第六講轉錄修改第1頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二6.1.基本概念6.2.原核生物RNA轉錄的起始6.3.真核生物RNA轉錄的起始6.4.轉錄的延伸6.5.轉錄的終止6.6.原核生物轉錄產物的后加工6.7.真核生物轉錄產物的后加工6.8.真核生物轉錄產物中內元的去除第2頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第一節基本概念

第3頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

轉錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴于DNA的

RNA聚合酶催化下，以4中rNTP（ATP、

CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA

的過程。在有些病毒中，RNA也可以指導合成RNA。

若干基本概念

是基因表達的第一步，也是最關鍵的一步。

以DoubleStrandDNA中的一條單鏈作為轉錄模板

(雜交實驗所證實)第4頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

有義鏈(sensestrand)[又稱編碼鏈codingstrand]:

指不作模板的DNA單鏈

反義鏈(antisensestrand)[又稱模板鏈templatesrand]:指作為模板進行RNA轉錄的鏈(60年代以前的表示方法與此相反)

沒有A＝UG＝C的規律第5頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

在依賴DNA的RNA聚合酶作用下進行轉錄

A＝U、C≡G合成RNA分子轉錄合成RNA鏈的方向為5’→3’，模板單鏈DNA的極性方向為3’→5’，而非模板單鏈的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’。（書寫）基因轉錄方式為不對稱轉錄(一條單鏈DNA為模板,RNA

聚合酶的結合)第6頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二RNA的轉錄包括promotion.elongation.terminaton

三過程從啟動子(promoter)到終止子(terminator)稱為轉錄單位(transcriptionunit)(轉錄起始點)

原核生物的轉錄單位多為polycistroninoperon,真核生物中的

轉錄單位多為monocistron,Nooperon

轉錄起點即轉錄原點記為＋1，其上游記為負值，下游記為正值upstreamstartpointdownstream－10＋1＋10第7頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第8頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第二節原核生物RNA轉錄的起始

(RNATranscriptionpromotioninprokaryots)第9頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二兩個相關概念:＊操縱元(operon):

是原核生物基因表達調控的一個完整單元，其中包括結構基因、調節基因、操作子和啟動子ipozyaNolacmRNAAbsenceoflactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresenceoflactose

Inactive第10頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第11頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

啟動子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結合形成起始轉錄復合物的區域，它還包括一些調節蛋白因子的結合位點(頻率、效率)一、原核生物的RNApolymerase(E.coli)1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ’ααCoreEnzyme

βααβ’σHoloEnzyme第12頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

(1)全酶（HoloEnzyme）

?用于轉錄的起始

?依靠空間結構與DNA模板結合(σ與核心酶結合后引起的構象變化)

?專一性地與DNA序列(啟動子)結合

?結合常數：1014／mol

?半衰期：數小時（107／mol1秒以下）

?轉錄效率低，速度緩慢（σ的結合

）第13頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（2）核心酶（CoreEnzyme）

?作用于轉錄的延伸過程（終止）

?依靠靜電引力與DNA模板結合（蛋白質中堿性基團與DNA的磷酸根之間）

?非專一性的結合（與DNA的序列無關）

?結合常數：1011／mol?半衰期：60秒第14頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

此外，新發現的一種ω亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點和功能

（1）σ

因子

?σ因子可重復使用

?修飾RNApol構型

?使HoloEnzyme識別啟動子的SextamaBox(－35區),

并通過σ與模板鏈結合2α

＋βα2ββ’＋σ

α

2β

＋β’α2ββ’σ（3）全酶的組裝過程第15頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

?不同的σ因子識別不同的啟動子

E.coli中有四種σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草桿菌中有11種σ因子

（σ因子的更替對轉錄起始的調控）（2）α因子?核心酶的組建因子

?促使RNApol與DNA模板鏈結合α＋α2α＋β

α2β＋β’

?前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈

?尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈第16頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（3）β因子?促進RNApol＋NTPRNAelongation?完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接

?Editing功能（排斥與模板鏈不互補的堿基）

?與Rho（ρ）因子競爭RNA3’－end第17頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

Esite（elongationsiteRifR）:對NTP非專一性地結合（催化作用和Editing功能）

（4）β’因子

?參與RNA非模板鏈（sensestrand）的結合（充當SSB）

?構成Holoenzyme后，β因子含有兩個位點

Isite（initiationsite.Rifs）:

該位點專一性地結合

ATP或者GTP（需要高濃度的ATP或GTP）第18頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功能位點

有義DNA鏈結合位點（

β’亞基提供）

DNA/RNA雜交鏈結合位點（β亞基提供）雙鏈DNA解鏈位點（前端α亞基提供）單鏈DNA重旋位點（后端α亞基提供）

σ因子作用位點第19頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD第20頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

二、啟動子（promoter）的結構與功能（Prok.E.coli）

1、啟動子由兩個部分組成

（1）上游部分—CAP-cAMP結合位點

（基因表達調控的正控制位點）

CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，環腺苷酸（cAMP）的受體蛋白

（2）下游部分—RNApol的進入（結合）位點

－35~－10

包括識別位點和結合位點（RB位點）第21頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、RNA聚合酶的進入位點（1）Pribonow框（PribonowBox）

§-10序列，RNA聚合酶的牢固結合位點

結合位點（B位點）

§一致序列：T80A95T45A60A50T96

（TATPUAT）

§位置范圍－4到－13因此又稱TATABox保守T第22頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（2）Sextama框（SextamaBox）

§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結合位點，

§RNA聚合酶依靠其σ亞基識別該位點

—識別位點（R位點）

§大多數啟動子中共有序列為T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上決定了啟動子的強度

（RNApol的σ因子）

§

位置在不同啟動子中略有變動第23頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第24頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（3）起始位點（initiationsite）：＋1位點

RNA聚合酶的轉錄起始位點

起始NTP多為ATP或GTP

第25頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二起始過程：

a.全酶與啟動子結合的封閉型啟動子復合物的形成（

R位點被σ因子發現并結合）第26頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

b、開放型啟動子復合物的形成

§RNApol的一個適合位點到達－10序列區域，誘導富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡狀物，同時酶分子向－10序列轉移并與之牢固結合

§開放型啟動子復合物使RNApol聚合酶定向

§兩種復合物均為二元復合物（全酶和DNA

）第27頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二12～17bp第28頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

c.在開放型的啟動子復合物中，RNApol的I位點和E位點的核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（

β

亞基）三元復合物形成

+1位多為CAT模式,位于離開保守T6~9個核苷酸處---6-9bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence（4）σ因子解離→核心酶與DNA的親和力下降起始過程結束→核心酶移動進入延伸過程第29頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二轉錄的起始過程σ核心酶12～17bp第30頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（β亞基）第31頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、CAP-cAMP結合位點（也稱CAP位點）

轉錄調控中，I→阻遏蛋白→負調控

lac

操縱子模型第32頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二I第33頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

許多基因的表達還存在正調控機制

例如:E.coli培養基中乳糖和葡萄糖共存時→只有葡萄糖被利用原因：CAP位點的正調控

?葡萄糖缺少時，腺苷酸環化酶將ATP→cAMP，

cAMP與CAP位點結合,此時啟動子的進入位點才能與RNApol結合

?葡萄糖存在時，cAMP不能形成，沒有CAP－cAMP

與CAP位點結合，啟動子的RNApol進入位點不能結合RNApol

第34頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

因此,一個操縱元中有兩道控制開關,只有同時打開,結構基因才能進行轉錄。（對lac操縱元而言，只有沒有葡萄糖，有乳糖時才能進行錄）（1）CAP位點的組成（－70～－40）

位點Ⅰ：－70～－50

包括一個IR序列

強結合位點

位點Ⅱ：－50～－40

弱結合位點位點Ⅰ對位點Ⅱ具有協同效應（cooperativity）第35頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第36頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（2）位點Ⅱ結合CAP－cAMP復合物后，促使RNApol進入

SextamaBox,最終與－10序列結合起始轉錄

原因：CAP－cAMP復合物與位點Ⅱ結合→SextamaBox富含G·C區域（G·C島區）穩定性降低→

PribnowBox的溶解溫度降低→促進開放型啟動子復合物的形成→促進轉錄第37頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二4、RNApol在DNA上結合位點的鑒定

DNase法----------40bp

而足跡法（footprinting）結果相對準確

足跡法原理：

?限制酶切割結合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標記該DNA（Klenow片段標記3’,堿性磷酸酯酶標記5’）

?用內切酶降解DNA（控制反應條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察第39頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二限制酶切分離大片段DNA第40頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二末端標記大分子DNA重新結合RNApol

作對照直接用DNase進行降解電泳用微量DNase降解電泳第41頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第42頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

?用足跡法鑒定出來的RNApol與DNA的結合區域為

+20~－50（－40），大約60~70bp

5、啟動子各位點與轉錄效率的關系

（1）－35序列與－10序列與轉錄效率的關系

標準啟動子－35TTGACA

－10TATAAT第43頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

則不同的啟動子

a.與標準啟動子序列同源性越高→啟動強度越大b.與標準啟動子同源性越低→啟動強度越小

c.與標準啟動子差異很大時→由另一種σ因子啟動原因:?－35序列通過被σ因子識別的容易→決定啟動子強度

?－10序列影響開放型啟動子復合物形成的速度→決定啟動子強度第44頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（2）－35序列與－10序列的間隔區與轉錄效率的關系◆堿基序列并不重要◆間距非常重要，17bp的間距轉錄效率最高◆間距上的突變種類：間距趨向于17bp→

上升突變間距遠離17bp→下降突變?啟動子上升突變、啟動子下降突變第45頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二E.Coli各σ識別的啟動子的序列第46頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第三節真核生物RNA轉錄的啟動RNATranscriptionpromotioninEukaryots第47頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

一、真核生物的RNApol

1、三種RNApol：

根據對

α-鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類

RNApolⅠ最不敏感（動、植、昆）

RNApolⅡ最敏感

RNApolⅢ不同種類的敏感性不同

2、位置和轉錄產物

RNApolⅠ核仁活性所占比例最大

轉錄rRNA（5.8S、18S、28S）第48頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二RNApolⅡ核質主要負責hnRNA、snRNA的轉錄

hnRNA（mRNA前體，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）

snRNA（核內小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核質負責tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA

?

目前在線粒體和葉綠體內發現少數RNApol（活性較低）第49頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、亞基組成：分子量500KDa,含兩個大亞基和7~12個小亞基

RNApolⅡ：

?大亞基中有C末端結構域

(carboxyterminaldomainCTD)?CTD中含一保守氨基酸序列的多個重復

Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC端重復七肽

?不同生物中重復數目不一樣（酶活性）第50頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二?CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化

磷酸化的RNApolⅡ被稱為ⅡA

非磷酸化的RNApolⅡ稱為ⅡB?CTD參與轉錄

→

ⅡB→ⅡA

→

使RNApol易于離開啟動子進入延伸過程（10倍）

二、真核生物的啟動子

三種RNApol→三種轉錄方式三種啟動子→三類基因，Ⅰ類Ⅱ類Ⅲ類第51頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

1、RNApolⅡ的啟動子

?結構最復雜

?位于轉錄起始點的上游,有多個短序列元件組成

?通用型啟動子（無組織特異性）（1）帽子位點（capsite）：轉錄起始位點

與Prok.的“CAT模式”相似

（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

?

位于－30處

?一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）第52頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二?定位轉錄起始點的功能（類似原核的Pribnow框）

?TATA是絕大多數真核基因的正確表達所必需的（3）CAAT框（CAATbox）

?位于－75bp處?一致序列為GGC/TCAATCT?前兩個G

的作用十分重要(轉錄效率)?增強啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性（距轉錄起始點的距離，正反方向）

第53頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（4）增強子（enhancer）（又稱遠上游序列farupstreamsequence）

?在－100以上

?SV40的兩個正向重復研究得最清楚（DR）

-107~178、－179~－250各72bp

第54頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二遠距離效應無方向性順式調節無物種和基因特異性具有組織特異性有相位性（構象）可對外部信號產生反應增強子的特點第55頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（5）GC框（GCbox）

?位于－90附近，較常見的成分

?核心序列為GGGCGG?可有多個拷貝，也可以正反兩方向排列第56頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（6）其他元件

?八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）一致序列為ATTTGCAT?KB元件一致序列為GGGACTTTCC?ATF元件一致序列為GTGACGT?還有一些位于起始點下游的相關元件（7）不同元件的組合情況不同元件的數目、位置、和排列方向均有差異

例如：SV40的早期啟動子中有6個GC框第57頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二小結：★不同啟動子中每種元件與轉錄起始點的距離不同★不同啟動子中的相應元件互相交換,形成的雜交啟動子功能沒有變化★各種元件將相應的蛋白因子結合到啟動子上，組成起始復合物，蛋白因子間的相互作用決定了轉錄的起始第58頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

2、RNApolⅢ啟動子結構

（1）分為三類，每種識別方式不同

a、下游啟動子（內部啟動子）位于轉錄起始點的下游

5SRNA和tRNA基因

b、上游啟動子

snRNA第59頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（2）內部啟動子的發現

最早發現于非洲爪蟾的5SrRNA基因

試驗設置：

★非洲爪蟾的卵母細胞提取液作為體外轉錄體系，進行缺失試驗★以不同長度的5SrRNA基因為模板進行轉錄

結果：

★缺失＋55以前和缺失＋80以后的序列都能正常轉錄★缺失＋55到＋80序列不能轉錄第60頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

結論：

★5SrRNA基因的啟動子位于基因內部★該啟動子可使RNApolⅢ在其上游的55bp處起始轉錄（3）內部啟動子分為兩類均含兩個短序列元件，中間由其他序列隔開

第一類：含A框和C框（5SrRNA基因）第二類：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）間隔序列長短差異很大

?其中內部啟動子起被RNApolⅢ識別的作用第61頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第62頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第63頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

三、真核生物轉錄的起始?三種RNApol均沒有對啟動子特異序列的識別能力?轉錄起始過程需要很多的輔助因子(轉錄因子)參與,

并且按一定順序與DNA形成復合物,協助RNApol定位于轉錄起始點第64頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二RNApolⅠTBP因子第65頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二RNApolⅡ第66頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第67頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

★RNApolⅢ的轉錄起始◎兩種內部啟動子的轉錄起始需要三種輔助因子

TFⅢA一種含鋅指結構的蛋白

TFⅢB由TBP和BRT、B”TFⅢC至少5個亞基以上第68頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第69頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

?TBP的作用★所有RNApolⅢ的轉錄起始都需要TBP★在RNApolⅠ的轉錄起始過程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApolⅠ的作用

★

RNApolⅡ的轉錄起始由TBP識別TATA框

?TBP起定位作用,所以又稱定位因子（positioningfactor）第70頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第71頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第四節轉錄延伸TranscriptionElongation第72頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

一、起始到延伸的轉變

★始于第一個磷酸二酯鍵的形成★伴隨著DNA分子和酶分子構象的變化

1、Prok.

?起始時，

σ因子有利于β

和β’亞基具有與DNA專一性結合所要求的構象

?起始后,σ因子解離,β

和β’亞基構象發生變化

2、Euk.

?多種輔助因子的共同作用來保證這一轉變第73頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

二、延伸過程（Prok）

★酶與產物RNA不解離

★底物NTP不斷加到RNA鏈的3’-OH端★形成一個磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動★延伸位點不斷地接受新的NTP，RNA鏈不斷延伸

?始終保持三元復合物的結構第74頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第75頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

1、轉錄泡★RNApol結合和轉錄的DNA模板區域，有17bp左右

DNA形成解鏈區★轉錄泡處雜交雙鏈很短

?胰臟RNAase______其長度10bp（不準確）

?推測也就兩個核苷酸左右第76頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、拓撲學問題

Φ

RNA合成過程中，轉錄泡兩端要發生拓撲轉變

?RNApol的前沿…..解螺旋作用

?RNApol后端…..DNA的螺旋化（保持…………）

Φ

超纏問題的解決靠DNA旋轉酶

Φ

RNA-DNA雜交鏈也要求作旋轉運動第77頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二旋轉酶第78頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

第五節轉錄的終止Transcriptiontermination

第79頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二☆終止過程：酶停止添加底物→→釋放RNA鏈→→酶解離終止反應…雜合雙鏈的氫鍵斷裂，

…重新形成雙螺旋，酶的解離。☆終止子（terminator）：在轉錄的過程中，提供轉錄終止信號的DNA序列真正起終止作用的是RNA序列－－－與啟動子不同☆Prok.和Euk.都具有－－－－一種基因表達調控的手段第80頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

一、原核生物的終止子

1、終止子的種類（1）內在終止子（不依賴

ρ因子的終止子）體外實驗中，只有核心酶和終止子就足以使轉錄終止（2）依賴ρ因子的終止子蛋白質輔助因子－－ρ因子存在時，核心酶終止轉錄

兩者有共同的結構特征（序列差異）第81頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、不依賴

ρ因子的終止子結構特征:?一是形成一個發夾結構莖….7~20bp的IR序列形成（富含G/C）環….中間不重復序列形成發夾結構的突變可阻止轉錄的終止?二是6~8個連續的U串（發夾結構末端）第82頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二不依賴ρ終止子結構IRIR莖部富含GC第83頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、依賴ρ因子的終止子（1）結構

IR序列中的G／C對含量較少發夾結構末端沒有固定特征（2）靠與ρ的共同作用而實現終止

第84頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二無連續U串G/C含量較少第85頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

二、原核生物轉錄的終止

1、不依賴ρ因子的終止子終止轉錄（1）新生RNA鏈發夾結構形成

與RNApol發生作用

造成高度延宕（典型的有60秒左右）

（2）RNApol暫停為終止提供了機會，6~8個連續的U

串可能為RNApol與模板的解離提供了信號

RNA－DNA之間的rU－dA結合力較弱

阻止RNA鏈的釋放第86頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

于是：RNA－DNA解離三元復合體解體

RNApol解離轉錄終止（3）真正的終止點不固定，在U串中的任何一處（4）IR序列和U串同等重要

IR中的G／C對含量的減少

U串的縮短或缺失（5）DNA上與U串對應的為富含A／T的區域說明：AT富含區在轉錄的終止和起始中均起重要的作用第87頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

2、依賴ρ因子的終止子終止轉錄（1）通讀（readthrough）：在依賴ρ

因子的轉錄終止過程中，RNApol轉錄了IR序列之后，雖發生一定時間的延宕，但如果沒有ρ

因子存在，則

RNApol會繼續轉錄（2）ρ因子活性形式為六聚體促進轉錄終止的活性，NTPase活性第88頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

ρ因子識別和結合的是RNA（3）ρ因子對終止子的作用

a、ρ因子與RNA結合（終止子上游的某一處，RNA的5’端）b、ρ因子沿RNA從5’→3’移動（NTP水解供能）（終止子處的較長時間的延宕給ρ因子追趕的機會）c、ρ因子與RNApol相互作用而造成轉錄的終止第89頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二ρ結合上來追趕RNApolρ追趕上來（暫停）

ρ與RNApol相互作用使雜交鏈解鏈終止子第90頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

（4）終止反應還需要RNA與DNA的相互作用即：需要一定的RNA序列因為：其與模板的結合力必須弱到一定數值，才能配合

ρ因子與RNApol的作用（發夾結構下游的AU序列）序列不同的終止子→→不同的終止程度→→基因表達調控的途徑之一第91頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二三、終止與抗終止及抗終止因子?各種生物采用不同的手段控制不同發育階段的基因表達

*

枯草桿菌------更替σ因子*T7噬菌體------更換RNApol*λ噬菌體采用依賴于ρ因子的終止以及通過抗終止因子的抗終止作用第92頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二?抗終止的機制依賴于噬菌體本身的依賴ρ因子的終止子依賴ρ因子的終止子上游有抗終止信號(靠近PL的nutL，靠近tR1的nutRnut—PNutilization)抗終止蛋白和nut位點的結合，等待RNApol經過時修飾RNApol的構象，拮抗寄主編碼的終止蛋白ρ的活性,使之通過那些依賴ρ的終止子第93頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第94頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第六節原核生物轉錄產物的后加工Pre-RNAprocessinginProkaryotes第95頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

Φ

Prok.的mRNA半衰期只有幾分鐘

（基因表達調控的一種手段）

Φ

rRNA、tRNA比較穩定半衰期幾小時

成熟分子和轉錄產物的差別：

?5’單磷酸／三磷酸

?

分子大小

?

異常堿基第96頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

一、rRNA后加工

1、基因排列方式

★三種rRNA基因（5S、16S、23S）與tRNA

的基因形成操縱元（rrn）（E.coli七個）

★每個rrn中tRNA基因無固定模式（種類、數量、位置）第97頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二★三個rRNA基因的相對位置有一定規律

…16SrDNA……間隔tDNA…….23SrDNA…….5SrDNA……收尾tDNA…加工過程主要是RNAseⅢ等酶的作用第98頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二雙鏈區域第99頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

二、tRNA的轉錄后加工

1、tRNA基因

轉錄單元大多是多基因的同一個tRNA基因、不同tRNA基因、與rRNA基因第100頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、E.coli的tRNATyr1分子的修飾過程編碼基因的原始轉錄物三磷酸

有兩個基因拷貝間隔子（各長350base）第101頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二有一個tRNATyr1的轉錄單元的原始轉錄物的修飾過程①②③④⑤⑤⑤⑤第102頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二三、RNA中的甲基化及常見的修飾核苷酸m5C

m6A

HNHHNHOO

HNH

HN—CH3H3C★Prok.中主要是堿基的修飾

Euk.－－核糖、堿基第103頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第七節Euk轉錄產物的后加工

Pre-RNAprocessinginEukaryotes

第104頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二一、rRNA的轉錄后加工主體rRNA基因（5.8S、18S、28SrDNA）組成一個轉錄單元47S前體45S前體

a、甲基化位點可能是酶識別的標志

b、加工的對象是一種核蛋白

c、哺乳動物的45SRNA前體有幾種不同的加工方式第105頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第106頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二二、mRNA的轉錄后修飾－--------帽子

1、帽子的種類帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp----------（共有）

m7GN7—甲基鳥苷帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp----------

第一個核苷酸的2’-O位上產生甲基化（AN6位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp

第二個核苷酸的2’-O位上產生甲基化（A、G、C、U）第107頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二HN—CH3m7G帽子0第108頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第109頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二其中:

☆單細胞真核生物只有Cap—0☆Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式☆Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子結構的生成

☆甲基供體都為S—腺苷甲硫氨酸（SAM）

☆RNA鳥苷酸轉移酶-----戴帽酶（cappingenzyme）第110頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、帽子結構的功能

（1）對翻譯起識別作用------為核糖體識別RNA提供信號

Cap—0的全部都是識別的重要信號

Cap—1,2的甲基化能增進識別

（2）增加mRNA的穩定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻擊

（3）與某些RNA病毒的正鏈合成有關（Cap—1、Cap—2）

除帽子結構外的Euk.mRNA內部甲基化－－－m6A形式第111頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二三、mRNA的轉錄后修飾二--------多聚（A）尾巴1、3’端-----約長200bp(大多數Euk.的mRNA)

（poly(A)+poly(A)-

）

最近研究發現，原核生物的RNA轉錄后也有3’添加

poly(A)的現象

E.coli的poly(A)+聚合酶早在1962年就已發現2、

poly(A)的生成a.RNA末端腺苷酸轉移酶（poly(A)聚合酶）催化前體－－ATP第112頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二反應如下：多聚核糖核酸+nATPMg++或Mn++

多聚核糖核酸(A)n+nPPib、添加位點內切酶(360KDa)切除一段序列

由poly(A)聚合酶催化添加poly(A)內切酶的識別位點（有其它因子參與）

切點上游13－20bp處的AAUAAA

第113頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、poly(A)的功能c、對含poly(A)的mRNA失去poly(A)可減弱其翻譯

（1）可能與核質轉運有關

（2）與mRNA的壽命有關

（3）與翻譯有關

a、缺失可抑制體外翻譯的起始

b、胚胎發育中，poly(A)對其mRNA的翻譯有影響（非poly(A)化的為儲藏形式）第114頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（4）poly(A)在分子生物學實驗中有很大應用價值a、也可將oligo(dT)與載體相連，從總體RNA中分離純化mRNAb、用寡聚dT（oligo(dT)）為引物，反轉錄合成cDNA第115頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二真核與原核生物mRNA的特征比較原核生物mRNA的特征1、原核生物mRNA半衰期短2、原核生物mRNA大多以多順反子存在3、原核生物mRNA無帽子結構，無或有較短polyA結構真核生物mRNA的特征1、有帽子結構2、絕大多數真核生物mRNA具有polyA尾巴第116頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

第八節Euk.轉錄產物中內元的去除IntronremovinginEukaryote第117頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二一、概述

1、概念

割裂基因（splitgene）：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現在成熟的RNA序列中，成熟RNA

的序列在基因中被其他的序列隔開

內元（intron）：原初轉錄物中通過RNA拼接反應而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應的

DNA序列

外元（excon）：第118頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二第119頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二RNA拼接（RNAsplicing）：一個基因的外元和內元共同轉錄在一條轉錄產物中，將內元去除而把外元連接起來形成成熟RNA分子的過程

拼接點：

5’拼接點或左拼接點（內元上游）

3’拼接點或右拼接點（……下游）第120頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、內元的分類

1982Davies等人

中部核心結構（centralcorestructure）:在有些內元中，含有4個重復的保守序列，長度為

10~20bp，4個保守序列構成一種二級結構，在拼接中起重要作用

由于并非所有的內元都有中部核心結構，所以有了內元的分類第121頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二★Ⅰ類內元（groupⅠ）:含有中部核心結構的細胞器基因核基因★Ⅱ類內元（groupⅡ）:不含有中部核心結構細胞器線粒體基因內核基因★Ⅲ類內元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列核基因mRNA前體

第122頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二3、拼接方式

方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內元）可供識別的特異序列

拼接裝置由多種蛋白質和核蛋白組成

方式二：自我拼接（兩類內元Ⅰ

、Ⅱ

）

形成特定的二級結構

RNA具有催化拼接的能力

第123頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

二、第Ⅰ類內元的拼接

特點：

?拼接屬于自我拼接

?形成明顯的二級結構

1、結構特點：（1）5’

拼接點和3’

拼接點-------U↓……G↓

↓↓

5’……exon……U……intron……G……exon……3’

第124頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（2）有由保守序列形成的二級結構

a、保守序列為

5’－P－Q－R－S－3’

距拼接點很遠，各10~12bpP與Q互補、R與S互補而形成中部核心結構第125頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二b、二級結構中還包括內元與外元的某一序列互補所形成的二級結構

內部引導序列（interalguidesequenceIGS）：內元中能與兩個拼接點邊界序列配對的一段序列

#第一類內元的拼接依賴于以上二級結構－－為自我拼接的進行提供活性位點第126頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二2、拼接機制（以四膜蟲的大rRNA前體的拼接為例）（1）兩種rRNA轉錄在一條35S的產物中，26SrRNA

有內元5’UG3’

小rRNA大rRNA（26S有內元）

（2）35SRNA體外有自我拼接的能力反應需要：一價和二價離子鳥苷酸輔助因子（GTPGDPGMP和鳥嘌呤核苷）不需能量的供給

（3）拼接反應后，G與內元（414base）5’端以磷酸二酯鍵相連（放射性標記試驗）第127頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二（4）具體的拼接過程第一步：游離G發動的轉酯反應

G的3’-OH攻擊內元的5’拼接點

G-內元、左外元（有游離3’OH）

第128頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

第二步：游離外元（左）發動的轉酯反應左外元的3’-OH攻擊3’拼接點，同時釋放線狀的內元,形成成熟RNA分子第129頁，共146頁，2023年，2月20日，星期二

?

兩次轉酯反應是緊密偶聯的?釋放出的內元可繼續進行轉酯反應而形成環狀