蛋白質與酶工程第五章酶和細胞固定化演示文稿目前一頁\總數一百三十五頁\編于十七點優選蛋白質與酶工程第五章酶和細胞固定化目前二頁\總數一百三十五頁\編于十七點Contentsofchapter51、什么是固定化技術和固定化酶2、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術4、固定化酶的特點GoGoGoGo6、細胞、原生質體的固定化5、固定化酶的應用GoGo目前三頁\總數一百三十五頁\編于十七點5.1什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術目前四頁\總數一百三十五頁\編于十七點化學偶聯酶固定化間歇可溶交聯包埋吸附間歇連續酶的固定化技術和固定化酶目前五頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化酶：經提取和分離純化后的酶固定化菌體(死細胞)：含酶菌體或菌體碎片固定化細胞：在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞目前六頁\總數一百三十五頁\編于十七點優點：不溶于水，易于與產物分離；可反復使用；可連續化生產；穩定性好。缺點： 固定化過程中往往會引起酶的失活

首次投入成本較高

大分子底物較困難本章目錄目前七頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技術迅速發展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業上生產應用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸連續生產L-氨基酸，實現了酶應用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學術會議上，確定固定化酶的統一英文名稱為Immobilizedenzyme。5.2固定化酶的研究歷史目前八頁\總數一百三十五頁\編于十七點隨著固定化技術的發展，出現固定化菌體。1973年，日本首次在工業上應用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續生產L-天門冬氨酸。在固定化酶和固定化菌體的基礎上，70年代后期出現了固定化細胞技術。1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產淀粉酶，開始了用固定化細胞生產酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生質體生產谷氨酸，取得進展。固定化原生質體由于解除了細胞壁的障礙，更有利于胞內物質的分泌，這為胞內酶生產技術路線的變革提供了新的方向。本章目錄目前九頁\總數一百三十五頁\編于十七點5.3酶固定化技術活性中心：保護酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在制備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位于酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強堿等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應盡量在非常溫和的條件下進行。固定化酶操作的注意事項目前十頁\總數一百三十五頁\編于十七點目前十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點酶固定化方法（一）吸附法（二）包埋法（三）結合法（四）交聯法目前十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點1、吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。

優點：操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。

缺點：由于靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。目前十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點2、包埋法

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯樹脂、聚酰胺、火棉膠等。根據載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等目前十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點

按照包埋后的形狀不同，包埋法可分為網格型和微囊型兩種。將酶或細胞包埋在高分子凝膠網格中的稱為網格型，將酶包埋在球狀半透膜中的稱為微囊型。包埋法一般不需要與酶形成共價鍵的反應，幾乎不改變酶的高級結構，酶活回收率高，因此可以用于許多酶、細胞、細胞器的固定化。目前十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點（1）網格型

形成網格有兩種方法，一種方法是把酶或細胞與能形成高分子聚合物的單體混合，然后使單體聚合成網格狀凝膠，如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂等，酶或細胞就被包埋在網格中。另一種方法是將溶膠狀的天然高分子物質與酶或細胞混合，然后凝膠化，如淀粉、瓊脂、明膠、膠原、海藻酸、角叉菜膠等。網格型包埋是固定細胞用得最多且最有效的方法。目前十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點（2）微囊型

微囊通常是直徑幾微米到幾百微米的球狀體，內有含酶的溶液，微囊的膜可讓小分子物質通過，但酶不能通過。小分子底物通過擴散進入囊內，經酶反應生成產物后再擴散出來。作為膜材料的有硝酸纖維素（用乙醇和乙醚混合液溶解則為火棉膠）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龍、聚酰胺、聚脲等。目前十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點微囊型固定化酶的特點

微囊型顆粒比網格型顆粒要小得多，有利于底物和產物的擴散，但微囊制備時反應條件要求高，制備成本也高。脂質體是用表面活性劑和卵磷脂制成的液膜微囊。

目前十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點包埋法的優缺點包埋法操作簡單，適用于大多數酶；包埋時不改變酶的結構，不影響酶的活性。

在發生化學聚合反應時包埋，酶容易失活，必須小心設計反應條件。包埋法只適合于固定那些底物和產物均為小分子的酶，對于那些作用于大分子的酶來說是不合適的，因為只有小分子底物和產物才能通過高分子凝膠的網格及半透膜擴散，而大分子底物無法與網格中或微囊中的酶或細胞接觸。

目前十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點首先被采用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，引發劑目前二十頁\總數一百三十五頁\編于十七點海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯的離子網絡凝膠。顆粒大小可實時監控目前二十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點脂質體包裹目前二十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點3、結合法

選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法共價鍵結合法目前二十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點離子結合法離子結合法是酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不性載體上的固定化方法。此法的載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂，如DEAE-纖維素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。DEAE——二乙胺基乙基目前二十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點離子結合法的優缺點離子結合法優點操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。缺點是載體和酶的結合力較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度較高的條件下進行反應時，往往會發生酶從載體上脫落的現象。目前二十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點共價結合法共價結合法是酶以共價鍵結合于載體上的固定化方法，即將酶分子上非活性部位功能團與載體表面反應基團進行共價結合的方法。常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體。一般先用化學方法將載體活化，再與酶分子表面的某些基團如羧基、氨基、羥基等反應，形成共價鍵。目前二十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點載體活化的主要反應重氮法疊氮法溴化氰法芳香烴化法目前二十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點CompanyLogo（1）重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。目前二十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點CompanyLogo（2）疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應基團偶聯成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。目前二十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點CompanyLogo（3）溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。目前三十頁\總數一百三十五頁\編于十七點CompanyLogo（4）烷基化和芳基化法以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發生烷基化或芳基化反應而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。目前三十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點CompanyLogo優點：共價鍵的鍵能高，酶和載體之間的結合相當牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩定性好、可連續使用較長時間的優點。缺點：載體活化的難度較大，操作復雜，反應條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學反應，易引起酶蛋白空間構象變化。共價鍵結合法目前三十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點目前三十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點4、交聯法借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的游離氨基反應，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯，制成固定化酶或固定化菌體。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。目前三十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯法與吸附法或包埋法聯合使用，以取長補短。目前三十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點（1）吸附交聯法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。（2）交聯包埋法把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質進行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固定化酶穩定性好。目前三十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶目前三十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點目前三十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點各類固定化方法的特點比較:比較項目吸附法包埋法結合法交聯法物理吸附共價鍵結合離子鍵結合制備難易易較難難易較難固定化程度弱強強中等強活力回收率較高高低高中等載體再生可能不可能不可能可能不可能費用低低高低中等底物專一性不變不變可變不變可變適用性酶源多小分子底物、藥用酶較廣廣泛較廣目前三十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點傳統的酶固定化方法的缺點：

酶在任意位點與載體進行連接，使酶活性位點不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此定向固定化酶技術將成為今后固定化酶研究的熱點。目前四十頁\總數一百三十五頁\編于十七點新型的酶固定化方法新型的酶的固定化方法，要在較為溫和的條件下進行，盡量減少或避免酶活力的損失，并提高固定化效率。通過輻射、光、等離子體、電子、“柔性鏈”等新方法均可制備高活性固定化酶。目前四十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點如光偶聯法是以光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶，由于條件溫和，可獲得酶活力較高的固定化酶。目前四十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點等離子體是高度激發的原子、分子、離子以及自由基的聚集體，大量的等離子體常在室溫下存在。載體材料表面可以用等離子體進行修飾，從而引入活性基團。目前四十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點偶合（耦合）固定化也是新近發展起來的一種酶固定化方法，基本上能夠解決單一固定化方法酶活回收率低、穩定性差、傳質阻力大等問題，并具有方法多樣、操作簡便、技術成熟等特點。目前四十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點從較早的吸附—交聯法、包埋—交聯法開始，偶合固定化技術已經得到越來越多的應用，先后提出并研究了包埋—吸附法、絮凝—吸附法、吸附—交聯法、膜—吸附法等方法。目前四十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點無載體固定化酶直接利用交聯劑交聯溶解酶、晶體酶、物理聚集酶和噴霧干燥酶而形成交聯溶解酶、交聯酶晶體、交聯酶聚集體和交聯噴霧干燥酶等4種無載體酶系統。目前四十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點與傳統固定化酶相比，無載體酶具有以下一些優點：①催化活性高，成本低；②具備較高的催化劑比表面；③可加入多種酶；④底物擴散受限較少；⑤在極端條件、有機溶劑和蛋白酶中的穩定性較高。目前四十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點此外，研究人員還開發了一些定向固定化的方法，如利用酶和抗體之間的親和性、酶和金屬離子形成復合物、通過酶分子上的糖基部分固定化、用分子生物學方法使酶定向固定化等。本章目錄目前四十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點5.4固定化酶的特性：1.固定化后酶活力的改變2.固定化對酶穩定性的影響3.固定化酶的最適溫度變化4.固定化酶的最適pH變化5.固定化酶的專一性變化目前四十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點游離的酶經固定化后，酶本身的結構會受到影響。由于它的催化作用由均相轉到非均相，由此帶來的擴散限制效應、空間障礙、載體的分配效應等因素必然影響到酶的性質。目前五十頁\總數一百三十五頁\編于十七點1.固定化后酶活力的改變在多數情況下，酶固定化后的活力比天然酶小，其專一性也會發生改變。例如，用羧甲基纖維素做載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對低分子底物苯酞精氨酸—對硝基酰替苯胺的活力保持80％。目前五十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點所以，一般認為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。目前五十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點在相同測定條件下，固定化酶的活力低于等摩爾原酶的活力，其原因可能是：目前五十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點①酶分子在固定化過程中，空間構象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會直接影響到活性中心對底物的定位作用；目前五十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點③內擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；④包埋時酶被高分子物質半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶接近。目前五十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點不過也有例外，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾，或固定化過程提高了酶的穩定性。目前五十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點2.固定化對酶穩定性的影響穩定性關系到固定化酶能否實際應用。在大多數情況下，酶經過固定化后其穩定性都有所增加，這是十分有利的。具體表現在以下三個方面：目前五十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點（1）熱穩定性提高

作為生物催化劑，酶也和普通化學催化劑一樣，溫度越高，反應速度越快。但是大多數酶是蛋白質組成的，一般對熱不穩定。因此，不能在高溫條件下進行反應，而固定化酶耐熱性提高，使酶最適溫度提高，酶催化反應能在較高溫度下進行，加快反應速度，提高酶作用效率。目前五十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點（2）對有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高酶經過固定化后，提高了對各種有機溶劑的穩定性，使本來不能在有機溶劑中進行的酶反應成為可能。可以預計，今后固定化酶在有機合成中的應用會進一步發展。目前五十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點（3）對pH、蛋白酶、貯存和操作條件的穩定性提高

固定化酶穩定性提高的原因可能有：①固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形；②酶活力的緩慢釋放；③抑制酶的自降解。將酶與固態載體結合后，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了降解。目前六十頁\總數一百三十五頁\編于十七點3.固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反應速度的綜合體現。由于固定化后，酶的熱穩定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是非常有利的結果。目前六十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點4.固定化酶的最適pH變化酶的催化能力對外部環境特別是pH非常敏感。酶固定化后，對底物作用的最適pH和酶活力-pH曲線常常發生偏移。曲線偏移的原因是微環境表面電荷性質的影響。目前六十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點一般說來，用帶負電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。目前六十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點原因的解釋這是因為多聚陰離子載體會吸引溶液中陽離子，包括H+，使其附著于載體表面，結果使固定化酶擴散層H+濃度比周圍的外部溶液高，即偏酸，這樣外部溶液中的pH必須向堿性偏移，才能抵消微環境作用，使其表現出酶的最大活力。目前六十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點反之，帶正電荷載體(陽離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏低。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。目前六十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點5.固定化酶的專一性變化固定化酶的底物特異性與游離酶可能不同，其變化與底物相對分子質量的大小有關。作用于低分子底物的酶，專一性沒有明顯變化。既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，其專一性往往會有變化。專一性的改變，是由于空間位阻作用引起的。目前六十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點由于靜電作用，與載體電荷性質相反的底物在固定化酶微環境中的濃度比整體溶液中的高，與溶液酶相比，固定化酶的表觀Km值低于溶液的Km值；而載體與底物電荷相同，則會造成固定化酶的表觀Km值顯著增加。目前六十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點由于高級結構變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。這種Km變化又受溶液中離子強度影響。離子強度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。本章目錄目前六十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—AlaAminoacylase

氨基酰化酶5.5固定化酶的應用世界上第一種工業化生產的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續生產L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再進行拆分。生產成本僅為用游離酶生產成本的60％左右。目前六十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點高果糖漿的生產世界上生產規模最大的一種固定化酶。將培養好的含葡萄糖異構酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，催化葡萄糖異構化生成果糖，用于連續生產果葡糖漿。目前七十頁\總數一百三十五頁\編于十七點酶傳感器酶傳感器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當的載體結合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶傳感器是酶電極，即將固定化酶膜與轉換電極做在一起，當酶膜與被測物發生催化反應而生成電極活性物質后，電極測定活性物質并將其轉換為電信號輸出。目前七十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。酶電極一般可根據電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，后者有NH3、CO2、H2電極等。較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極。目前七十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點葡萄糖酶電極結構示意圖

葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發生氧化反應，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消耗的氧或生成的過氧化氫就可了解葡萄糖濃度。

目前七十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點手掌型葡萄糖(glucose)分析儀目前七十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產生的2NH4+為陽離子電極感應。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青霉素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產生NH3目前七十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點一些常見的酶電極底物酶電極5′－腺苷酸5′－腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫酶Pt過氧化物過氧化氫酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L－氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt(H2O2)琥珀酸琥珀酸脫氫酶Pt(O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN－硝酸鹽硝酸鹽還原酶/亞硝酸鹽還原酶NH4+亞硝酸鹽亞硝酸鹽還原酶NH3（氣體）草酸草酸脫羧酶CO2（氣體）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脫氫酶；細胞色素bPt，Fe（CN）-4L－氨基酸脫羧酶CO2L－精氨酸精氨酸酶NH4+L－天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+本章目錄目前七十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點1、微生物、植物和動物細胞固定化5.6細胞和原生質體固定化目前七十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點細胞特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um20-3001-1010-100倍增時間/h>120.3-6>15營養要求簡單簡單復雜光照要求大多數要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數不敏感敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶目前七十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化細胞培養技術利用物理或化學手段將游離細胞限制于特定空間里或表面的培養技術。培養液可在細胞間流動，細胞將產物分泌到培養液中，不需破碎細胞即可源源不斷地從培養液中獲得所需成分。目前七十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點原理：密集而有一定程度分化的、生長緩慢的細胞能比分散而無結構的、生長迅速的細胞積累更多的次生代謝產物目前八十頁\總數一百三十五頁\編于十七點優點——與懸浮培養相比可以消除或極大地減弱營養液流動引起的切變力細胞生長緩慢，使次級代謝物（對人類有用）的產量增高，高產的固定化細胞的生物合成能力可達游離細胞的100倍目前八十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化之后使細胞間的接觸緊密，氣體和營養供應形成梯度，細胞有如在生物體組織中，有利于次生代謝進行通過培養液的循環供應，一方面可以保障細胞的營養需要；另一方面可以避免由于代謝產物的積累而對細胞代謝造成反饋抑制優點——與懸浮培養相比目前八十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點便于操作培養基的組分和比例——次生代謝產物產量調節較成批培養簡單：避免細胞受損和污染容易建立化學和物理上的梯度優點——與懸浮培養相比目前八十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點便于次生代謝物的收集外分泌型細胞：直接在培養基中收集產物內分泌型細胞：通過化學誘導使其釋放產物到培養液中消除產物對代謝的反饋抑制作用，將產量提高到最大程度優點——與懸浮培養相比目前八十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點缺點必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產物的純度；必須抑制細胞內蛋白酶對目的酶的分解；胞內多酶的存在，會形成副產物；載體、細胞膜或細胞壁會造成底物滲透與擴散的障礙等。目前八十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點一、植物細胞固定化培養技術目前八十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點1、植物細胞固定化在植物細胞培養方法中，該法是最新的培養技術，而且是一種最接近自然狀態下的培養方法固定化的結果：促使細胞以多細胞狀態或局部組織狀態一起生長，且細胞處于靜止狀態，所建立起來的物理和化學因子梯度能提供一種最接近細胞體內狀態的環境目前八十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點優點研究發現生長迅速且松散的細胞其次生代謝物積累水平極低，主要為初級代謝產物而聚集的或部分組織化的細胞所積累的次生代謝產物要比生長迅速而松散的細胞高目前八十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點聚集化和組織化的作用培養細胞的組織化水平越接近整體植株水平，就越能以整體植株相同的方式對環境因子的刺激起反應聚集的細胞其生長速度低于游離的懸浮培養細胞，且生長速度的降低與次級代謝物產量的提高之間有正相關性目前八十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點2、植物細胞的固定化方法根據細胞的種類、大小和特性的不同，選擇不同的固定化方法主要分吸附法和包埋法兩類吸附法——吸附在固體吸附劑表面包埋法——包埋在多孔載體內部共價結合法和交聯法目前九十頁\總數一百三十五頁\編于十七點2.1吸附法使用固體吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料的大孔隙或裂縫中中空纖維的外壁例如將多孔陶瓷顆粒洗凈和滅菌后置懸浮細胞中進行振蕩培養，一段時間后細胞就會吸附在多孔陶瓷的孔洞內，并在其中生長繁殖和新陳代謝目前九十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點根據吸附劑的特點分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等2）離子結合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素目前九十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點中空纖維固定植物細胞將植物細胞定置于中空纖維的外壁和外殼容器的內壁之間培養液及氣體在中空纖維的管內流動，各種營養成分和溶解氧通過中空纖維的半透膜管壁傳遞給外壁的細胞細胞的代謝產物又通過中空纖維膜分布到管內培養液中，并隨培養液流出目前九十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點聚丙烯中空纖維膜目前九十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點此法近似于植物體內物質的傳遞與交換形式，有利于細胞生長和新陳代謝的進行中空纖維作為固定化載體的缺點有時纖維管會阻塞而影響物質傳遞中空纖維成本較高，難以大規模生產利用目前九十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點吸附法優缺點操作簡便易行對細胞的生長、繁殖和新陳代謝沒有明顯的影響吸附力較弱、吸附不牢固細胞容易脫落，使用受到一定的限制目前九十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點2.2包埋法將細胞包埋在多孔載體內部凝膠包埋法以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內而使細胞固定化的方法。細胞經包埋固定后，被限制在凝膠的微孔內進行生長、繁殖和新陳代謝半透膜包埋法目前九十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點凝膠包埋法應用最廣泛適用于各種植物細胞、動物細胞和微生物細胞使用的載體海藻酸鈣凝膠、角叉才膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂、瓊脂等目前九十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點①瓊脂凝膠包埋法目前九十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點也可將瓊脂細胞混懸液攤成薄層，待其冷卻凝固后，在無菌條件下，將固定化細胞膠層切成所需的形狀缺點瓊脂糖凝膠的機械強度較差氧氣、底物和產物的擴散比較困難應用受限目前一百頁\總數一百三十五頁\編于十七點細胞工程黃林彬瓊脂凝膠目前一百零一頁\總數一百三十五頁\編于十七點②海藻酸鈣凝膠包埋法目前一百零二頁\總數一百三十五頁\編于十七點操作簡便、條件溫和、對細胞無毒性通過改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑，適合多種細胞的固定化磷酸鹽（營養液中）會破壞凝膠的結構，應控制好其濃度在營養液中保持一定濃度的鈣離子，維持凝膠結構的穩定性目前一百零三頁\總數一百三十五頁\編于十七點海藻酸鈣凝膠目前一百零四頁\總數一百三十五頁\編于十七點③角叉菜膠包埋法溶解、滅菌、冷卻到35-50℃與細胞懸浮液混勻后滴到預冷的氯化鉀溶液中，制成小球狀固定化細胞膠粒也可按需制成片狀或其它形狀凝聚成型時可使用其它陽離子，如NH4+、Ca2+等目前一百零五頁\總數一百三十五頁\編于十七點角叉菜膠具有一定的凝膠強度、對細胞無毒害通透性較好，是一種良好的固定化載體應用廣泛目前一百零六頁\總數一百三十五頁\編于十七點④明膠包埋法明膠是一種蛋白質，易受蛋白酶的分解高壓蒸汽滅菌，105℃，1.05MPa，15分鐘冷卻至35℃以上目前一百零七頁\總數一百三十五頁\編于十七點⑤聚丙烯酰胺凝膠包埋法目前一百零八頁\總數一百三十五頁\編于十七點目前一百零九頁\總數一百三十五頁\編于十七點機械強度高，孔徑與丙烯酰胺濃度相關但丙烯酰胺單體對細胞有一定的毒害作用，應盡量縮短聚合時間目前一百一十頁\總數一百三十五頁\編于十七點⑥光交聯樹脂包埋法在光的作用下分子間發生交聯反應，生成不溶性網狀聚合物——光交聯樹脂作用原理：在一定波長的光引發下，帶有可以發生光交聯反應官能團高分子之間發生加成性交聯聚合反應，生成不溶性交聯產物為了增加光敏感范圍，此類樹脂在使用時有時需要加入光敏化劑目前一百一十一頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定過程目前一百一十二頁\總數一百三十五頁\編于十七點不同分子量的預聚物形成不同孔徑的樹脂，適合多種不同直徑的細胞固定光交聯樹脂的強度高，可連續使用較長的時間用紫外光照射幾分鐘就可完成固定化，時間短對細胞的生長繁殖和新陳代謝沒有明顯影響目前一百一十三頁\總數一百三十五頁\編于十七點半透膜包埋半透膜包埋法是將細胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內半透膜：直徑幾十微米到幾百微米厚約25nm植物細胞孔徑>半透膜孔徑小于半透膜孔徑的小分子底物和產物可以自由進出，被稱為“人工細胞”目前一百一十四頁\總數一百三十五頁\編于十七點2.3共價結合法細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，從而形成為固定化細胞細胞與載體結合緊密，不易脫落；但制備較難，且活力損失較大目前一百一十五頁\總數一百三十五頁\編于十七點載體：親水載體優于疏水載體天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機械性能好，但有疏水結構尼龍目前一百一十六頁\總數一百三十五頁\編于十七點2.4交聯法利用雙功能或多功能試劑，直接與細胞表面的反應基團（如氨基酸、羥基、咪唑基等）發生反應，使其彼此交聯形成網狀結構的固定化細胞，其結合力是共價鍵此法制備麻煩，活力損失較大；但細胞與載體結合較緊目前一百一十七頁\總數一百三十五頁\編于十七點3、固定化植物細胞的特點與懸浮培養相比有以下特點：植物細胞經固定化后，由于有載體的保護作用，可減輕剪切力和其它外界因素對植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩定性細胞經固定化后，被束縛在一定的空間范圍內進行生命活動，不容易聚集成團目前一百一十八頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化植物細胞培養可以簡便地在不同的培養階段更換不同的培養液首先在生長培養液中生長增殖，在達到一定的細胞密度后，改換成發酵培養液，以利于生產各種所需的次級代謝物目前一百一十九頁\總數一百三十五頁\編于十七點固定化植物細胞可反復使用或連續使用一段較長的時間，大大縮短生產周期，提高產率固定化植物細胞易與培養液分離，利于產品的分離純化，提高產品質量目前一百二十頁\總數一百三十五頁\編于十七點注意事項為了長期利用，需要防止固定化細胞過度生長措施采用有限度的營養培養基改變培養基的激素濃度，限制其生長否則會引起滲漏或