抗體技術研究及產業化第1頁/共88頁

第2頁/共88頁細胞表面抗原血型抗原組織相容性抗原白細胞分化抗原CD2CD3CD25CD10CD20CD38CD45CD71CD41CD42CD8...第3頁/共88頁腫瘤相關抗原胃癌肺癌肝癌鼻咽癌大腸癌宮頸癌乳腺癌結腸癌卵巢癌胰腺癌喉癌腦膠質瘤骨肉瘤第4頁/共88頁病毒HFRSV新城疫甲肝輪狀登革乙肝RSV乙腦流感馬雅羅Mayaro

基孔貢亞ChikungunyaRossRiver羅斯河

蓋塔Getah柯薩奇狂犬新培斯Sindbis第5頁/共88頁細菌大腸桿菌沙門氏菌痢疾桿菌軍團桿菌結核桿菌綠膿桿菌麻風桿菌霍亂弧菌第6頁/共88頁寄生蟲血吸蟲瘧原蟲弓形蟲旋毛蟲絲蟲毛滴蟲絳蟲利什曼原蟲第7頁/共88頁可溶性抗原酶血漿蛋白毒素細胞因子補體激素小分子化合物第8頁/共88頁

抗體技術的研究和抗體的研發，是生物技術發展的永恒主題抗體廣泛用于臨床疾病的診斷和研究目前在美國單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4第9頁/共88頁第10頁/共88頁第一章抗體類型和抗體技術發展第11頁/共88頁

第一代多克隆抗體第二代單克隆抗體第三代基因工程抗體第四代全人抗體？第12頁/共88頁鼠源單抗臨床應用的障礙●

血清半衰期短，20h●抗原抗體結合力、親和力不夠●募集效應細胞產生副作用●

HAMA反應：8－10天出現，20－30天高峰，anti-id封閉與抗原結合位點，抗鼠抗體加速單抗清除●過敏性休克第13頁/共88頁影響單抗與靶細胞或抗原結合引起變態反應和器官損害HAMA反應示意圖第14頁/共88頁第15頁/共88頁

第一代多克隆抗體第二代單克隆抗體第三代基因工程抗體第四代全人抗體？第16頁/共88頁小鼠抗體嵌合抗體重構抗體人源抗體鼠100%33%10%0人067%90%100%第17頁/共88頁

第一代多克隆抗體第二代單克隆抗體第三代基因工程抗體第四代全人抗體？第18頁/共88頁小鼠抗體嵌合抗體重構抗體人源抗體鼠100%33%10%0人067%90%100%第19頁/共88頁?人—鼠嵌合抗體?改型抗體（又稱人源化抗體）?小分子抗體?雙特異抗體?抗體融合蛋白基因工程抗體的類型第20頁/共88頁1、嵌合抗體

將人IgC區與鼠IgV區相連接，從而在同一抗體分子中含有不同屬來源的抗體。

第21頁/共88頁

構建嵌合抗體的基本原理，從雜交瘤細胞基因組中分離和鑒別出功能性可變區基因，與人Ig恒定區基因相連接，插入適當的載體中，構建成人—鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉染骨髓瘤細胞，使之表達嵌合抗體。第22頁/共88頁表1FDA批準上市的單克隆抗體藥物產品研究者適應癥目標抗原批準年份抗體類型ReoproCentocor心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗體RituxanIDEC非霍奇金氏淋巴癌CD201997嵌合抗體RemicadeCentocor類風濕關節炎TNF-α1999嵌合抗體SimulectNovartis腎臟移植CD251998嵌合抗體第23頁/共88頁2、改型抗體應用CDR移植技術，即將鼠單抗V區中互補決定區（CDR）序列取代人源抗體相應CDR序列，重構成既具有鼠源性單抗特異性，又保持人抗體親和力的CDR移植抗體（CDR-graftedAb），也稱為改型抗體或人源化抗體。第24頁/共88頁表1FDA批準上市的單克隆抗體藥物產品研究者適應癥目標抗原批準年份抗體類型SynagisMedimmune呼吸道感染Fprotein1998人源化抗體ZenapaxPDL腎臟移植CD251997人源化抗體HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗體MylotargCelltech白血病CD332000人源化抗體CampathMillennium淋巴瘤CD522001人源化抗體XolairGenentech中度至嚴重的因敏感引起的哮喘IgE2003人源化抗體HerceptinGenentech乳腺癌HER22006人源化抗體第25頁/共88頁

3、小分子抗體

利用細菌表達決定抗體特異性的結構域，所獲抗體片段大小僅為IgG分子的1/3-1/12，因此稱之為小分子抗體。第26頁/共88頁小分子抗體包括：

Fab1/3Fv1/6ScFv1/6

單域抗體1/12MRU

第27頁/共88頁Fab片段

Fab片段由重鏈VH加CH1及完整的輕鏈構成，在細菌的啟動子控制下，在大腸桿菌中表達而合成Fab，大小為完整抗體的1/3，其結構與木瓜蛋白酶消化完整抗體后所產生的Fab片段一致。用DNA重組技術制備的嵌合Fab片段，其V區為鼠源性，而CH1、Cκ為人源性的。第28頁/共88頁FV片段

FV片段由VH和VL組成，是抗體的抗原結合部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共價結合的FV片段，在不改變其分子大小的情況下，可避免VH或VL的解離。

第29頁/共88頁第30頁/共88頁單域抗體和最小識別單位

單域抗體是指VH或VL，其分子大小僅為完整抗體的1/12。由單個CDR構成的小分子抗體稱為最小識別單位（MRU）。第31頁/共88頁

單鏈抗體單鏈抗體分子是由一條單一肽鏈按VH-Linker-VL

或VL-Linker-VH

的順序組成。分子大小是完整抗體分子的1/6，ScFv是抗體與抗原結合的最小單位。第32頁/共88頁ScFv具有以下特點：●具有與原親本抗體相同的特異性和親和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗體不易到達靶細胞、清除慢和易引起超敏反應及組織損傷等缺點；●制備流程較其他基因工程抗體簡單，可由大腸桿菌發酵產生；第33頁/共88頁

●

無Fc段，所以減少了與非靶細胞上Fc受體結合，使其更特異性集中于靶細胞部位，有利于作為載體用于藥物的導向治療；

●易進行分子改造，ScFv基因片段還可以與適當的酶基因或毒素蛋白基因重組，轉入適當的表達系統，可產生出酶聯抗體或具有與抗原結合特異性和細胞毒性的重組免疫毒素。

第34頁/共88頁4.雙特異抗體(bispecificantibody,BsAb)

一個抗體分子中的兩個抗原結合部位可分別結合兩種不同的抗原決定簇。第35頁/共88頁制備：化學偶聯技術基因工程技術二次雜交瘤技術第36頁/共88頁在導向治療中的應用藥物導向

腫瘤細胞抗原BsAb

效應物（細胞毒素等）細胞導向

腫瘤細胞抗原BsAb效應細胞（CTL、LAK等）第37頁/共88頁雙特異性抗體

抗人肝癌單抗/抗人CD3單抗抗Her2/neu單抗/抗人CD16單抗抗人CD20單抗/抗人CD3單抗

抗人卵巢癌單抗/抗人CD3單抗第38頁/共88頁

5.

抗體融合蛋白和免疫毒素將編碼抗原結合部位的基因片段（Fab或Fv段）與毒素或酶的基因融合在一起，可將特定的生物活性物質導向特定部位。第39頁/共88頁

抗體融合蛋白

抗人卵巢癌單抗-IL-12血吸蟲病抗獨特型抗體-IL-12第40頁/共88頁表1FDA批準上市的單克隆抗體藥物產品研究者適應癥目標抗原批準年份抗體類型EnbrelImmunex類風濕關節炎TNF-α1998抗體融合蛋白AlefaceptBiogen銀屑病CD22003抗體融合蛋白第41頁/共88頁

重組免疫毒素借助DNA重組技術，將編碼抗體和毒素的基因連接在一起，產生的免疫毒素為重組免疫毒素。白喉毒素相思豆毒素假單胞菌外毒素優點：高效、非特異性毒性較低、體內穩定性較好、易穿透腫瘤、安全第42頁/共88頁

全人抗體的研究

鼠-人雜交瘤人-人雜交瘤轉人Ig基因組小鼠抗體庫技術非雜交瘤技術制備單抗第43頁/共88頁

通過基因轉染方法改良鼠骨髓瘤細胞，篩選穩定的鼠-人嵌合細胞，使融合的雜交瘤細胞遺傳性穩定，不易丟失染色體，可長期、穩定地分泌全人單克隆抗體。鼠-人雜交瘤技術第44頁/共88頁

鼠-人雜交瘤技術問題：鼠源成分殘留穩定性差染色體丟失第45頁/共88頁

人-人雜交瘤技術

問題：能穩定分泌抗體的親本細胞很難獲得穩定性差染色體易丟失第46頁/共88頁

人-人雜交瘤技術英國劍橋大學KarpasA(2001)報道建立了人-人雜交瘤技術，獲得Karpas707H人骨髓瘤細胞株，可制備全人抗體。第47頁/共88頁

轉入人的Ig基因組免疫動物全人抗體基因敲除小鼠轉人Ig基因組小鼠第48頁/共88頁抗體庫技術

基礎：

PCR技術的建立抗體分子在大腸桿菌的功能性表達噬菌體展示技術的發展第49頁/共88頁

抗體庫的種類：

●

初期的抗體庫

●噬菌體抗體庫

●大容量抗體庫第50頁/共88頁

人淋巴細胞抗原篩選產生特異克隆

RT-PCR

輕鏈重鏈基因轉印至NCDNA重組組合抗體庫E.coli隨機表達1.初期抗體庫第51頁/共88頁

噬菌體抗體（phageantibody）是將克隆的人AbV區基因與一種絲狀噬菌體DNA上的基因-Ⅲ或基因Ⅷ精確連接，轉染細菌后在其膜表面表達Fab段（或單鏈抗體）-噬菌體外殼蛋白（基因-Ⅲ或基因Ⅷ產物）的融合蛋白。2.噬菌體抗體庫第52頁/共88頁

這種噬菌體在一定意義上講相當于一個人B細胞克隆，將B細胞全套可變區基因克隆出來與噬菌體DNA相連，導入細菌體內使之表達，可制備人全套抗體，稱為噬菌體抗體庫。第53頁/共88頁

問題：

1、從未經免疫動物的抗體庫獲得的抗體其親和力不高

第54頁/共88頁

抗體體內生成的理論

抗原刺激前，機體具有抗體初級庫抗原刺激后，抗體生成的細胞群體被選擇，并發生克隆性增殖。在抗原的反復刺激下，抗體的V區發生高頻率突變，產生高親和力抗體的細胞被選擇，抗體進行類別轉換，最終抗體成熟。第55頁/共88頁抗體親和力改造鏈替換(ChainShuffling)計算機輔助設計下的定點突變高親和力克隆的選擇第56頁/共88頁2、抗體庫的庫容不足以涵蓋某種動物的抗體多樣性

第57頁/共88頁

3.大容量抗體庫???

天然抗體庫半合成抗體庫全合成抗體庫第58頁/共88頁

抗體庫的優點：

1.多數外源抗原對人體有害，不能隨意對人體進行免疫。噬菌體抗體無須免疫，可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，并能篩選針對該物種自身抗原的抗體；

2.輕、重鏈隨機組合的多樣性多于供體B細胞產生抗體的多樣性，構建一種噬菌體抗體文庫，可供產生針對多種特異性抗原的人源抗體，從而克服了難以建立人-人雜交瘤的困難；

3.細菌增殖快，培養成本低廉，適合工業化大規模生產，為臨床大量應用抗體提供了可能。第59頁/共88頁

總抗體庫（masterlibrary）人們將有望在原核系統模擬體內免疫過程，并任意克隆針對任何抗原的抗體。第60頁/共88頁

非雜交瘤技術制備單抗人B淋巴細胞轉染EB病毒及生長因子B細胞永生化第61頁/共88頁

Humira是Abbott/CAT公司開發的一種治療類風濕關節炎的抗體藥物，2002年上市，是完全人源化單抗，這是抗體藥物發展具有里程碑意義大事，預示著抗體藥物一個迅猛發展的新時代的來臨。2003年有4億美元的銷售額，2005年達到11億美元。Avastin2003年上市的治療結腸癌的抗體藥物，也是第一個從抗體庫中篩選出的Fab段抗體藥物。Avastin的上市使公司的股價上升了90億美元。第62頁/共88頁第二部分抗體的應用及產業化研究第63頁/共88頁單克隆抗體的應用基礎研究預防治療診斷第64頁/共88頁?

抗體是生化、免疫學、生物芯片等多種診斷試劑中的核心生物原料，在各種疾病的診斷領域具有廣泛的用途。我國目前用于臨床診斷方面的抗體80%

依靠進口。國外已批準的診斷性單抗有600多種，我國僅60余種。單克隆抗體用于診斷第65頁/共88頁單克隆抗體用于疾病診斷傳染病診斷腫瘤診斷免疫性疾病診斷內分泌疾病診斷血液病診斷第66頁/共88頁?心腦血管疾病、腫瘤、神經退行性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和內分泌性疾病等日益威脅著人類的健康。針對這些重要疾病，要不斷研究和開發新的治療藥物。雖然化學藥物一直占據主流地位，但抗體藥物導向性強、副作用小、半衰期長等優勢吸引了越來越多的投資。單克隆抗體用于治療第67頁/共88頁單克隆抗體用于疾病治療腫瘤自身免疫性疾病器官移植心血管疾病感染性疾病第68頁/共88頁表1FDA批準上市的單克隆抗體藥物產品研究者適應癥目標抗原批準年份抗體類型PanorexCentocor腫瘤17-1A1995鼠源抗體OthocloneOrthoBiotech異體移植CD31986鼠源抗體ReoproCentocor心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗體RituxanIDEC非何杰奇金斯淋巴癌CD201997嵌合抗體RemicadeCentocor類風濕關節炎TNF-α1999嵌合抗體SimulectNovartis腎臟移植CD251998嵌合抗體EnbrelImmunex類風濕關節炎TNF-α1998抗體融合蛋白SynagisMedimmune呼吸道感染Fprotein1998人源化抗體ZenapaxPDL腎臟移植CD251997人源化抗體HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗體MylotargCelltech白血病CD332000人源化抗體CampathMillennium淋巴癌CD522001人源化抗體ZevalinIDEC淋巴癌CD20-Y902002鼠源抗體HumiraAbbottLaboratories類風濕關節炎TNF-α2002人抗體XolairGenentech中度至嚴重的因敏感引起的哮喘IgE2003人源化抗體AlefaceptBiogen銀屑病CD22003抗體融合蛋白第69頁/共88頁

美國已上市18種單克隆抗體藥物

2002年銷售額29億美元

2003年40億美元

2005年90億美元

2008年150億美元

2010年300億美元第70頁/共88頁

2002年完全人源化單抗humira獲得批準上市，這是單克隆抗體藥物發展具有里程碑意義大事。Humira是Abbott/CAT公司開發的一種治療類風濕關節炎的單克隆抗體藥物，2003年有4億美元的銷售額，2005年達到11億美元。第71頁/共88頁

Avastin

是美國FDA批準的治療結腸癌的抗體藥物，也是第一個從抗體庫中篩選出的Fab段抗體藥物。Avastin的上市使公司的股價上升了90億美元。第72頁/共88頁

赫賽汀（英文名Trastuzumab），抗人表皮生長因子受體-2(HER-2)的人源化單克隆抗體，用于治療轉移性乳腺癌。有25%-30%原發性乳腺癌患者HER2過度表達。第73頁/共88頁

抗體藥物臨床應用廣泛，市場需求巨大。抗體藥物已占FDA批準生物技術藥的3/4，所有新研發藥物的1/3。第74頁/共88頁我國治療用抗體的研制現狀第75頁/共88頁中國僅有3個治療性單抗藥物獲準上市抗乙腦中和抗體（鼠源）肺癌治療性抗體（嵌合抗體）肝癌治療性抗體（鼠源片斷）第76頁/共88頁血吸蟲病治療性抗體狂犬病治療性抗體禽流感治療性抗體鼻咽癌治療性抗體肝癌治療性抗體第77頁/共88頁?抗獨特型抗體疫苗（anti-idAbvaccine）

單克隆抗體用于預防第78頁/共88頁