一、概述高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑1~5cm,長50~500cm的玻璃柱中進行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150~200m范圍內。即使這樣，流速仍然很低(<1mL/min)，分析時間仍然很長！當加壓增加流速(真空或空氣泵)時，盡管分析時間減少，但柱塔板高度Hmin也相應增加了！或者說柱效下降了。為了解決分析時間及柱效問題，人們認識到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10m

）！

直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設備、高效固定相以及高靈敏檢測器的出現及發展，才徹底解決了分析時間及柱效的問題。即所謂的高效液相色譜技術才真正得到廣泛應用。高效液相色譜HPLC基本原理1）高效液相色譜與經典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大增加，分析速度極快，只需數分鐘；而經典方法靠重力加料，完成一次分析需時數小時。高效：填充物顆粒極細且規則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高。可以在數分鐘內完成數百種物質的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。2）HPLC與GC的比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩定化合物，而這些物質只點有機物總數的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩定或不穩定化合物，這類物質占有機物總數的80%。流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。高效液相色譜HPLC基本原理極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量3）應用由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準確性、適于非揮發性和熱不穩定組分的分析，因此，在工業、科學研究，尤其是在生物學和醫學等方面應用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過HPLC來完成的。右圖是各種HPLC方法的應用范圍及對象高效液相色譜HPLC基本原理二、HPLC儀器

HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;

進樣系統;

分離系統;

檢測系統;

此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數據處理裝置。其工作過程如圖所示。高效液相色譜HPLC基本原理He儲液瓶分布器過濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調節壓力計注樣閥分離柱到檢測器高效液相色譜HPLC基本原理1.高壓輸液系統1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進行泵內。高效液相色譜HPLC基本原理2）溶劑脫氣系統：為什么需要脫氣防止在檢測器中產生氣泡，引起噪音。除去氧氣的影響。超聲波脫氣真空加熱脫氣

He氣鼓泡脫氣在線脫氣機脫氣

溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理在線真空脫氣和He脫氣對保留時間在現性的影響高效液相色譜HPLC基本原理3）泵：

對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩定無脈動、可調范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。恒壓泵(類似于風箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復推動時，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現已較少使用。恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關，使用較多。有機械注射式和機械往復式兩種。應用最多的是機械往復式恒流泵(見下圖。每分鐘往復25~100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接一脈動阻尼器)。高效液相色譜HPLC基本原理串聯泵單元泵原理高效液相色譜HPLC基本原理單元泵工作原理AuthoringDivisionNameSecurityNotice(ifrequired)Damper阻尼器Seal密封墊Piston活塞桿BallScrewDriveGearOutletBallValve出口單向閥ActiveInletValve入口單向閥Purgevalve沖洗閥高效液相色譜HPLC基本原理溶劑傳輸系統工作原理往復活塞泵(單向閥)（密封金墊）GoldSealSapphireInsertRubyBallSpringInsert入口出口自溶劑瓶至液相系統高效液相色譜HPLC基本原理4）梯度洗脫裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一個泵，可采用低壓混合設計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調節各自的流量，在高壓下混合。高效液相色譜HPLC基本原理低壓梯度高效液相色譜HPLC基本原理高壓梯度高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理2.進樣系統進樣裝置包括兩種：1）手動進樣器：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復性好，如圖。裝入樣品出口進樣采樣環泵入溶劑進色譜柱高效液相色譜HPLC基本原理ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWaste手動進樣器－六通閥高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理2）自動進樣器高效液相色譜HPLC基本原理工作原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理3.色譜柱1）對色譜柱的要求：內壁光滑的優質不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據使用勻漿試劑的性質不同可分為：平衡密度法：即使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：當采用粘度較大的試劑，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧雜環已烷、THF等。填充方法：填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結塊)、且無空氣進入(影響填充均勻性)。高效液相色譜HPLC基本原理0.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.高效液相色譜HPLC基本原理柱溫箱高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理4.檢測器液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發射、示差折光和安培檢測器等。1）紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是，此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。

HPLC分析中，約有80%的物質可以在254nm或280nm處產生紫外吸收。因此該類檢測器應用很廣。

在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液高效液相色譜HPLC基本原理LampOpticalmirrorsGratingDetectorcellSlitBeamsplitter高效液相色譜HPLC基本原理TungstenlampLensDeuteriumlampLenssystemHolmiumfilterDetectorcellOpticalslitGratingDiodeArray高效液相色譜HPLC基本原理TimeWavelengthmsecnmLIGHTSHIFTREGISTERSWITCHVIDEOLINEREADOUTCYCLEPHOTODIODECAPACITORTRANSISTOR高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理TakepeakspectrumComparewithlibraryMatch:998Chlortoluron?250300Wavelength(nm)250300Wavelength(nm)*LibrarySearchingmaybeperformedinanautomatedfashion.SpectralLibraries:Principle高效液相色譜HPLC基本原理2）熒光檢測器許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數量級。高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理3）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因為發生偏轉造成兩束光的強度差發生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理高效液相色譜HPLC基本原理4）安培檢測器由恒電位儀和一薄層反應池（體積為1~5L）組成。如圖。該檢測器是利用待測物流入反應池時在工作電極表面發生氧化或還原反應，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質，且呈化學隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質。接參比電極和對電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)高效液相色譜HPLC基本原理5