醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)“三基”訓(xùn)練

實(shí)驗(yàn)理論與技能分冊

北京老年病醫(yī)療研究中心

科研處編

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院

200年

分子生物學(xué)

基本概念，基本理論

1、什么是分子生物學(xué)？

答：分子生物學(xué)是1945年由WilliamAstbury首次提出的，指的是對(duì)生物大分子的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)的研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，它已滲透到各個(gè)學(xué)科，成為各學(xué)科領(lǐng)域的不可分割的部分。

2、生物大分子主要包括哪幾類？

答：生物大分子主要有三類：蛋白質(zhì)、核酸和多糖，它們分別是氨基酸、核甘酸和糖的多聚體，分子量相

當(dāng)大（104?1012）?

3、蛋白質(zhì)的基本概念是什么？

答：蛋白質(zhì)是由若干個(gè)氨基酸構(gòu)成的多聚物，也稱為多肽。相鄰的氨基酸之間通過肽鍵相連。蛋白質(zhì)一端

具有一個(gè)游離的-Nh,稱作氨基端或N端，另一端具有一個(gè)游離的-COOH,稱作按基端或C端。

4、核酸的基本概念是什么？

答：核酸是由核甘酸組成的多聚物，每個(gè)核甘酸由下列三種成分組成：

（1）戊糖（五碳糖）：在RNA為核糖，在DNA為2,脫氧核糖。

（2）堿基：連接在糖的1'-碳原子上的啜吟堿基（腺噤吟A和鳥噤吟G）或喀陡堿基（胞喀陡C、胸

腺啥嚏T和尿啥嚏U）DNA和RNA都含AGC,T只在DNA中發(fā)現(xiàn)，U只在RNA中發(fā)現(xiàn)。

（3）磷酸基：磷酸基接在糖的5'碳原子上。

（1）和（2）組成核甘，核甘和磷酸組成核甘磷酸，即核甘酸。

5、多糖的基本概念是什么？

答：多糖是糖（最常見的是葡萄糖）的多聚物或糖的衍生物的多聚體。

6、決定蛋白質(zhì)和核酸三維結(jié)構(gòu)的非共價(jià)作用有哪些？

答：有氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德瓦耳斯鍵。

7、什么是DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)？

答：DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA的核甘酸順序。研究DNA的核甘酸順序是進(jìn)一步研究基因的結(jié)構(gòu)、調(diào)控

及DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

8、什么是DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)？

答：DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分兩類，一類是右手螺旋。如A、B、C型DNA,另一類是局部的左手螺旋，即Z-DNA。

9、什么是DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)？

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答：DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)也稱超螺旋結(jié)構(gòu)，是指DNA雙螺旋鏈的扭曲。DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)使DNA處于能量

最低的狀態(tài)。

10、筒述DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)(Watson-Crick模型)

答：DNA由兩條鏈彼此盤繞形成雙股螺旋，糖-磷酸骨架在分子的外側(cè)沿螺旋軌跡運(yùn)行，堿基在中央成螺

旋排列，一條鏈的堿基與另?條鏈的堿基氫鍵配對(duì)，形成噪吟與喀咤堿基對(duì)A-T和G-C。每一個(gè)堿基對(duì)的

兩個(gè)堿基位于同一平面，垂直于螺旋軸，每相鄰的堿基對(duì)旋轉(zhuǎn)36℃,相距3.4A。因此每匝螺旋有10對(duì)堿

基，長34A。雙螺旋的直徑是20A。螺旋外部有兩個(gè)螺旋形槽，深寬的稱為大溝，淺窄的稱為小溝。

11、簡述DNA的堿基配對(duì)原則？

答：[A]=[T],[G]=[C],A-T之間有兩對(duì)氫鍵，G-C之間有三對(duì)氫鍵。

12、什么叫DNA的變性？

答：雙鏈DNA(或天然DNA)兩條鏈之間的結(jié)合力遭到破壞，兩條鏈分離成單鏈DNA的過程叫做變性。

通常用加熱或高PH的方法使DNA變性。

13、什么是熔解曲線？什么是Tm值？

答：當(dāng)DNA溶液通過加熱變性時(shí)，其性質(zhì)的變化與溫度之間的關(guān)系圖稱為解鏈曲線或熔解曲線。

檢測DNA變性的方法可以是測定DNA溶液在260nm波長處的紫外光吸收值[A260J,隨溫度的升高,A260

升高，當(dāng)A260升高達(dá)到最大值一半時(shí)的溫度，稱作解鏈溫度；用Tm表示。

14、什么是DNA的呼吸現(xiàn)象？

答：DNA雙鏈的某些區(qū)域被打開變成單鏈的泡，這種現(xiàn)象稱作DNA的“呼吸”，可使特定的蛋白質(zhì)與DNA

分子發(fā)生相互作用和“閱讀”它編碼的信息。

A-T區(qū)比富含G-C區(qū)更容易發(fā)生呼吸。

15、什么是DNA的復(fù)性？

答:變性DNA溶液經(jīng)處理后可重新形成天然DNA,這一過程稱作變性或退火。

16、RNA主要有幾種類型？各有什么功能？

答：RNA主要有三種類型：核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。rRNA為

蛋白質(zhì)的合成場所、tRNA是氨基酸的搬運(yùn)工具，mRNA貯存編碼信息。

17、什么是DNA的復(fù)制？

答：DNA以原來的分子為模板合成新的DNA分子的過程，叫DNA復(fù)制。

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18、什么是DNA的半保留復(fù)制？

答：DNA復(fù)制時(shí)首先雙鏈之間氫鍵斷開，以每條單鏈作為模板合成新鏈，因此新的DNA雙螺旋，一條來

自親代鏈、一條為新合成的子鏈。DNA的這種復(fù)制方式叫做DNA的半保留復(fù)制。

19、什么是復(fù)制叉和復(fù)制子？

答：DNA復(fù)制是由一個(gè)固定的起始點(diǎn)進(jìn)行的，DNA雙鏈在此點(diǎn)上解旋成雙股單鏈呈叉形，稱復(fù)制叉。-

般把一個(gè)生物體的單獨(dú)復(fù)制單位稱為一個(gè)復(fù)制子。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

20、什么是拓?fù)洚悩?gòu)酶？

答：拓?fù)洚悩?gòu)酶能使DNA產(chǎn)生各種拓?fù)鋵W(xué)的變化，最常見的是產(chǎn)生負(fù)超螺旋性和消除超螺旋性。多見的

有兩類，拓?fù)洚愇锩窱和拓?fù)洚愇锩窱I。

21、DNA復(fù)制的特點(diǎn)有哪些？

答：(1)半保留復(fù)制(2)忠實(shí)性(3)半不連續(xù)復(fù)制。

22、DNA復(fù)制過程中有哪幾種聚合酶參與？有哪些共同點(diǎn)？

答：DNA聚合酶I(POII)和DNA聚合酶III(POLIII)在DNA復(fù)制過程中起作用。

其共同點(diǎn)是：

(1)同時(shí)要有帶一個(gè)游離3,-0H基團(tuán)的引物和一個(gè)模板。

(2)聚合作用是生長鏈末端的3'-0H基團(tuán)與加上去的核昔-5-'三磷酸之間的反應(yīng)。因此鏈的生長是

自5'f3'方向進(jìn)行的。

23、P0LI有哪些生物活性？

答：(1)5,-3Z聚合酶活性：使DNA復(fù)制進(jìn)行。

(2)3'-5'外切酶活性：可以切除誤配對(duì)的堿基，也稱poll的校對(duì)功能。

(3)5'->3'外切酶活性：主要功能是切除核糖核甘酸引物。

24、POL川具有哪些生物活性？

答：

(1)5,一3,聚合酶活性：DNA復(fù)制的主要聚合酶。

(2)3'-5,外切酶活性：DNA復(fù)制中起校對(duì)功能。

25、什么是DNA連接酶？

答：DNA連接酶能把3'-0H基因與5,-P基因相連接，在DNA復(fù)制過程和其他重要過程中發(fā)揮作用。

26、什么是DNA的不連續(xù)復(fù)制：什么是岡崎片段?

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答：DNA復(fù)制時(shí)，在不同點(diǎn)形成許多小片段，再連接成整鏈，這稱作DNA的不連續(xù)復(fù)制，這些小片段稱岡

崎片段。

27、什么是DNA的0復(fù)制？

答：大部分DNA分子以環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制，這些環(huán)像希臘字母。，所以習(xí)慣稱其為。復(fù)制。環(huán)復(fù)制引起的

拓?fù)鋵W(xué)問題靠DNA促旋醐來解決。

28、DNA復(fù)制起始時(shí)前導(dǎo)鏈或引物的合成是由什么酶催化完成的？

答：一種是RNA聚合酶，另一種是引物合成酶。

29、DNA復(fù)制起始時(shí)雙螺旋的解鏈?zhǔn)巧绞裁疵复呋瓿傻模?/p>

答：解旋酶。

30、什么是ssb蛋白？

答：大腸桿菌DNA復(fù)制時(shí)，為了避免單鏈區(qū)退火或形成鏈內(nèi)氫鍵，有一種蛋白結(jié)合在單鏈DNA匕稱單鏈

結(jié)合蛋白(ssbprotein)。

31、簡述大腸桿菌DNA的復(fù)制過程？

答：解旋酶由ATP水解所驅(qū)動(dòng)，并可能借助于ssb蛋白的結(jié)合把螺旋解開。不配對(duì)的堿基為ssb蛋白所覆

蓋。前導(dǎo)鏈由polHI催化加上核甘酸而沿著一條親鏈前進(jìn)。DnaB蛋白復(fù)合物沿另一條親鏈移動(dòng)，預(yù)引發(fā)它

使引物合成酶合成引物RNA。polHI把核甘酸加到引物匕從而合成了前體片段。這種合成繼續(xù)到前一個(gè)前

體片段的引物；這時(shí)由polI取代polIH,通過切口平移除去RNA,并山DNA取代，RNA一旦除去，DNA連

接酶就封閉切口，從而使前體片段參入后隨鏈。復(fù)制又繼續(xù)前進(jìn)直至完成復(fù)制。

32、DNA復(fù)制的起始有哪兩種方式？

答：(1)全程起始：其中前導(dǎo)鏈從頭開始。

(2)共價(jià)延伸：其中前導(dǎo)鏈共價(jià)連接到親鏈。

33、DNA復(fù)制主要有哪種方式？

答：(1)線性DNA雙向復(fù)制。

(2)環(huán)狀DNA。型復(fù)制。

(3)環(huán)狀DNA滾環(huán)復(fù)制。

(4)環(huán)狀DNAD-環(huán)復(fù)制。

34、什么是D環(huán)？

答：在DNA復(fù)制的全程起始中，前導(dǎo)鏈的合成先于后隨鏈的合成。在第一個(gè)前體片段合成開始前，存在

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著一個(gè)復(fù)制泡，是由一個(gè)雙鏈分去（由一條親鏈與前導(dǎo)鏈配對(duì)而成）和一個(gè)單鏈分去（是未復(fù)制的第二條

親鏈）所組成。因?yàn)榍皩?dǎo)鏈置換了未復(fù)制的親鏈，所以這個(gè)泡稱為置換環(huán)或D環(huán)。

35、什么叫滾環(huán)復(fù)制或S復(fù)制？

答：DNA雙螺旋環(huán)產(chǎn)生一含3'-0H和5'-P末端的切口，在解旋酶和ssb影響下，形成一復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈

的合成從3,-0H端開始延伸，并與后隨鏈的親鏈共價(jià)連接。后隨鏈以新合成的前導(dǎo)鏈為模板合成。這-

復(fù)制模式的結(jié)果是產(chǎn)生帶有線狀分去的環(huán)，類似于希臘字母6,被稱為6復(fù)制或滾環(huán)復(fù)制。

36、什么是雙向復(fù)制？

答：DNA分子通過兩個(gè)復(fù)制叉沿著環(huán)按相反方向移動(dòng)，稱為雙向復(fù)制。

37、真核生物DNA的復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)有哪些？

答：相同點(diǎn)：都是半保留復(fù)制，半不連續(xù)復(fù)制，復(fù)制過程都存在引發(fā)、延長和終止三個(gè)階段，都必須有相

應(yīng)功能的蛋白質(zhì)（如ssb）和醐（如DNA聚合酶）參與等等。

相異之處在于：（1）真核生物每條染色質(zhì)上可以有多處起始點(diǎn)，而原核生物的起始點(diǎn)只有一個(gè)，（2）真

核生物的染色體在全部復(fù)制完成之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開始；而原核生物在起始點(diǎn)上可以

連續(xù)地開始新的DNA復(fù)制，表現(xiàn)為雖有一個(gè)復(fù)制子，但可有多個(gè)復(fù)制叉。

38、真核細(xì)胞中存在哪幾種DNA聚合酶？

答：在真核細(xì)胞中存在四種DNA聚合酶，通常將這些醐依次稱為DNA聚合酶a、B、y和線粒體DNA聚合

的。其中a酶在細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制中起關(guān)鍵作用，B前在DNA損傷修復(fù)中起作用，Y酶在分裂細(xì)胞的DNA復(fù)

制調(diào)控方面起作用。

39、DNA復(fù)制的調(diào)控有哪幾方面？

答：（1）復(fù)制起點(diǎn)的調(diào)節(jié)：通過復(fù)制起點(diǎn)區(qū)反轉(zhuǎn)重復(fù)順序的變構(gòu)與一些特異蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)復(fù)制的方向、

速度等。

（2）起始蛋白的調(diào)節(jié)：起始蛋白與DNA起始部位的結(jié)合，導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)變化，從而引起DNA復(fù)制。

（3）復(fù)制過程的調(diào)節(jié)：DNA復(fù)制過程中常受到一些蛋白及DNA聚合酶的調(diào)節(jié)。

（4）復(fù)制頻率的調(diào)節(jié)：每種生物體DNA復(fù)制與其細(xì)胞周期有關(guān)。如真核生物每個(gè)細(xì)胞周期有一次全

DNA的復(fù)制，而原核生物中某些質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞周期中可以復(fù)制若干拷貝。

（5）生物膜可能參與DNA復(fù)制的起始過程。

40、引起DNA分子改變的原因有哪些？

答：有3種機(jī)制改變DNA的結(jié)構(gòu)：（1）復(fù)制過程中的堿莽置換；（2）由堿基或N-糖糖鍵固有的化學(xué)不穩(wěn)

定性所引起的堿基變化：（3）其他化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境因素的作用所引起的變化。

41、DNA分子改變的類型有哪幾種？

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答：

(1)堿基置換：山于復(fù)制過程中校對(duì)功能的遺漏，基自發(fā)脫氨作用使嘴啜變?yōu)槟蚩εK或使腺噂吟變?yōu)?/p>

次黃噂吟，使一條鏈上的錯(cuò)誤堿基不能與另?條鏈的相應(yīng)堿基形成氫鍵。

(2)堿基丟失：喋吟核甘酸的N-糖首鍵在生理溫度下自發(fā)斷裂，使喋吟從DNA上脫落，這一過程稱

為脫喋吟作用。

(3)堿基改變：許多化學(xué)試劑和物理因素能使堿基變成截然不同的化合物。如紫外線照射形成的胸腺

喀咤二聚體。

(4)單鏈斷裂：許多試劑能裂解磷酸二酯鍵，如過氧化物、硫基化合物和某些金屬離子(如Fe?+和Cu2+)

單鏈斷裂往往通過DNA連接酶的作用來修復(fù)。

(5)雙鏈斷裂：足夠多的單鏈斷裂可使雙鏈彼此相對(duì)，結(jié)果就出現(xiàn)雙螺旋斷裂。雙鏈斷裂往往不能修

復(fù)。

(6)交聯(lián)：某些抗生素(如絲裂霉素C)和某些試劑(亞硝酸離子)能使DNA分子一條鏈上的堿基與

互補(bǔ)鏈上的相應(yīng)堿基形成共價(jià)連接。

42、胸腺喀嚏二聚體的修復(fù)途徑有哪些？

答：有4條途徑：①光修復(fù)②切割修復(fù)③重組修復(fù)④SOS修復(fù)。

43、什么是轉(zhuǎn)錄？

答：遺傳信息從DNA分子傳遞到RNA分子的過程叫轉(zhuǎn)錄。

44、RNA的合成包括哪幾個(gè)階段？

答：RNA的合成包括4個(gè)階段：①RNA聚合酶結(jié)合在模板的特定部位上②起始③鏈延伸④鏈終止和

釋放。

45、RNA合成的基本特性是什么？

答：

①RNA合成的前體是4種5'-核昔三磷酸(rNTP)即ATP,GTP,CTP和UTP。

②在聚合反應(yīng)中，一個(gè)核甘酸上的3'-0H基因與第二個(gè)核甘酸上的5,磷酸基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，釋放出焦磷酸

二酯鍵。

③RNA分子的堿基順序由DNA的堿基順序所決定。A-U,T-A,G-C,C-G。

④DNA分子的雙鏈中，只有一條鏈作模板。

⑤RNA鏈按5'-3'方向延伸。

⑥RNA聚合酸能起始鏈的生長，也就是說，它不需要引物。

46、大腸桿菌RNA聚合醐由哪兒個(gè)亞基組成？

答：由5個(gè)亞基組成，2個(gè)相同的a亞基，6,6'和6亞基各1個(gè)。完整的酶稱為全酶，不含6亞基的

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酶稱為核心酶。

47、什么是Pribnow順序?什么是“保守的T”？

答：大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，拷貝出的mRNA的第一個(gè)堿基左側(cè)的5-10個(gè)堿基區(qū)域是Pribnow順序的右

末端，其全部順序都可認(rèn)為是基本順序TATAATG的變式。黑體的T是Pribnow順序中的第6個(gè)堿基，在至

今定序的所有啟動(dòng)子中都有這堿基，因此被稱作“保守的T”，通常把保守的T垂直對(duì)齊即可比較不同的

順序。Pribnow順序被認(rèn)為是給RNA聚合酶取向的順序，使從左到右進(jìn)行合成；它也是打開雙螺旋形成開

放啟因子復(fù)合物的區(qū)域。

真核生物中相應(yīng)的一致順序是TATAAAA,稱TATA順序或Hogness順序。

48、什么是-35順序?

答：真核生物啟動(dòng)子中，拷貝出的mRNA的第個(gè)堿基左側(cè)第35個(gè)堿基位置有9個(gè)堿基的區(qū)域，被認(rèn)為

是RNA聚合酶結(jié)合的起始點(diǎn)，習(xí)慣稱作-35順序。

49、什么是開放啟動(dòng)復(fù)合物(Open-promotercomplex)?

答：開放啟動(dòng)復(fù)合物由RNA聚合酶和啟動(dòng)子結(jié)合形成，是一種高度穩(wěn)定的復(fù)合物，是鏈起始中的活性中間

物。在這個(gè)復(fù)合物中，DNA雙螺旋的局部松開(“解鏈”)從Pribnow順序左側(cè)的10個(gè)堿基開始一直擴(kuò)展到

轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基部位。這種解鏈?zhǔn)沁M(jìn)入的核甘酸進(jìn)行配對(duì)所必需。

50、RNA聚合前起始部位結(jié)合哪種核甘三磷酸？

答：只結(jié)合喋吟核昔三磷酸，即ATP和GTP。其中之■(往往是ATP)是鏈中的第一個(gè)核甘酸。

51、RNA合成的終止順序有什么特征？

答：RNA合成的終止發(fā)生在DNA分子的特定堿基順序上，它們有三個(gè)重要區(qū)域：

(1)第一區(qū)域是中央含非重復(fù)片段的反向重復(fù)堿基順序;如ABCDEF-XPZ-F'E'DzCB'AS其中A-A'、

B-Bz等是互補(bǔ)的堿基。因此這個(gè)順序能在鏈內(nèi)堿基配對(duì)，在RNA轉(zhuǎn)錄物中和可能在DNA鏈中形成

莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

(2)第二個(gè)區(qū)域是在莖的近環(huán)端(有時(shí)全在莖內(nèi))，是一個(gè)G+C富集的順序。

(3)第三個(gè)區(qū)域(有時(shí)不存在)是A-T配對(duì)的順序，使RNA中產(chǎn)生6-8個(gè)尿口密咤，其后往往跟隨一個(gè)

腺噂吟。

52、什么是3循環(huán)？

答：RNA合成過程中，鏈延伸約8個(gè)核甘酸時(shí)，RNA聚合酶結(jié)構(gòu)改變，6亞基脫落；當(dāng)合成終止時(shí)，核心

酶從DNA上解離，核心酶與6亞基重新結(jié)合形成全酶。這一過程稱6循環(huán)。

53、什么是有義鏈和反義鏈?

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答：DNA轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)，只有雙鏈中的一條鏈轉(zhuǎn)錄，這條鏈就叫有義鏈。未被轉(zhuǎn)錄的DNA鏈稱為反義鏈。

54、什么是順反子(Cistron)?

答：相應(yīng)于一條多肽鏈的DNA片段加上起始信號(hào)和終止信號(hào)，被稱作順反子。編碼單個(gè)多肽的mRNA稱作

單順反子mRNA;編碼不同的多肽鏈的mRNA稱作多順反子mRNA。

55、什么是前導(dǎo)區(qū)(Leader)?弱化子(attenuator)?間隔順序(spacer)?

答：mRNA分子編碼區(qū)之前的非翻譯區(qū)段稱為前導(dǎo)區(qū)。前導(dǎo)區(qū)中含有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)節(jié)區(qū)，稱為弱

化子。多順反子mRNA分子可能含有順反子間順序，長達(dá)幾萬個(gè)堿基，稱間隔順序(spacer)。

56、核糖體RNA(rRNA)和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾后有哪些性質(zhì)？

答：rRNA和tRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾或加工具有下列3個(gè)性質(zhì)：

①分子的末端為5,-單磷酸，而非初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的末端三磷酸；

②rRNA和tRNA分子比初級(jí)轉(zhuǎn)錄物小得多；

③所有tRNA分子都含有A,G,C,U以外的堿基，這些所謂的“稀有”堿基并不存在于初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中。

57、真核生物與原核生物轉(zhuǎn)錄有什么區(qū)別？

答：真核生物中的轉(zhuǎn)錄和mRNA的基本特性與細(xì)菌中的相類似，然而有下列5個(gè)明顯的區(qū)別。

①真核生物細(xì)胞含3大類核內(nèi)RNA聚合酶，負(fù)責(zé)各類RNA的合成。

②許多mRNA是長壽的。

③5'和3'末端都受到修飾：5'末端形成“帽子(CAP)結(jié)構(gòu)"，3'末端有一多聚腺甘酸順序(Poly(A)

)。

④用作蛋白質(zhì)合成的mRNA模極只占初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的1/10,在mRNA加工過程中，切除稱為內(nèi)含子(intron)

的內(nèi)插順序，留下的片段重新連接。⑤所有真核生物的mRNA分子都是單順反子。

58、真核生物RNA聚合醐有兒類，分別參與哪種RNA的合成？

答：真核生物含3類RNA聚合前，分別以I、II、IH表示。第I類存在于核仁內(nèi)，參與rRNA的合成；第

II類存在于核質(zhì)內(nèi)，參與mRNA的合成；第IH類存在于核質(zhì)內(nèi)，參與tRNA和5sRNA的合成。

59、什么是真核生物mRNA的帽子結(jié)構(gòu)？

答：真核生物mRNA分子的5'-端有甲基化的鳥背衍生物7-甲基鳥苜(7-MeG),呈異常的5'-5'鏈連到

5'端核甘酸上，偶爾相鄰核甘酸的糖也被甲基化。7-(MeG)-5'-ppp-(G或A,可能甲基化的核糖)-3'

-P-,這一結(jié)構(gòu)被稱為帽子(Cap),其中，P和PPP分別代表單磷酸和三磷酸基因。帽子的功能可能是保護(hù)

mRNA免受核酸酶的降解、或?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成提供識(shí)別特征。

60、什么是RNA的拚接(RNASplicing)?

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答：真核生物mRNA分子中內(nèi)含子切除和外顯子連接成成熟mRNA分子的過程，稱作RNA拚接。

61、什么是斷裂基因？

答：由于基因中有內(nèi)含子，使編碼一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽的DNA順序在基因上呈不連續(xù)狀，稱斷裂基因。

62、什么是翻譯（translation）?

答：細(xì)胞內(nèi)DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程叫做翻譯。包括編碼和蛋白質(zhì)合成兩步。編碼就是將DNA的堿基順

序翻譯成肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)合成包括合成起始、鏈的延伸終止、釋放、折疊及合成后修飾過程。

63、什么密碼子？有哪些特點(diǎn)？

答：密碼子是指對(duì)應(yīng)于各種氨基酸的mRNA分子上的堿基順序，通常由3個(gè)堿基組成，密碼子有下述特性:

①通用性：在所有生物中，密碼子-氨基酸關(guān)系都是相同的（線粒體、葉綠體除外）；②簡并性：編碼同一

氨基酸的密碼子往往不止一個(gè)（甲硫氨酸和色氨酸除外），它們往往只是第3個(gè)堿基不同；③起始密碼子

標(biāo)志著肽鏈合成的起始，即AUC,編碼甲硫氨酸；④終止密碼子，3種密碼子標(biāo)志著肽鏈合成的終止，即

UAA,UAG和UGA。

64、什么是解碼作用？

答：解碼作用是把mRNA分子中的堿基順序變成翻譯到蛋白質(zhì)分子中的氨基酸順序，這是由mRNA分子和氨

酰tRNA合成酶完成的。

65、簡述tRNA分子的二維結(jié)構(gòu)特征？

答：tRNA分子的二維結(jié)構(gòu)類似平面的三葉草形，包括以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)：

①受體臂：3'-0H端有一個(gè)4堿基組成的單鏈區(qū)，順序?yàn)镃CA-3'-011,稱CCA或受體臂，其中A為氨基

酸結(jié)合部位。

②有三個(gè)大的單鏈環(huán)。（a）反密碼子環(huán)：含有反密碼子，由3個(gè)堿基組成，與mRNA中的密碼子順序進(jìn)行

堿基配對(duì)。（b）二氫尿喀咤環(huán)（DHULOOP）：含有二氫尿口密咤。（c）TWC環(huán)：含有『W-C順序；￥為假尿

喀咤。

③有四個(gè)稱為干（臂）的雙鏈區(qū).

④有一額外臂（extaarm）。

66、什么是搖擺假說（wobblehypothesis）?

答：搖擺假說是用來解釋某些tRNA分子對(duì)應(yīng)于幾種密碼子的現(xiàn)象。這種假說認(rèn)為，因?yàn)榉疵艽a子位于單

鏈RNA環(huán)中，密碼子-反密碼子相互作用也許不需要形成雙螺旋常見的空間結(jié)構(gòu)，這樣對(duì)密碼子的第三個(gè)

位置上的堿基要求是不太嚴(yán)格的，這樣通過結(jié)構(gòu)的稍稍搖擺，在密碼子和反密碼子之間可以存在其他的堿

基對(duì)如AT,U-I,C-I和G-U等等，這樣就解釋了--種tRNA分子可對(duì)應(yīng)于幾種密碼子。也就是說，密碼

子的簡并現(xiàn)象是由密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)時(shí)搖擺引起的。

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67、什么是重疊基因（orerlappinygene）?

答：一個(gè)DNA片段含有多重讀框，從而編碼多種不同的蛋白分子，這種現(xiàn)象稱重疊基因。

68、肽鏈合成分哪幾個(gè)階段？各階段主要特征是什么？

答：肽鏈合成分三個(gè)階段：①起始階段：mRNA結(jié)合到核糖體匕選擇起始密碼子，和攜帶第一個(gè)氨基酸的

?；痶RNA結(jié)合；②延伸階段：通過肽鍵把兩個(gè)氨基酸相連，mRNA和核糖體彼此相對(duì)移動(dòng)，使密碼子能成

功地翻譯。③終止階段：合成好的蛋白質(zhì)從合成機(jī)構(gòu)上解離，釋放出核糖體開始另一輪合在成。

69、筒述大腸桿菌核糖體的結(jié)構(gòu)？

答：大腸桿菌核糖體的完整顆粒稱為70s核糖體（S為沉降速率），含兩個(gè)亞基，分別為30s和50S。每個(gè)

30S亞基含1個(gè)16SrRNA分子和21種蛋白質(zhì)；第個(gè)50S亞基含2個(gè)rRNA分子（1個(gè)5srRNA分子和1個(gè)

23SrRNA分子）和32種蛋白質(zhì)。

70、什么是Shine-Daigarno順序？

答：在原核生物mRNA分子中有一特定的堿基順序AGGAGGU,能夠識(shí)別作為起始信號(hào)的特定AUG密碼子，稱

作Shine-Dalgarno順序或核糖體結(jié)合部位。

71、什么是30s前起始復(fù)合物和70s起始復(fù)合物？

答：細(xì)菌中多肽合成由30s亞基、mRNA分子、f'Met-tRNA、起始因子以及GTP一起組成30s前起始復(fù)合物,

再與50S亞基連接形成70s起始復(fù)合物。

72、什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒有哪些基本特性？

答：質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的?些雙鏈閉環(huán)的DNA分子，是能夠進(jìn)行復(fù)復(fù)和遺傳的輔助性遺傳單位,

其大小范圍從1Kb至200Kb以上不等。質(zhì)粒的基本特性如下：

（1）復(fù)制能力和不相容性：質(zhì)粒DNA能夠依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。利用同?

復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定的和平共處，可稱之為不相容質(zhì)粒。當(dāng)兩個(gè)上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細(xì)

胞時(shí)，它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競爭，細(xì)胞生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)

喪失殆盡。

（2）轉(zhuǎn)移性：在自然條件下，很多質(zhì)粒都可以通過一種稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。

（3）選擇性標(biāo)記：質(zhì)粒能夠編碼一些可識(shí)別性表型，稱作可選擇標(biāo)記。最常用的可選擇標(biāo)記是抗生素

抗性基因，所涉及的抗生素包括氨芳青霉素、四環(huán)素、氯霉毒和卡那霉素（或新霉素）等。

73、質(zhì)粒DNA小量制備過程中容易出現(xiàn)的問題及對(duì)策有哪幾種？

答：

（1）質(zhì)粒DNA不能被限制前所切割，主要是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得

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不夠。大多數(shù)情況下，用酚氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量制備物中的雜質(zhì)。若問題依然存在,

可用離心柱層析法純化DNAo

（2）個(gè)別小量制備物會(huì)出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象，這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。

74、在大量制備質(zhì)粒DNA過程中，可通過什么方法來提高質(zhì)粒的產(chǎn)量？

答：將細(xì)菌在豐富的培養(yǎng)基中37℃振搖一定時(shí)間（約25小時(shí)），所得培養(yǎng)物的0優(yōu)。。達(dá)到約0.4,此時(shí)加氯

霉素溶液，使終濃度為170ug/ml,于37℃劇烈振搖，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。

75、用于去除質(zhì)粒DNA中RNA的酶的名稱是什么？一般工作濃度是什么？

答：核糖核酸酶A,習(xí)慣稱無DNA酶的胰RNA酶。一般工作濃度為20ug/ml。

76、影響外源DNA片段和質(zhì)粒載體連接的因素有哪些？

答：（1）外源DNA片段末端的性質(zhì)，見下表：

外源DNA片段所克隆的要求說明

帶末端

平端要求高濃度的DNA和連接酶①非重組體克隆的背景可能較高

②質(zhì)粒和外源DNA接合處的限制酶切位

點(diǎn)消失

③重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝

不同的突出端用兩種限制酶消化后，需純化質(zhì)①質(zhì)粒與外源DNA接合處的酶切位點(diǎn)常

粒載體以晝提高連接效率可保留

②非重組體克隆的背景較低

③外源DNA只以一個(gè)方向插入到重組質(zhì)

粒中

相同的突出端線狀質(zhì)粒DNA常用磷酸酶處理①質(zhì)粒與外源DNA接合處的限制酶切位

點(diǎn)?？杀Ａ?/p>

②外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入

③重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝

（3）質(zhì)粒載體和外源DNA中限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)：有兩種方案可以解決質(zhì)粒與外源DNA限制酶切位

點(diǎn)的不匹配：A.在線狀質(zhì)粒的末端和（或）外源DNA片段的末端接上合成的接頭或銜接頭；B.控

制反應(yīng)條件，用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平帶3'凹端的DNA片段。

77、對(duì)于常規(guī)的連接反應(yīng)來講，質(zhì)粒DNA與外源DNA的比率應(yīng)為多少？

答：對(duì)于常規(guī)的連接反應(yīng)，質(zhì)粒DNA與外源DNA的比率應(yīng)〈1,這樣將可得到數(shù)量相宜的有效重組體。

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78、平端DNA的連接需要哪些基本條件？

答：平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下4個(gè)條件：

（1）低濃度（0.5mmol/l）的ATP；（2）不存在亞精胺一類的多肽；（3）極高濃度的連接酶（50Weiss

單位/ml）；（4）高濃度的平端。

79、在平端DNA連接時(shí)，常常在反應(yīng)混合物中加入凝聚劑，常用的有哪些？它們的作用是什么？

答：在平端DNA連接時(shí)一，常常在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致DNA分子凝聚成聚

集體的物質(zhì)，常用的有聚乙二醇和氯化六氨合高鉆。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩個(gè)作用：

（1）它們可使平端DNA的連接效率加大1-3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶和DNA濃度不高的條件

下進(jìn)行。

（2）它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)

物。

80、影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？

答：下述3個(gè)因素對(duì)于獲得持續(xù)高的轉(zhuǎn)化效率來說是至關(guān)重要的：

（1）轉(zhuǎn)化緩沖液中試劑的純度：務(wù)必使用所能得到的最高質(zhì)量的試劑，這些試劑應(yīng)分裝成小份，避光

保存于冷處。

（2）細(xì)胞的生長狀態(tài)：由于一些不清楚的原因，直接用貯存于-70℃冰凍培養(yǎng)基中的貯存原種接種而進(jìn)

行培養(yǎng)的細(xì)菌，所得到的轉(zhuǎn)化效率最高，不應(yīng)使用在實(shí)驗(yàn)室中連續(xù)傳代，貯存于4℃或貯存于室溫

的培養(yǎng)物。

（3）玻璃和塑料器皿的清潔度：痕量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大地降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率,

所以最好拔出一批玻璃器皿專用于制備感受態(tài)細(xì)菌，而不作它用。這些玻璃器皿應(yīng)用手洗刷，再

灌滿純水（Milli-Q級(jí)或其相當(dāng)?shù)募?jí)別），然后高壓滅菌，臨用前才把水倒掉。

81、鑒定含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落的方法有哪些？

答：常用4種方法來鑒定含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落:

（1）小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析；

（2）a互補(bǔ)

（3）插入失活

（4）雜交篩選

82、簡述a-互補(bǔ)的原理？

答：現(xiàn)在使用的許多載體（如PUC系列）都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短片段，其中含有*半乳糖甘酶

基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破

壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到半乳糖甘酣的氨基端，而不影響功能。這種載體適用于可編碼

B-半乳糖首酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們可以融

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為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操

縱基因區(qū)段的6-半乳糖甘酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這訓(xùn)互補(bǔ)現(xiàn)象叫a互補(bǔ)。由a互補(bǔ)而產(chǎn)生的

lac+細(xì)菌易于識(shí)別，因?yàn)樗鼈冊谏孜?-溟-4-氨-3』引味-B-D-半乳糖甘（X-lac）存在下形成藍(lán)色菌落，

然而外源DNA片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無a互補(bǔ)能力的氨基端片段。

因此，帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這一簡單的顏色試驗(yàn)大大簡化了在這種質(zhì)粒載體中鑒定重組體的

工作，通過目測即可識(shí)別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。

83、X噬菌體的復(fù)制方式有哪幾種？

答：X噬菌體有下述兩種復(fù)制方式：

（1）在裂解性生長過程中，環(huán)狀病毒DNA分子被復(fù)制了許多倍，X噬菌體基因產(chǎn)物大量合成，并組裝

成子代X噬菌體顆粒，最終宿主細(xì)胞裂解，釋放出許多感染性顆粒。

（2）在溶源性生長過程中，X噬菌體基因組通過位點(diǎn)專一重組整合入宿主菌DNA分子中，隨宿主菌DNA

復(fù)制并轉(zhuǎn)入子代細(xì)菌中。在溶源狀態(tài)下，只有一個(gè)X噬菌體基因，即CI基因，處于表達(dá)狀態(tài)，

它編碼一個(gè)阻抑物。

84、X噬菌體載體有哪兩種類型？

答：

（1）只有一個(gè)限制酶切位點(diǎn)可供插入入源DNA的載體，稱作插入性載體。

（2）在可被外源DNA置換的X噬菌體DNA非必需區(qū)兩側(cè)有一對(duì)限制酶切位點(diǎn)的載體稱作置換性載體。

85、簡述Agt11載體的特征。

答：Xgt11載體是一個(gè)常用的，可用于免疫學(xué)篩選的載體。DNA片段（可達(dá)7.2Kb）插入lacZ內(nèi)的單一

ECORI位點(diǎn)，如果插入片段的讀框與lacZ的讀框相吻合，就可表達(dá)出融合蛋白。該載體需要SupF宿主

菌進(jìn)行增殖和篩選。在非抑制性宿主菌內(nèi)，由于Sam100突變的存在可以防止細(xì)菌裂解，所以表達(dá)的融合

蛋白就會(huì)在細(xì)菌內(nèi)累積。該載體帶有red和gam基因，可以在recA-宿主菌內(nèi)生長。載體上的溫度敏感阻

抑物可用來控制筮菌體的復(fù)制和融合蛋白的表達(dá)。

86、X噬菌體大規(guī)模制備的方法有哪兩種？

答：大規(guī)模制備X噬菌體有下述兩種方法：（1）低復(fù)數(shù)感染；（2）高復(fù)數(shù)感染。

87、純化X噬菌體的方法有哪幾種？

答：（1）氯化葩梯度離心；（2）沉淀噬菌體顆粒；（3）甘油分級(jí)梯度離心；（4）氯化鈉平衡離心。

88、用A噬菌體進(jìn)行克隆包括哪些步驟？

答：用人噬菌體進(jìn)行克隆包括5個(gè)步驟：

（1）用適當(dāng)限制酶消化的載體DNA的制備；

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(2)酶切的載體與帶匹配粘端的外源DNA片段的連接；

(3)將連接的DNA包裝入噬菌體顆粒中，在適當(dāng)?shù)乃拗骶闲纬墒砂撸?/p>

(4)帶有目的外源DNA序列的X噬菌體重組體的鑒定；

(5)對(duì)選出的重組噬菌體進(jìn)行噬斑純化，然后進(jìn)行外源DNA的分析。

89、大腸桿菌絲狀噬菌體有哪兒種？它們有什么用途？

答：大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體、fl噬菌體和fd噬菌體。這些噬菌體均含一個(gè)約6400個(gè)核甘酸

的單鏈閉環(huán)DNA分子。在用作克隆載體時(shí)，這些噬菌體有一個(gè)得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)，即可以產(chǎn)生大量含有外源

DNA某一條鏈的DNA分子。這種單鏈DNA分子可以在下列工作中用作模板：

(1)用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA序列測定

(2)制備僅有一條鏈得到放射性標(biāo)記的雜交用DNA探針

(3)利用寡核甘酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。

90、什么是限制性內(nèi)切酶？分兒類？

答：限制性內(nèi)切的是指能特異性地結(jié)合于一段特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈

DNA的一類蛋白質(zhì)。它可分3類。I類和IH類限制酶在分子克隆中不常用，常規(guī)應(yīng)用于分子克隆中的限制

酶為H類。

91、什么是同裂酶？

答：不同來源的限制醐可切割同一靶序列，這些醐即稱為同裂酶。

92、大腸桿菌DNA聚合酶I有哪些活性？在切口平移法標(biāo)記DNA時(shí)利用的是哪一活性？

答：DNA聚合酶I具有3種活性：(1)5,一3,DNA聚合酶活性；(2)5,-3Z外切核酸酶活性；(3)3,

-5'外切核酸酶活性。在切口平移法標(biāo)記DNA中利用的是其5,一3'外切核酸醵活性。

93、什么是大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow段)？在分子克隆中有哪些用途？

答：利用蛋白酶解作用(如枯草桿菌蛋白酶)去除大腸桿菌DNA聚合酶I的5,一3'外切核酸酶活性，而

聚合酶活性3'-5'外切核酸酶活性切不受影響。這種經(jīng)蛋白酶作用后的DNA聚合酶I就叫做DNA聚合酶

I大片段或Klenow片段。

用途：(1)補(bǔ)平限制酶切割切割DNA產(chǎn)生的3'凹端。

⑵用[32P]dNTP補(bǔ)平3'凹端;對(duì)DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記;

(3)對(duì)帶3'突出端的DNA進(jìn)行末端標(biāo)記；

(4)在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二鏈；

(5)在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA；

(6)應(yīng)用Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測序；

(7)消化某些限制酶作用后產(chǎn)生的3,突出端；

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(8)也可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)o

94、T,噬菌體DNA聚合酶的用途有哪些？

答：(1)補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化的3'凹端；

(2)對(duì)帶有3'突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記；

(3)標(biāo)記用作探針的DNA片段；

(4)將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平端；

(5)使結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變寡核甘酸引物得到延伸。

95、什么是測序酶(Sequenase)?

答：測序酶是經(jīng)修飾的「噬菌體DNA聚合酶，其99%以上的3,一5,外切核酸酶活性由氧自由基介導(dǎo)的位

點(diǎn)特異性修飾作用而滅活，但其聚合能活性則無明顯改變，它是用雙脫氧鏈終止法對(duì)長段DNA進(jìn)行測序的

理想用酶。

96、什么是TaqDNA聚合酶？其用途有哪些？

答：TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的TagDNA聚合酶(分子量65000D)它最初是從極度嗜熱的

棲熱水生菌Thermusaquaticus中純化而來的。

TaqDNA聚合酶可用于對(duì)DNA進(jìn)行測序及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg";磷酸鹽緩沖液抑制TaqDNA聚合酶的活性，因此忌用之。

97、什么是連接的？主要有哪兒種？

答:用于將兩段DNA拼接起來的酶叫連接酶。分子克隆中最常用的連接酶是T,菌體DNA連接酶，還有一種

大腸桿菌DNA連接酶。

98、常用的核酸酶有哪些？各有什么活性？

答：

①BAL31核酸酶：3,外切核酸酶活性和內(nèi)切核酸酶活性。

②&核酸酶：降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5'磷酸的單核甘酸或寡核甘酸

③綠豆核酸酶：降解單鏈DNA,產(chǎn)生帶5'磷酸的單核甘酸或寡核甘酸。

④核糖核酸酶A：RNA酶A是內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊RNA上喀咤殘基的T端，切割與相鄰核甘酸

形成的磷酸二酯鍵。產(chǎn)生帶啥呢3'磷酸的寡核甘酸或瞪吃3'磷酸。

⑤核糖核酸酶RNA酶*是內(nèi)切核糖核酸酶，它特異地作用于鳥口票吟核甘酸3'磷酸并切割與相鄰核昔

酸相連的磷酸二酯鍵。產(chǎn)物為鳥喋嶺核昔3,磷酸或帶鳥噤吟核甘3'磷酸的寡核甘酸。

⑥脫氧核糖核酸酶I：DNA酶I為一內(nèi)切核酸酶。它優(yōu)先從嚓臟核甘酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA,產(chǎn)物

為5'磷酸單核甘酸及寡核甘酸的混合物。

⑦外切核甘酸m：從雙鏈DNA的3'羥基端逐一去除單核甘酸，結(jié)果是在雙鏈DNA上產(chǎn)生長的單鏈區(qū)。

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⑧入噬菌體外切核酸酶：可催化從雙鏈DNA中持續(xù)地逐一釋放5'單核甘酸的反應(yīng)。

99、影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素有哪些？

答：

①DNA的分子大?。篋NA在凝膠中的遷移速率與其分子大小成反比。

②瓊脂糖濃度：DNA電泳遷移率與凝膠濃度成反比。

③DNA的構(gòu)象：分子量相同的超螺旋環(huán)狀（I型）、帶切口環(huán)狀（H型）及線狀（III型）DNA通過凝膠時(shí)速

度不一。

④所加電壓：在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比

⑤電場方向：通過電場方向周期性改變，可分辨極大的DNA分子。

⑥堿基組成與溫度：4-30C之間影響不明顯。

⑦嵌入染料的存在：漠化乙錠可使線狀DNA的遷移率降低15%。

⑧電泳緩沖液的組成：電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。

100、從凝膠中回收DNA的常用方法有哪幾種？

答：

①電泳到DEAE-纖維素膜上。

②電洗脫到透折袋中。

③利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。

101、聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠相比有哪些優(yōu)點(diǎn)？

答：有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：①分辨力很強(qiáng)，長度僅僅相關(guān)0.2%的DNA分子即可分開；②所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)

大于瓊脂糖凝膠;③從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求最高的實(shí)驗(yàn)（如鼠胚微注射）。

102、RNA提取和純化過程中應(yīng)怎樣控制RNA酶的活性？

答：①實(shí)驗(yàn)程序中控制RNA酶活性：

A、玻璃制品、塑料制品和電泳槽：滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經(jīng)預(yù)處理

直接用于制備和貯存RNAo實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器Hl和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必須于180℃

干烤8小時(shí)以上（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的

水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯、試管和其它用品。灌滿DEPC的器皿在37℃放置2小時(shí)，然后用滅菌水

淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，在15lbf/in2（1.034X105Pa）高壓下滅菌15分鐘。

用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%的溶液；于室溫

放置10分鐘，然后用0.1%DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。

最好能留出一些玻璃品皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記，存放在指定地點(diǎn)；為RNA實(shí)驗(yàn)專用。

B、研究人員的手是RNA前最主要的潛在污染源，因此在準(zhǔn)備分離和分折RNA的材料和溶液時(shí)，以及

在涉及RNA的一切操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套，按觸“臟的”物品后，手套就可能污染上RNA

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酶，因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。

C、溶液配制：用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，同干烤過的藥匙稱取試劑，將

溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話，溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37c至少處理12小時(shí)，然后

于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2（l.034X105Pa）的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。

②RNA酶的抑制劑：主要有下述3種。

A、RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑：從胎盤分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA能緊密結(jié)合，形成非共價(jià)結(jié)合的

等摩爾復(fù)合物，使RNA酶失活。

B、氧鈕核糖核昔復(fù)合物：它能與多種RNA酶結(jié)合并幾乎能百分之百地抑制RNA的活性。

C、Macalod（硅藻土）：是??種粘土，能吸附RNA的。

③破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行：用強(qiáng)烈變性劑如鹽酸胭或硫氟酸服溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致

細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞而從核酸上解離下來。

103、進(jìn)行RNA分折的方法有哪些？

答：①Northern雜交（RNA印亦法）；②斑點(diǎn)和鐵線雜交；③進(jìn)行RNA的8核酸酣或核糖核酸前作圖I；

④引物延伸法；⑤溶液雜交；⑥濾膜雜交。

104.Northern雜交主要有哪些步驟？

答：

①變性RNA瓊脂糖凝膠電泳。

②分級(jí)分離的RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜。

③同放射性標(biāo)記的探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。

105、構(gòu)建CDNA文庫常見的步驟有哪些？

答：①制備用于CDNA克隆的mRNA。②CDNA第一鏈的合成。③CDNA第二鏈的合成。④雙鏈CDNA的分

子克?。ê铣山宇^的加入和雙鏈CDNA克隆入X噬菌體載體）。

106、從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離DNA的方法有哪些？

答：下面介紹從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離DNA的三種程序：

①利用蛋白酶K,SDS和酚，所獲DNA的大?。?00T50kb）適用于在噬菌體載體上的構(gòu)建基因組DNA

文庫；

②用蛋白酶K消化，用高濃度甲酰胺使DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物解離，以及通過火棉膠透折袋透折除去殘存

的蛋白酶K等步驟，這樣得到的DNA分子量非常大，但濃度頗低。

③用鹽酸服裂解細(xì)胞，所生成的DNA較?。s80Kb）,用于Southern雜交，效果極佳。

107、簡述Southern雜交的步驟。

答：①瓊脂糖凝膠電泳分離哺乳動(dòng)物基因組DNA的限制酶切片段。

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②將DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體上。

③放射性標(biāo)記的探針與固定化的核酸雜交。

108、將DNA或RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到大相支持體（硝酸纖維素濾膜或尼龍膜）的方法有哪幾種？

答：

①毛細(xì)管轉(zhuǎn)移：核酸片段由液流攜帶從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于固相支持體表面。

②電轉(zhuǎn)移：不適用于硝酸纖維素膜。適用于尼龍膜。

③真空轉(zhuǎn)移：

109、雜交試驗(yàn)中常用降低背景的封閉劑有哪些？

答：

①Denhardt試劑：適用于Southern,Northern雜交

②BLOTTO：適用于Grusteiu-Hoyness雜交。

③肝素：適用于Southern雜交；原位雜交。

④經(jīng)變性并被打斷的鯉精DNA：適用于Southern,Northern雜交。

110、放射性標(biāo)記核酸探針的方法有哪幾種？

答：

①磷酸化法：由T4噬菌體多核甘酸激酶催化，將ATP的丫磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5'羥基端；

②切口平移法：利用大腸桿菌DNA聚合醐I,把雙鏈DNA未標(biāo)記的核甘酸置換成a」2P標(biāo)記的核甘酸。

③將克隆化DNA區(qū)段體外轉(zhuǎn)錄成高比活度的單鏈RNA。

11K篩選表達(dá)文庫時(shí)所用的配體有哪幾類？

答：篩選表達(dá)文庫時(shí)，要利用一個(gè)能與目的蛋白特異結(jié)合的配體，這樣的配體分成3類：

①已知可在體內(nèi)與目的蛋白作用的蛋白質(zhì)或小分子化合物；

②抗目的蛋白抗原表位的免疫球蛋白；

③可被蛋白質(zhì)識(shí)別的小段DNA序列，比如真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)系統(tǒng)中的反式作用因子。

112、目前常用的DNA序列測定方法有哪幾種？

答：酶法和化學(xué)