第十七章

病毒檢驗技術1ppt課件本章內容

第一節標本的采集、處理與運送

1第二節病毒的分離與鑒定2第三節病毒學檢測及診斷32ppt課件學習目標及重點

學習目標：掌握病毒標本采集和送檢應遵循的原則；病毒檢驗鑒定常用技術熟悉病毒血清學診斷常用的方法了解病毒感染的實驗室快速診斷學會病毒的培養基本操作本章重點：★病毒標本采集和運送原則。★病毒學診斷及鑒定常用方法。★病毒培養的基本操作。3ppt課件第一節標本的采集、處理與運送

一、標本的采集與處理1.采集時間：發病早期或急性期盡快采集。2.采集部位：取決于臨床癥狀和所懷疑感染的病毒。

如：流感病毒感染------鼻咽拭子

乙型腦炎病毒感染------腦脊液

輪狀病毒感染------糞便

乙型肝炎病毒感染------血液3.采集方法與處理

提高病毒的分離率，防止標本污染。采集時無菌操作,可加入抗生素以殺死雜菌4ppt課件二、標本的運送與保存

1.標本的運送盡快送檢冷凍、冷藏運輸防漏、專人、標記2.標本的保存-70℃可較長時間保存可加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一節標本的采集、處理與運送

返回章內容5ppt課件一、病毒的分離培養

2.雞胚培養

第二節病毒的分離與鑒定原代細胞培養二倍體細胞培養傳代細胞

羊膜腔接種尿囊腔接種卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種組織細胞培養

雞胚培養

動物接種6ppt課件1.組織細胞培養

雞成纖維細胞Hep-2細胞細胞培養瓶Vero細胞第二節病毒的分離與鑒定7ppt課件8一般選用9～14d的雞胚來源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細菌、對接種病毒不產生抗體及病毒較易增殖等2.雞胚培養優點：第二節病毒的分離與鑒定8ppt課件選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關鍵常用的主要有：

尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種2.雞胚培養第二節病毒的分離與鑒定9ppt課件2.雞胚培養尿囊腔接種羊膜腔接種尿囊腔羊膜腔常用接種途徑：

尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應和傳代培養常用于臨床流感病毒初次分離第二節病毒的分離與鑒定10ppt課件卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊絨毛尿囊膜人工氣室羊膜腔氣室絨毛尿囊膜尿囊腔

卵白2.雞胚培養主要用于蟲媒病毒、衣原體及立克次體的分離和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離卵黃囊第二節病毒的分離與鑒定11ppt課件3.動物接種常用的實驗動物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等常用的接種途徑包括皮下、皮內、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內接種等方式第二節病毒的分離與鑒定12ppt課件二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細胞內增殖的鑒定指標1．細胞形態的改變2．紅細胞吸附3．細胞培養液pH值改變（二）病毒數量及病毒感染性測定1．血凝試驗2．中和試驗3．空斑形成試驗4．半數感染量（ID50）和組織培養半數感染量（TCID50）

第二節病毒的分離與鑒定13ppt課件二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細胞內增殖的鑒定指標

1．細胞形態的改變（1）細胞病變效應（cytophathiceffect，CPE）第二節病毒的分離與鑒定14ppt課件正常細胞病變細胞是指某些病毒特別是無包膜的病毒感染組織細胞后，正常生長的梭形細胞變圓、變性、壞死、溶解及從培養瓶壁脫落，細胞堆積形成葡萄狀第二節病毒的分離與鑒定15ppt課件（2）多核巨細胞1．細胞形態的改變多見于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染細胞融合而成多核巨細胞第二節病毒的分離與鑒定16ppt課件（3）包涵體1．細胞形態的改變

某些病毒感染宿主細胞后，細胞內出現一種光學顯微鏡下可見的蛋白質結構，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆粒或尚未裝配的病毒亞基聚集而成，稱為包涵體。第二節病毒的分離與鑒定17ppt課件2．紅細胞吸附3．細胞培養液pH值改變二、病毒增殖的觀察病毒感染細胞后，可使細胞的代謝發生變化，導致培養液pH值改變。第二節病毒的分離與鑒定18ppt課件（二）病毒數量及病毒感染性測定二、病毒增殖的觀察1．血凝試驗病毒顆粒紅細胞

某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳動物的紅細胞發生凝集，將這類病毒感染細胞后收集的病毒液作不同稀釋，以發生血凝反應的病毒液的最高稀釋度作為該病毒的血凝效價（即滴度），可對病毒含量進行半定量測定。血凝現象第二節病毒的分離與鑒定19ppt課件能使紅細胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數為該病毒的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）第二節病毒的分離與鑒定20ppt課件病毒顆粒紅細胞病毒抗體

血凝抑制試驗病毒液中若先加入病毒的特異性抗體，抗體與病毒表面的抗原特異性結合，從而抑制病毒與紅細胞的血凝現象，稱為血凝抑制試驗。第二節病毒的分離與鑒定21ppt課件2．中和試驗（Nt）

在體外孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應，再將混合物接種到敏感的宿主體內，經培養后觀察CPE或紅細胞吸附現象是否消失，即特異性抗體是否中和相應病毒，從而測定殘存的病毒感染力的一種方法3．空斑形成試驗第二節病毒的分離與鑒定22ppt課件4．半數感染量（ID50）和組織培養半數感染量（TCID50）測定病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起50%死亡或病變的最小量。用來估計病毒感染的強弱程度，但不能準確測定感染性病毒顆粒的多少返回章內容第二節病毒的分離與鑒定23ppt課件

第三節病毒學檢測及診斷一、形態學檢查及診斷

1.

光學顯微鏡檢查：

*直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒）

*包涵體狂犬病毒感染------嗜酸性包涵體

巨細胞病毒感染---“貓頭鷹眼”狀的嗜酸性包涵體

24ppt課件2.電子顯微鏡檢查：

*透射電子顯微鏡

用于觀察病毒的大小、形態與結構及細胞內的超微結構等*掃描電子顯微鏡：

用于觀察病毒和細菌表面結構和附屬結構等

一、形態學檢查及診斷掃描電子顯微鏡

第三節病毒學檢測及診斷25ppt課件H1N1流感病毒電子顯微鏡圖片狂犬病病毒電子顯微鏡圖片

第三節病毒學檢測及診斷26ppt課件（1）標本制備①超濾法②超速離心法③接種細胞快速增殖法④免疫凝集法（2）常用觀察方法

①負染色法②超薄切片法③免疫電鏡法病毒顆粒具有亮度，在周圍較暗的背景上顯示亮點過程與病理切片過程相似免疫組織化學與電鏡技術的結合透射電子顯微鏡

第三節病毒學檢測及診斷27ppt課件二、血清學檢測及診斷

原理：用已知的病毒抗原檢測患者血清中的抗體水平或

用已知的病毒抗體直接檢測標本中的病毒抗原1.病毒抗原的檢測：用熒光素、酶或膠體金等標記物標記病毒抗體檢測標本中的相應病毒抗原。如ELISA檢測HBsAg

第三節病毒學檢測及診斷28ppt課件2.病毒抗體的檢測：已知病毒抗原多數為通過基因工程技術制備的重組抗原，其次是從患者標本中分離純化的抗原。檢測抗體的類型確定患者所處感染階段-----急性期單份血清的IgM測定是診斷原發感染和早期感染-----IgG含量的測定應取病人急性期和恢復期雙份血清，若含量