反相層析Reversedphasechromatography,RPC江南大學醫藥學院反相層析概述原理反相層析介質反相層析的流動相層析技術應用1概述反相層析法的建立追述到1950年，Howard和Martin用正辛烷作為固定相，水作為流動相進行石蠟油的液-液層析分離，并且把這種方法命名為反相層析所謂“正相”或“反相”，主要是指固定相和流動相的相對極性大小，反相層析因與傳統分配層析剛好相反而得名，其固定相非極性強而流動相極性相對較高，樣品中組分被洗脫的順序是極性較高的組分先流出，極性較低的后被洗脫反相層析流動相的溶劑洗脫強度變化范圍大，使溶質保留值的差別可以達到1-2個數量級，因此反相層析可分離的溶質范圍很寬，從極性較大的寡肽、小分子有機物到疏水性較強的生物大分子反相層析能夠區分分子在疏水性質方面的細微差異而有效地進行分離，具備高分辨率的特性2原理2.1反相層析作用原理疏溶劑理論（solvophobictheory） 反相層析機理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏溶劑理論，假設反相層析介質是表面均勻密集的覆蓋著非極性配基的顆粒，溶質分子由于受到極性流動相的斥力而以其疏水部分結合至固定相的非極性配基上，除此之外溶質與固定相之間不存在其他任何相互作用親硅醇基效應（silanophilicinteraction）

一定條件下硅膠表面殘余的硅醇基能與溶質發生相互作用，包括：靜電作用和氫鍵作用，從而對溶質的保留行為起決定作用;親硅醇基效應常導致溶質保留值重復性差，洗脫峰脫尾等不良層析行為控制流動相pH，硅膠表面均勻覆蓋非極性配基，屏蔽殘余硅醇基，可基本排除親硅醇基效應的影響;新型反相層析介質聚苯乙烯等高分子聚合材料的開發可根本消除親硅醇基效應的影響。2.2反相層析的分離過程起始階段：用具有合適pH、I和極性的流動相A平衡反相層析柱吸附樣品：加樣至層析柱，洗去未結合的溶質開始解吸：通過調節流動相極性等方式將反相介質上吸附的溶質順序解吸完全解吸：移除前一步未解吸的物質再生：介質從100%流動相B重新過渡到流動相A3反相層析介質3.1介質的構成基質：硅膠、聚苯乙烯等配基：正烷烴基團（n-烷基），常用的有辛基（C-8）和十八烷基（C-18），其他還包括丙基、丁基、丙基苯基、二苯基等3.1.1基質硅膠優點：機械強度高，能承受高壓、高流速，理化穩定性好，多孔性結構缺點：高pH條件下會溶解，并且會產生負電荷，對分離造成不良影響，只能在酸性條件下使用SiOHSiSiO聚苯乙烯在強酸強堿性條件下穩定性好，不產生親硅醇基效應3.1.2配基正烷烴基n-辛基n-十八烷基n-丙基二苯基等3.1.3配基與基質的偶聯用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅膠表面殘留的硅醇基配基較大時，由于空間位阻效應，導致親硅醇基效應存在3.2反相層析介質的性質粒徑RPC是與HPLC技術伴隨發展的，有著高分辨率，反相介質的粒徑一般在5~30μm之間，小于常用的凝膠過濾介質和離子交換劑，有著較高的柱效分析型應用：<15μm介質制備型應用：>15μm介質孔徑通常在10～50nm之間，孔徑的大小直接影響到有效結合容量，10nm左右孔徑的介質分離小分子物質，孔徑在30nm以上的介質分離生物大分子配基密度通常情況下反相介質有著較高的配基密度當配基鏈長超過C6時，配基密度在同一數量級時對相對保留值的影響很小結合容量每毫升反相介質能結合溶質的毫克數（mg溶質/mL介質），分為靜態結合容量和動態結合容量結合容量取決于溶質的分子大小、疏水性，介質的多孔性、配基密度，流動相的組成、pH，操作流速等機械強度用最大操作壓力（MPa）或最大線性流速（cm/h）表示穩定的理化性質3.3常見的反相層析介質3.3.1SOURCETMRPC系列基于聚苯乙烯的反相介質，用于肽、蛋白質、寡聚核苷酸等的分析型和制備型分離純化，能夠在高流速條件下實現對樣品的快速、可重復、高容量和高分辨率分離根據介質的粒徑不同，該系列包括SOURCE5RPC、SOURCE15RPC和SOURCE30RPC三個規格SOURCERPC系列介質的主要特性SOURCERPC良好的重復性優秀的放大能力優秀的流速/壓力特性3.3.2μRPCC2/C18系列是以粒徑為3μm的多孔硅膠微粒為基質，鍵合二碳和十八碳的烷烴基團形成的反相介質具有非常小的粒徑，具有很高的效率和優秀的分辨率，十分適合于用于肽譜分析，分析型和極微量純化過程。以預裝柱形式出售，有兩種不同的規格μRPCC2/C18PC3.2/30μRPCC2/C18PC2.1/100μRPCC2/C18反相層析柱的特性3.3.3SephasilProtein/SephasilPeptide系列以多孔硅膠作為基質的，提供兩種不同的粒徑，分別是5μm和12μm，前者適用于高分辨率分析和純化，后者適用于制備型純化有三種不同配基，分別為C4，C8和C18，其疏水性依次增強SephasilProtein孔徑較大，為30nm，允許蛋白質等生物大分子進入，因而適用于蛋白質的分離純化；SephasilPeptide孔徑較小，在10nm左右，更適合于較小的生物分子如肽類等的分離純化Sephasil系列預裝柱的特性4反相層析的流動相流動相組成影響層析過程的容量因子和選擇性，從而很大程度決定著Rs由多種成分組成的，其中包含水、一至兩種的有機溶劑、調節pH的緩沖組分（酸）、調節溶質選擇性的離子對試劑等，有時還需其它種類的添加劑分為流動相A（起始流動相）和流動相B（極限流動相），一般線性過渡4.1有機溶劑又稱為修飾劑（modifier），其作用是降低流動相極性，增強洗脫能力流動相A為水相或者有機溶劑體積分數較低的溶劑-水混合相，而流動相B則是有機溶劑體積分數較高的溶劑-水混合相甚至不含水的純有機相要求是能夠與水互溶，有較低的紫外截止波長和較低的粘度截止波長：此波長下光程為1cm的純溶劑的吸光度為1反相層析中常用有機溶劑的部分性質有機溶劑的種類直接關系到對樣品組分的選擇性，因此在分離效果不理想時，可以對溶劑的使用進行優化反相層析的流動相大多采用二元系統，即由水和一種有機溶劑組成洗脫能力：甲醇<乙醇<乙腈<1-丙醇<2-丙醇根據分離實際需要，也可采用兩種甚至兩種以上的修飾劑構成三元、四元的流動相系統，以期獲得合適的洗脫強度和最佳的選擇性在分離多肽和蛋白質時應當慎用多元流動相，這是因為復雜的溶劑體系會導致多肽和蛋白質的沉淀和變性4.2流動相的pH控制流動相pH的改變會影響到溶質的解離狀態、固定相表面殘留硅醇基和其它吸附基團的解離情況、以及添加至流動相的可解離組分的離子平衡，因此pH值的改變會引起溶質選擇性和保留值的改變酸性條件常用三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）和正磷酸調節pH，接近中性時常用乙酸銨或磷酸鹽來調節pH，堿性條件用NaOH來調節控制在（a）pH2和（b）pH12條件下分離血管緊張肽Ⅱ和血管緊張肽Ⅲ

反相層析流動相條件大多在低pH下（通常pH2～4之間），因為：很多樣品組分在低pH下有較好的溶解性低的pH值抑制了樣品組分中酸性基團及硅膠上硅醇基的解離由于目前還不明確的原因，多數蛋白質和肽類在低于其等電點的pH條件下操作可以獲得更高的選擇性在低pH時可采用低的離子強度，這樣更易于回收樣品4.3離子對試劑離子對試劑也稱為平衡離子，是通過離子作用與溶質分子結合，引起溶質疏水性質的改變，從而使得樣品組分的保留值和選擇性發生變化離子對試劑中很多本身就是酸或堿，可同時起維持流動相pH的作用，典型的使用濃度范圍是0.01%~0.1%或10~100mmol/L離子對試劑在高濃度有機溶劑中要有足夠的溶解度，對波長220nm以上的紫外線不能有明顯吸收在某些情況下，離子對試劑是溶質結合至反相介質所必需的4.4其它種類的添加劑Brij：十二烷基聚氧乙烯醚5層析技術反相介質和層析柱的選擇流動相的選擇和準備樣品的準備和加樣操作洗脫模式的選擇和層析條件控制樣品的檢測和收集層析柱的再生、清洗和貯存5.1反相介質和層析柱的選擇5.1.1層析介質的選擇選擇依據：根據分離要求，包括規模和流動相條件樣品組分的分子量和尺寸樣品組分的疏水性樣品組分的種類根據分離要求分辨率－介質的選擇性（基質、配基種類）和柱效（介質粒徑和層析柱的填充）純化規模－流速性能和結合容量（粒徑）流動相條件－介質的穩定性（基質）樣品組分的分子量結合容量－粒徑和孔徑樣品組分的疏水性對樣品中目標組分的疏水性強弱有個大致評估：疏水性弱的溶質，如氨基酸、寡聚核苷酸等，選用疏水性強的配基，如C18（十八烷基）；疏水性較強的溶質，選用疏水性較弱的配基，如C8（辛基）以下碳鏈的配基樣品組分的種類生物大分子雖然大多是親水性，但穩定性較差，建議采用配基較短（C8以下）的介質5.1.2層析柱尺寸的選擇 層析柱的尺寸由內徑和柱長所界定，其取值主要取決于分離的規模和所需的分辨率內徑在柱長固定的情況下，內徑決定了柱體積，RPC在放大層析規模時，都是在優化好層析條件后，固定柱長不變，增大層析柱內徑來放大加樣量對Rs的影響柱長反相介質粒徑普遍較小，本身有著較高的柱效，一般所用層析柱柱長較短對于寡肽等生物小分子，適當增加柱長能夠改善Rs生物大分子在反相柱中的保留值對于流動相的微小變化十分敏感，可以認為是由開/關機制控制，增加柱長不能明顯改善Rs5.1.3層析柱的準備一般過程：以低速或中等流速用3CV的流動相B清洗層析柱以同樣的流速在2~3CV內運行從100%流動相B到100%流動相A的線性梯度用至少5CV的流動相A平衡層析柱，直至所有信號達到穩定5.2流動相的選擇和準備生物分子RPC所用流動相常包含一種緩沖組分，一種修飾劑，有時還含有一種離子對試劑乙腈和甲醇是最常用的，條件摸索階段以其中一種作為修飾劑，溶質在固定相上吸附較為牢固時，可考慮更換洗脫能力較強的修飾劑如異丙醇等溶質分子，特別是蛋白質等生物大分子在所用溶劑中的穩定性是須考慮的因素分離樣品性質不明的情況下，一般流動相A為水相，不含修飾劑，而流動相B為100%有機相反相層析多數在低pH條件下運行，流動相的pH通過添加一定濃度的酸來調節；往流動相中添加離子對試劑可以改變溶質的保留值和選擇性，獲得較好的分離效果；對于帶正電荷的溶質應選擇帶負電荷的離子對試劑，如三氟乙酸等，對于帶負電荷的溶質則應選用帶正電荷的離子對試劑，如季銨鹽等準備流動相時，所用到的各種試劑都應當是最高純度級別的，所用的水也應是超純水，添加了固體的流動相應當用0.22μm的濾膜過濾5.3樣品的準備和加樣操作理想情況下應將樣品溶于流動相A后加樣，如樣品在流動相A中溶解不好，可考慮添加有機酸、鹽類等試劑來增加樣品的溶解性，液體樣品體積較小時可直接加樣；樣品在加樣前應當通過10000g離心10min或用0.22μm微孔濾膜過濾除去任何可能存在的顆粒物；對于組分特別復雜的樣品，建議先用其它技術除雜反相層析柱通常是預裝柱或帶有可調接頭的自裝柱，連接于HPLC系統，加樣操作按HPLC系統提供的標準進行5.4洗脫模式的選擇和層析條件控制在洗脫模式方面，分為階段洗脫和梯度洗脫階段洗脫優點：操作簡單、分離時間短、流動相消耗少，重復性好梯度洗脫優點：分離效果好階段洗脫應用于脫鹽及一些較大規模的分離，對于需要高Rs的分離，需要用線性梯度洗脫梯度洗脫是采用修飾劑體積分數連續變化的流動相對吸附樣品進行洗脫，梯度的形狀主要分為線性梯度和非線性梯度，其中線性梯度又可分為連續線性梯度和分段線性梯度連續線性梯度和分段線性梯度的比較在流速恒定的情況下梯度斜率改變對分辨率的影響首次層析時通常采用很寬的線性梯度洗脫以確定目標分子的洗脫條件，常用梯度：10~30CV內從0%B到100%B根據實驗結果調整洗脫條件，在需要更高Rs的位置降低梯度斜率在Rs已能滿足要求的情況下，不提倡采用過小的斜率，會造成峰寬增加當降低斜率無法達到Rs要求時，應考慮更換修飾劑、流動相pH或添加離子對試劑來改變選擇性流速的選擇降低流速在一定程度上可以提高柱效，但同時也會增加溶質的縱向擴散大分子RPC的Rs對流速并不敏感，過低的流速反而會造成分辨率下降，同時使分離時間延長過高的流速使動態結合容量下降溫度的選擇在分離一些低分子量物質時，升高溫度能降低流動相黏度，增加傳質速度，減少區帶變寬現象，從而提高柱效，對于改善分辨率是有利的；在分離蛋白質等生物大分子時，通常在常溫下操作，防止目標分子活性喪失RPC中固定相和流動相對蛋白質構象的影響及應對策略流動相介導蛋白質構象改變該現象與蛋白滯留在固定相表面的時間無關，對蛋白在不同組成的流動相的穩定性進行研究，選用對目標蛋白提供最大穩定性的溶劑復合物作為流動相固定相的配基或基質引起的構象改變該現象與流動相組成無關，依賴于固定相表面積、孔隙特征、配基密度和洗脫時間，可采用短柱，陡峭的梯度和無孔型固定相流動相組成和固定相共同導致蛋白變性輕微改變層析系統相比或流動相組成，或更換其他層析技術5.5樣品的檢測和收集最常用的也是紫外檢測（考慮修飾劑、離子對試劑等的干擾），此外，熒光檢測器、視差折光檢測器、電導檢測器也被用于樣品在線檢測反相層析后收集得到的目標組分溶解在含有機溶劑的洗脫液中，往往在酸性pH條件，當分離物質是多肽和蛋白質時很容易引起其變性，可將層析后樣品直接收集在具有合適pH的緩沖液中，一方面將pH值調節至目標分子穩定的范圍，另一方面降低了有機溶劑的濃度，收集完畢再通過凍干等方法除去溶劑5.6層析柱的再生、清洗和貯存再生常用2～5CV的流動相B流經層析柱移去殘留在層析柱上的物質，然后采用連續線性下降的梯度從流動相B過渡至流動相A，再用5CV的流動相A充分平衡層析柱清洗常運行線性梯度從0.1%TFA到0.1%TFA異丙醇，再幾個CV的0.1%TFA異丙醇溶液，最后運行線性梯度從0.1%TFA異丙醇溶液重新回到0.1%TFA水溶液基于硅膠的介質常保存在純的甲醇中，基于聚苯乙烯的介質常保存在甲醇或20%乙醇中6應用6.1用RPC脫鹽屬吸附技術，容許待脫鹽樣品的體積很大，清洗后的樣品在很小的體積范圍內被洗脫，完成脫鹽的同時實現樣品的濃縮反相層析脫鹽后，蒸發除去流動相，所得樣品重新溶解在所需緩沖體系中后可以進行下一步操作6.2分析型分離純化RPC最為典型的應用是作為高Rs的純化技術，從復雜混合物中分離特定產物，如：從蛋白酶水解產物分離特定的肽，從寡核苷酸混合物分離特定的核苷酸這類應用一般選用3~15μm粒徑的高效介質，并優化流動相組成、梯度斜率、柱溫等各個純化細節核糖體蛋白質的分離純化原核生物核糖體的大亞基為50S，小亞基為30S，每個亞基都由核糖體RNA和數十種蛋白質組成使用反相層析從E.coli的50S核糖體純化核糖體蛋白質，得到13種純度很高的50S核糖體蛋白和23S核糖體RNA，純度達到氨基酸測序所需的要求，此外還收集到若干種部分純化的50S核糖體蛋白質層析柱為UltraporeRPSC，介質的粒徑為5μm，孔徑30nm，配基為十八烷基，層析柱尺寸為4.6×75mm，柱溫為35℃，流速0.5ml/min。流動相A為0.1%TFA水溶液，流動相B為0