驗，出現陽性者用FTA-ABS、FTA-ABS-DS、MHA-TP、ELISA和免疫印跡試驗等方法做確認試驗。先天梅毒很難診斷，可用RPR半定量試驗每月檢測1次，連續6個月，檢測反應素效價，或用VDRL定量試驗查抗體效價變化。如效價增高或穩定在高水平，表明是先天梅毒。如抗體是來自母體lgG，通常在2～3月內消失。二、其他密螺旋體有蒼白密螺旋體地方亞種、極細亞種以及品他密螺旋體，分別引起地方性梅毒、雅司和品他病。大多發生于經濟較落后地區的兒童。微生物學檢查，可從皮膚標本直接在暗視野顯微鏡下觀察有無密螺旋體。也可用血清學試驗檢測血清中有無相應抗體。由于與梅毒病原體形態、抗原結構，DNA同源性基本相同，無法區別。因此，查到密螺旋體及血清試驗陽性只能診斷為密螺旋體感染，還必須結合臨床表現確定。第三節疏螺旋體屬

有3～10個稀疏而不規則的螺旋，運動活潑。對人致病的主要有伯氏疏螺旋體、回歸熱螺旋體、奮森螺旋體等。一、伯氏疏螺旋體是萊姆病的主要病原體，1977年在美國萊姆鎮發現，從硬蜱及患者體內分離出伯氏疏螺旋休。1985年我國在黑龍江省林區首次發現萊姆病，1988年從病人血液中分離出病原體，迄今已有十多個省和自治區證實有萊姆病存在。傳播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋體可在蜱的中腸生繁殖，叮咬時使宿主感染。經3～30d潛伏期，在叮咬部位可出現慢性移行性紅斑。經2-3周，皮損消退，留有斑痕與色素沉著。早期癥狀有頭痛發熱、肌痛等。80％未經治療的可發展至慢性關節炎、慢性神經系統異常，嚴重者可同時出現皮膚、神經、關節、心等多臟器損害。硬蜱萊姆病Lymedisease游走性紅斑微生物特性

1．疏螺旋體，兩端稍尖。運動活潑，在培養基中，不規則地纏繞一起，呈卷圈狀。周漿鞭毛數不等。與運動有關。Ｇ-易著色。

Giemsa或Wright染色均佳。2．抗原成分主要的有鞭毛蛋白(40kＤ)、外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致病原之一。3.營養要求高，培養基需含有長鏈飽和與不飽和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和血清蛋白等。微需氧，5％—10％C02促進生長。適宜溫度為35℃。生長慢，1代需18h，需培養1～3周觀察到生長情況。伯氏疏螺旋體

微生物檢驗

1．標本采集早期取病損皮膚組織、淋巴結抽出液、血液。2.直接用暗視野顯微鏡，觀察關節滑膜液、腦脊液、尿液等標本中螺旋體的形態和運動，因數量太少，故在實驗室診斷中價值不大。用于蜱內臟組織檢查,檢出率較高。

3.核酸檢測

用PCR技術檢查DNA:方法快速、敏感性高，用已知引物，以標本中螺旋體質粒DNA片段為模板，擴增后形成309bp的DNA分子(是編碼OspA的基因片段)，經瓊脂糖電泳證實。此DNA分子在所有伯氏疏螺旋體菌株中均可被檢出，而其他菌種則為陰性。4.分離培養標本接種在BSK復合培養基中，33℃孵育。BSK培養基是含有牛血清白蛋白(BSA)和熱滅活兔血清等營養豐富的液體培養基，通常從感染的脾中分離螺旋體較易，而從損傷皮膚中分離較難。因分裂1代需12h以上，需培養2-3周可觀察生長情況。5.抗體檢測間接免疫熒光法(IFA)：將螺旋體在BSK中培養5-7天，離心8200rpm30min收集螺旋體，稀釋至200個螺旋體／高倍鏡視野。取20μl懸液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待檢血清以PBS倍比稀釋，加于玻片10～15μl稀釋血清，濕盒內37℃孵育30min，洗后加熒光素標記抗人IgG。IFA操作簡便實用，但類風濕性關節炎和其他螺旋體病可