第四章補(bǔ)充沉淀分離與結(jié)晶第1頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二通過(guò)改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)的溶解度降低而以固體形式從溶液中分離出的一種操作技術(shù)。鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法結(jié)晶法2第2頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)鹽析法

(saltprecipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽3第3頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小4第4頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入一定濃度的無(wú)機(jī)鹽[(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質(zhì)仍可以溶解在水中，而不影響原來(lái)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此，鹽析是一個(gè)可逆的過(guò)程。利用這個(gè)性質(zhì)，可以采用多次鹽析的方法來(lái)分離、提純蛋白質(zhì)。第5頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。第6頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白中分離出來(lái)。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。鹽析法簡(jiǎn)單方便，可用于蛋白質(zhì)抗原的粗提、丙種球蛋白的提取、蛋白質(zhì)的濃縮等。鹽析法提純的抗原濃度不高，只用于抗原的初步純化。第7頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、基本原理8第8頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二原理1.形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。2.中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。9第9頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度關(guān)系logS=-Ks

S——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；—鹽離子強(qiáng)度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價(jià)；——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。10第10頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二、KS為縱坐標(biāo)上的截距，是外推截距，與無(wú)機(jī)鹽種類無(wú)關(guān)。KS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)，但與溫度和pH無(wú)關(guān)。兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作Ks鹽析法。（2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作β鹽析法。11第11頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）、無(wú)機(jī)鹽的種類鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―

NH4+＞K+＞Na+＞Li+

鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨12二、影響鹽析的因素第12頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響13第13頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（三）蛋白質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少。14第14頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（四）溫度的影響溫度的變化會(huì)影響值。在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。

15第15頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（五）pH的影響當(dāng)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)，值最小。利用值最低點(diǎn)時(shí)pH的不同，可以分級(jí)沉淀蛋白質(zhì).16第16頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(六)鹽的飽和度不同蛋白質(zhì)的鹽析要求的鹽的飽和度不一樣；分段鹽析法。第17頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、鹽析基本操作

1.中性鹽的選擇；2.pH的選擇；3.溫度與時(shí)間的控制；4.飽和度。18第18頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）鹽析方法和注意事項(xiàng)

1、分步鹽析法2、重復(fù)鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。19第19頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二分部鹽析法20第20頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二反抽提法(RNA聚合酶)21第21頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二注意事項(xiàng)“局部過(guò)濃”

：少量多次加入；

溫度（室溫）加入方法：1.固體法：攪拌下，少量多次加入；2.飽和溶液法:在蛋白質(zhì)溶液中加入預(yù)先調(diào)好pH的（NH4)2SO4溶液；3.透析法:將盛蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的（NH4)2SO4溶液中，通過(guò)透析作用改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度。使用于小體積樣品。

22第22頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。23第23頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。24一、基本原理第24頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一些溶劑的介電常數(shù)

25第25頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：乙醇等有機(jī)溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，可通過(guò)離心收集。缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆。26第26頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、影響沉淀效果的因素（一）有機(jī)溶劑種類及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。

（二）pH的影響許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液pH應(yīng)在等電點(diǎn)附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

27第27頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（三）溫度（低溫沉淀）有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無(wú)機(jī)鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。

高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。

28第28頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

多價(jià)陽(yáng)離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度降低。

胰島素精制：

29（五）某些金屬離子的助沉淀作用第29頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（六）樣品濃度

濃度小時(shí)，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時(shí)，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質(zhì)濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。30第30頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)其它沉淀方法

一、等電點(diǎn)沉淀法對(duì)于兩性物質(zhì)，等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來(lái)，發(fā)生沉淀。

31第31頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二胰島素純化：胰島素

pH8

除去堿性雜蛋白

pH3

除去酸性雜蛋白32第32頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時(shí)的許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過(guò)濾。第33頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團(tuán)作用的金屬?gòu)?fù)合鹽法；有機(jī)酸沉淀:與生物分子的堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)酸復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、單寧酸鹽等）。34二、成鹽沉淀法第34頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；

2．生成有機(jī)酸類復(fù)合鹽沉淀（1）單寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）35第35頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

雷凡諾

36第36頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二豬心提取液洗脫液上清液上清細(xì)胞色素C

沉淀（去除）37吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析第37頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、親和沉淀

利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來(lái)。

中性可溶，酸性沉淀。38第38頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

39第39頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。五、表面活性劑沉淀十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）40}酸性多糖第40頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二41第41頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二六、選擇性變性沉淀法熱變性沉淀法酸堿變性沉淀法利用試劑（氯仿）42第42頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)結(jié)晶(crystallization)

定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。

通過(guò)結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會(huì)留在母液中，經(jīng)過(guò)濾、洗滌可得到純度高的晶體。

43第43頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二結(jié)晶的方法一般有2種：一種是蒸發(fā)溶劑法，它適用于溫度對(duì)溶解度影響不大的物質(zhì)。沿海地區(qū)“曬鹽”就是利用的這種方法。另一種是冷卻熱飽和溶液法。此法適用于溫度升高，溶解度也增加的物質(zhì)。如北方地區(qū)的鹽湖，夏天溫度高，湖面上無(wú)晶體出現(xiàn)；每到冬季，氣溫降低，石堿(Na2CO3·10H2O)、芒硝(Na2SO4·10H2O)等物質(zhì)就從鹽湖里析出來(lái)。在實(shí)驗(yàn)室里為獲得較大的完整晶體，常使用緩慢降低溫度，減慢結(jié)晶速率的方法。第44頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二晶體在一定條件下所形成的特定晶形，稱為晶習(xí)。向溶液添加或自溶液中除去某種物質(zhì)(稱為晶習(xí)改變劑)可以改變晶習(xí)，使所得晶體具有另一種形狀。這對(duì)工業(yè)結(jié)晶有一定的意義。晶習(xí)改變劑通常是一些表面活性物質(zhì)以及金屬或非金屬離子。第45頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、結(jié)晶過(guò)程指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出形成新相的過(guò)程。C2

—

小晶體的溶解度；C1

—

普通晶體的溶解度；ρ

—

晶體密度；M

—

晶體質(zhì)量；σ—

晶體與溶液間的界面張力；

γ2

—

小晶體的半徑；

γ1

—

普通晶體的半徑；46第46頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二結(jié)晶包括三個(gè)過(guò)程：(1)形成過(guò)飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長(zhǎng)。47第47頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二晶核生成（成核）和晶體生長(zhǎng)兩個(gè)階段，兩個(gè)階段的推動(dòng)力都是溶液的過(guò)飽和度（溶液中溶質(zhì)的濃度超過(guò)其飽和溶解度之值）。晶核的生成有三種形式：即初級(jí)均相成核、初級(jí)非均相成核及二次成核。在高過(guò)飽和度下，溶液自發(fā)地生成晶核的過(guò)程，稱為初級(jí)均相成核；溶液在外來(lái)物（如大氣中的微塵）的誘導(dǎo)下生成晶核的過(guò)程，稱為初級(jí)非均相成核；而在含有溶質(zhì)晶體的溶液中的成核過(guò)程，稱為二次成核。二次成核也屬于非均相成核過(guò)程，它是在晶體之間或晶體與其他固體（器壁、攪拌器等）碰撞時(shí)所產(chǎn)生的微小晶粒的誘導(dǎo)下發(fā)生的。第48頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二濃度溫度圖49第49頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、過(guò)飽和溶液的形成(結(jié)晶方法)（一）、蒸發(fā)法、冷卻法（二）、溫度誘導(dǎo)法（三）、鹽析結(jié)晶法（四）、透析結(jié)晶法（五）、有機(jī)溶劑結(jié)晶法50第50頁(yè)，共60頁(yè)，