斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。器材準(zhǔn)備膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第1頁染色瓶6組，染色架8個。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第2頁醫(yī)學(xué)微生物學(xué)試驗

綜合性試驗一膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌檢測（四）斜面培養(yǎng)物觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡使用膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第3頁斜面培養(yǎng)物觀察從普通平板上挑取黃色或白色菌落接種斜面，菌苔顏色，還是原來菌落顏色，黃色或白色。從伊紅美藍平板上挑取紫黑色或粉紅色菌落接種斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后試驗，依然沿用首次分離得到菌落顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時，普通只取半個小菌落大小菌量；接種環(huán)或接種針在培養(yǎng)基表面輕刮一下即可。

膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第4頁細菌染色法單染色法：只用一個染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能判別細菌。復(fù)染色法（判別染色）：采取兩種以上不一樣染料進行先后染色，可將細菌染成不一樣顏色，方便判別細菌。抗酸染色:用于檢驗結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等抗酸性細菌，陽性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉桿菌異染顆粒染色）。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第5頁結(jié)核分枝桿菌抗酸染色麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜Hiss染色破傷風(fēng)梭菌芽胞芽胞染色變形桿菌鞭毛Leifson染色

白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第6頁革蘭染色法GramStaining革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生ChristainGram于1884年創(chuàng)建一個細菌染色方法，已經(jīng)有120多年歷史，仍在廣泛使用，是細菌學(xué)中最為經(jīng)典染色法。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第7頁革蘭染色法原理三種學(xué)說通透性學(xué)說：G+菌細胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細胞外滲。G-菌細胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物輕易被酒精脫出。等電學(xué)說：G+菌等電點(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，普通染色時染液酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶負電荷比陰性菌多，所以與帶正電荷結(jié)晶紫染料結(jié)合牢靠，不易脫色。化學(xué)學(xué)說：G+菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成份，普通認為是核糖核酸鎂鹽與多糖復(fù)合物，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色細菌不易脫色。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第8頁革蘭染色意義判別細菌：把細菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥品：G+球菌對青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細菌致病機理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色步驟涂片→干燥→固定→染色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第9頁接種環(huán)取生理鹽水3～4ul，2滴。菌苔少許（1mm小菌落半量）與鹽水混勻，涂成＞1cm2。涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂→接種環(huán)燒灼滅菌。涂片制備甲→黃色，紫黑。乙→白色，粉紅。丙→黃色，紫黑。丁→白色，粉紅。↑細菌適當(dāng)

↑細菌較多膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第10頁涂片干燥固定Fixation手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個涂膜快速經(jīng)過火焰外層3次，時間2～3秒鐘。促使蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗時候，細菌被水洗掉。

膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第11頁革蘭染色方法步驟涂片→干燥→固定→↓結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗→↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→↓稀釋復(fù)紅→復(fù)染1分鐘→水洗→↓吸干,鏡檢。★取菌適量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當(dāng)。★影響革蘭染色關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第12頁革蘭陽性菌革蘭陰性菌膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第13頁G+鏈球菌G-雙球菌G+桿菌G+短桿菌G-弧菌G-螺菌膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第14頁液體培養(yǎng)基接種BrothTransfer—懸浮法SuspendingMethod甲→黃色,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉紅。標(biāo)識：組號，顏色37℃培養(yǎng)4小時4～5×108cfu/ml①接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面管壁上，上下研磨接種。②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第15頁生物安全警告此次試驗操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴散開,＜5um經(jīng)過呼吸道直接抵達肺泡。Pike博士對試驗室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)覺，不明原因感染高達82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴散引發(fā)。試驗時應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持平靜、有序，盡可能少說話、少走動，以免感染病原菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第16頁顯微鏡油鏡使用P1310×物鏡→看清楚標(biāo)本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中（幾乎與標(biāo)本接觸，工作距離0.13mm）→含糊物象→細調(diào)整調(diào)焦，觀察物像→統(tǒng)計結(jié)果→關(guān)閉電源。將聚光鏡調(diào)到最高處；孔徑光闌環(huán)上刻有物鏡倍率（10×，100×）必須轉(zhuǎn)到正面，與使用物鏡相對應(yīng)。油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。顯微鏡罩上防塵罩→橫放在試驗柜內(nèi)。★(順德校區(qū)）試驗臺兩側(cè)電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近電源插座。★（校本部）試驗臺中間，三個位插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側(cè)插座。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第17頁100倍浸油物鏡使用方法油鏡放入光路之前，一定要在標(biāo)本觀察部位上加一滴浸油。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進入光路，用微調(diào)旋鈕對好焦距。假如浸油內(nèi)有氣泡，會影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡往返經(jīng)過1～2次浸油，排除油內(nèi)氣泡。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第18頁溫馨提醒因染色場地受限，1～5組先涂片染色，后接種肉湯。6～10組先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完成，桌面收拾潔凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過載玻片無須擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第19頁革蘭染色法P15甲→黃色，紫黑乙→黃色，紫黑丙→白色，粉紅丁→白色，粉紅肉湯接種法P10

甲→黃色乙→白色丙→紫黑丁→粉紅油鏡使用P13

10×物鏡→看到標(biāo)本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中→含糊物象→細調(diào)整調(diào)焦，觀察物像→統(tǒng)計結(jié)果→關(guān)閉電源→擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。聚光鏡孔徑光闌環(huán)上物鏡倍率（10×或100×）必須轉(zhuǎn)到正面。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第20頁思索題革蘭染色法關(guān)鍵步驟是什么?為何?染色時為何通常要用新鮮細菌培養(yǎng)物?怎樣使用油鏡?膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第21頁膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第22頁試驗小結(jié)用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是經(jīng)典葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（電鏡）黃色、白色形態(tài)與染色（油鏡）酸葡萄黃色、白色菌落特征黃色白色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第23頁葡萄球菌三個種判別試驗金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶+--甘露醇發(fā)酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--注：敏感（SensitiveS）,耐藥（ResistantR）。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第24頁用伊紅美藍平板,從糞便標(biāo)本分離、取得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能判別是什么細菌。桿菌（電鏡）紫黑、粉紅細菌形態(tài)與染色（油鏡）紫黑紫黑、粉紅菌落特征粉紅膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測專題知識講座第25頁慣用器材擺放次序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第1列放置接