.SDS教程1SDS原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合 SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此 SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與 1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在 15KDa到200KDa 之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系， 符合下式：logMW=K–bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖， 可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線， 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳， 根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS[Laemmli 法]這種方法帖出來，大家是不是感覺非常的陌生呢？其實這種發(fā)方法很普遍， 現(xiàn)在大部分的實驗室都是用 Laemmli 法跑電泳的。如今實驗室中用的最多的蛋白電泳是源于 Laemmli 于1970年發(fā)表在 nature 上的一篇文章中的方法，這篇文章很特別 ,不僅被引用的次數(shù)較多，而且該篇并不是專門闡述蛋白電泳方法上的提出和改進(jìn)問題， 而是對噬菌體頭部包裝過程中的蛋白進(jìn)行分析過程中用到電泳分析方法而已，所以闡述如何操作的文字只有那么一小段（但相當(dāng)經(jīng)典），這是SDS（不連續(xù)系統(tǒng)）的首次成功應(yīng)用。現(xiàn)在我們在實驗室進(jìn)行的SDS 試劑的配方仍然是沿用了它的數(shù)據(jù) ,許多論文在描述其 SDS 時引用Laemmli 方法，目前常用的具有濃縮膠和分離膠的不連續(xù) SDS 的基礎(chǔ)的確來自Laemmli 方法，但也略有差別例如一些緩沖液的具體組成。你也許會恍然大悟：原來我們用的就是 Laemmli！Word專業(yè)資料.SDS各試劑配制方法30%聚丙烯酰胺溶液30% （w/v）AcrylamideWord專業(yè)資料.【組分濃度】各種組分名稱體積(mL)或質(zhì)量(g)備注30%Acr-Bis(29:1)100mL實驗室配制時用量(100mL)29%Acrylamide(丙烯酰胺)29g29.2g1%BIS(N,N’-亞甲丙烯酰1g0.8g胺)【配制方法】將29克丙烯酰胺和 1克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為 60ml 溫?zé)幔?7℃左右）的去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙猓a加水至終體積為 100ml。0.45 μm微孔濾膜過濾除菌和雜質(zhì)， 儲于棕色瓶， 4℃避光（用鋁箔紙包扎起來）保存。嚴(yán)格核實 pH不得超過 7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。【保存條件】4℃避光（用鋁箔紙包扎起來）保存【注意事項】丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收， 其作用具有累積性。 稱量丙烯酰胺和 N,N’-亞甲丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具。 可認(rèn)為聚丙烯酰胺無毒， 但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。1MTris-HCl （pH6.8）(濃縮膠buffer)【組分濃度】1MTris-HCl名稱 用量 備注Tris 12.1g去離子水 80ml濃鹽酸 9ml (36%的濃鹽酸)預(yù)實驗已確定去離子水 加入去離子水定容至 100ml 后，室溫保存【配制方法】稱量12.1gTris 堿溶于80mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓蛹s 9mL的濃HCl調(diào)節(jié)至所需要的 pH值，將溶液定容至 100mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定 pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高 1℃，溶液的 pH值大約降低 0.03個單位。【保存條件】室溫保存。【注意事項】對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。1.5MTris-HCl （pH8.8）(分離膠buffer)Word專業(yè)資料.【組分濃度】1.5MTris-HCl名稱用量備注Tris18.17g去離子水80mL濃鹽酸3mL(36%的濃鹽酸)預(yù)實驗已確定去離子水加入去離子水定容至100mL后，室溫保存【配制方法】100mL稱量18.17 gTris堿溶于80mL的去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙猓蛹s 3mL濃HCl調(diào)節(jié)至所需要的pH值，將溶液定容至 100mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。【保存條件】室溫保存【注意事項】應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個單位。10% 十二烷基硫酸鈉SDS溶液10%(w/v)SDS【組分濃度】10%(w/v)SDS名稱用量備注SDS1g去離子水8mL加入去離子水定容至10ml后，室溫保存【配制方法】稱取2g高純度的SDS置于100~200mL 燒杯中，加入約 16mL 的去離子水，于 68℃加熱溶解，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至20mL后，室溫保存。【保存條件】室溫保存【注意事項】對人體有害，請注意防護(hù)。10% 過硫酸銨溶液10%(w/v)APS【組分濃度】10%(w/v) 過硫酸銨(APS)Word專業(yè)資料.名稱用量備注過硫酸銨0.1g去離子水1mL現(xiàn)配現(xiàn)用【配制方法】稱取0.1g過硫酸銨置于1.5mL離心管，加1mL去離子水吹打溶解，亦可以加倍，即稱取1g過硫酸銨，加入10mL的去離子水后攪拌溶解。4℃保存。【保存條件】4℃保存【注意事項】10%過硫酸銨溶液在4℃保存時，可使用2周左右，超過期限會失去催化作用。5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液5×Tris-Glycinebuffer（SDS電泳緩沖液）【組分濃度】各種組分名稱配制不同體積所需各成分的體積(mL)或質(zhì)量(g)1000ml500ml0.125MTris15.1g1.25Mglycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】稱取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸餾水或去離子水溶解，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?000mL，室溫保存。得0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋5倍。【保存條件】室溫保存，兩年有效。【注意事項】配制好的電泳液使用時間不宜超過兩周。電泳緩沖液可以回收，回收后可再使用1-2次，但為了取得最佳的電泳效果，應(yīng)使用新電泳液。5×SDS加樣緩沖液5×SDSLoadingBufferWord專業(yè)資料.【組分濃度】0.25MTris-HCl(pH6.8) ；10%(W/V)SDS ；0.5%(W/V)BPB( 溴酚藍(lán))；50%(V/V) 甘油；5%(W/V) β-巰基乙醇(2-ME)或0.5MDTT( 二硫蘇糖醇)各種組分名稱 配制用量 備注總體積 10mL1MTris-HCl(pH6.8) 2.5mLSDS 1gBPB(溴酚藍(lán)) 50mg甘油 5mL（0.5mL/份）分裝，室溫保存，使用前加 25μL2-ME/小份，保存一個月左右。β-巰基乙醇(2-ME) 0.5mL【配制方法】量取1.25mL1MTris-HCl （pH6.8），0.5gSDS，25mgBPB ，2.5mL甘油，置于 10mL 塑料離心管中，加去離子水溶解后，定容至 5mL，小份（0.5mL/份）分裝，于室溫保存。使用前將 25μL的2-ME加入到每小份中。加入 2-ME的LoadingBuffer 可在室溫下保存一個月左右。【保存條件】-20℃保存，至少一年有效。【注意事項】SDS蛋白上樣緩沖液 (5X)中含少量 DTT或β-巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，必須完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于 β-巰基乙醇，且粉末的穩(wěn)定性也高于 β-巰基乙醇。DTT的最佳工作pH圍為7.1-8.0，但DTT價格略高一些。蛋白巰基還原實驗DTT的常用工作濃度是1-10mM。摘自Takara商品目錄--實驗室常規(guī)試劑配制方法TEMED原液直接使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液【組分濃度】0.1%(w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250，25%(v/v)異丙醇，10%(v/v)冰醋酸各種組分名稱配制不同體積所需各成分的體積(mL)或質(zhì)量(g)1000ml備注考馬斯亮藍(lán)R-2501.0g可以多加點，最好在搖床上搖搖，多溶解些。異丙醇250mL攪拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇難聞且對身體有害。乙醇濃度太大會使膠皺縮。冰醋酸100mL攪拌均勻去離子水650mL攪拌均勻，濾紙快速過濾除去顆粒物，室溫保存Word專業(yè)資料.考馬斯亮藍(lán) R250染色，染色時間控制在 0.5-1h。（注意：（1）保存考馬斯亮藍(lán) R250可回收使用，可保存很長時間，但一般不超過 6個月；（2）染色時間過長難以脫色，過短染色效果不佳；）考馬斯亮藍(lán)染色脫色液【組分濃度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇名稱用量備注冰醋酸100mL乙醇250mL一般加的量與染色液相同，只是不加R-250去離子水650mL充分混勻后使用脫色（三個小時后應(yīng)換次脫色液，再重新加入脫色液且約需脫色24小時，直到背景清晰為止）1）蒸餾水中沖洗2-3次2）7％冰乙酸固定3）7％冰乙酸10％乙醇83ml蒸餾水脫色4）7％冰乙酸保存（要檢測脫色后的膠，則需保存于7％冰乙酸中）蒸餾水沖洗→7％冰乙酸（關(guān)鍵步驟），10％乙醇脫色脫色液：7％冰乙酸 ，10％乙醇，83ml 蒸餾水7％冰乙酸保存（蒸餾水沖洗后用 7％冰乙酸保存且約二～四天后再照膠，條帶更為清晰） 。銀氨染色用凝膠固定液（質(zhì)譜用）【組分濃度】50%(V/V)甲醇，10%(V/V)醋酸名稱用量備注甲醇500mL醋酸100mL去離子水400mL充分混勻后室溫保存Word專業(yè)資料.銀氨染色用凝膠處理液【組分濃度】50%(v/v)甲醇，10%(v/v)戊二醛名稱用量備注甲醇50mL戊二醛10mL去離子水40mL充分混勻后室溫保存銀氨染色用凝膠染色液【組分濃度】0.4%(w/v)AgNO3，1%(v/v)濃NH3·H2O，0.04%(w/v)NaOH名稱用量備注20%AgNO32mL濃NH3·H2O1mL4%NaOH1mL去離子水96mL充分混勻后室溫保存【配制方法】取上述試劑加入 100~200mL 的試劑瓶中，均勻混合。該溶液應(yīng)為無色透明狀。如果氨水濃度過低時溶液會呈混濁狀，此時應(yīng)補加濃氨水直至透明。本染色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，不宜保存。銀氨染色用顯影液【組分濃度】0.005%(w/v)檸檬酸，0.02%(v/v)甲醛名稱用量備注檸檬酸50mg甲醛0.2mL去離子水定容至1L后充分混勻，室溫保存SDS凝膠配方1) 根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制 SDS的分離膠(即下層膠)：Word專業(yè)資料.丙烯酰胺在凝膠中的百分比分離膠最佳分離圍5%60-212kDa7.5%30-120kDa10%18-75kDa12%12-60kDa15%15-45kDa來源于《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》汪家政每種濃度的變性膠的分離圍不是指能跑出哪個圍分子量的蛋白質(zhì)， 而是指在這個區(qū)間， 蛋白質(zhì)遷移率基本和分子量成正比， 也就是線性關(guān)系， 為了數(shù)據(jù)的可靠性， 大家盡量根據(jù)這個來選擇自己配膠的濃度。成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠510152025304050蒸餾水2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.05.06.08.010.01.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0.0320.04成分 配制不同體積 SDS 分離膠所需各成分的體積（毫升）Word專業(yè)資料.8%膠510152025304050蒸餾水2.34.66.99.311.513.916.523.230%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.36.78.010.713.31.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0.03成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）10%膠510152025304050蒸餾水1.94.05.97.99.911.915.919.830%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.78.310.013.316.71.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠510152025304050蒸餾水1.63.34.96.68.29.913.216.530%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.010.012.016.020.01.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.5Word專業(yè)資料.0.050.010.150.20.250.30.40.510%SDS0.050.010.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02TEMED成分 配制不同體積 SDS 分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠510152025304050蒸餾水1.12.33.44.65.76.99.211.530%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.012.515.020.025.01.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注：如果配制非變性膠，參考上述配方，不加 10%SDS即可配制成非變性 PAGE膠。按照如下表格配制SDS的濃縮膠(也稱堆積膠、積層膠或上層膠)：成分 配制不同體積 SDS 濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%濃縮膠123456810蒸餾水0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.170.330.50.670.831.01.31.71MTris,pH8.80.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.1Word專業(yè)資料.10%過硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01TBST 緩沖液每2L體積中含：1MTrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐溫1mlWesternblot 用的緩沖溶液。抗體去除液每50mL 抗體去除液中含：0.5MTrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS操作方法Word專業(yè)資料.1、20uL 收集液，加入 5×樣品緩沖液 5ul，在 80℃水浴鍋中煮 5min。按照上面配方制SDS 凝膠，安裝好電泳儀，在槽中加入電極緩沖液。3、按一定順序在加樣孔中加入樣品，根據(jù) SDS 電泳玻璃板間隙厚度不同，選擇加入樣品量，一般 0.75mm 間隙 15 孔的上樣量 <10uL/ 孔,1mm 間隙 10 孔的上樣量<20ul/ 孔。上樣量根據(jù)實際經(jīng)驗自己掌握。4、打開電源將電壓調(diào)到 80v（一般 15min 左右），待樣品跑過壓縮膠后將電壓調(diào)到 120v至樣品電泳到膠底部為止。5、將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液，用搖床搖 2－3h、待條帶清晰后倒出染色液，加入脫色液過夜、將脫色液倒掉，可以用QualityOne，或者相應(yīng)的成像系統(tǒng)拍照、分析、估算蛋白濃度。SDS 膠的凝結(jié)速度受溫度影響很大，隨著溫度的升高，凝結(jié)速度越來越快，溫度降低則反之。所以，夏天時膠凝結(jié)的比較快，而冬天膠的凝結(jié)速度則變慢，甚至不能凝結(jié)，解決此類問題較可行的方法是： 冬天在原配方的基礎(chǔ)上加倍過硫酸銨和 TEMED的使用量，可很好的解決膠凝結(jié)速度過慢的問題。借鑒 Tricine-SDS 中添加甘油或者尿素來提高分辨率的成功經(jīng)驗，在普通的SDS中加入約 13%的甘油，同樣可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的彌散。只要把原來配方中的水換成 60%的甘油，就可以了。在分離膠中加尿素和甘油都可以， 加上尿素和甘油改變膠的孔徑！ 特別是對分離糖蛋白的時候很有用處！一方面可以把條帶壓窄，減少拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生 ,另一方面對分離小分子量的蛋Word專業(yè)資料.白有好處!一般加的量在 0.5－3g尿素/12ml 分離膠！自己可以跑來實驗一下你跑 9KD分子量的蛋白，建議用 tricine-sds 電泳來跑！也可以在分離膠中加尿素！以我經(jīng)驗來看，加尿素會好于甘油！電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負(fù)極在上。接通電源進(jìn)行電泳，電場強度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時宜用較低的電壓以免發(fā)熱過度影響分離。蛋白質(zhì)向正極移動。待染料前沿移動至管底近處，停止電流。電泳時間為1-2小時。加入染色液后，先放入微波爐里加熱 5-10 秒，使染色液微熱即可（千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖 20分鐘，最多半小時就染好了。脫色也很簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸 5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點點， 不如那樣清楚，只要電泳時比平時多上 1/5 的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！放心，反復(fù)煮膠不會把膠煮壞的。拍膠時的“黑十字”聚焦法！很多人用相機的微距聚焦都無法使識別框變綠， 其實你只需要在膠所在的平面劃一個黑十字就可以很好的聚焦，尤其是 western blot 的圖，直接在膜的邊上劃就可以聚焦 SDSPAGE的話可以找個顏色深東西放在膠的邊上就可以了，把鏡頭對準(zhǔn)它。SDS注意事項Word專業(yè)資料.1、膠凝的快慢不在于 TEMED多少，在于 APS的量，APS提供自由基，TEMED幫助自由基作用，是催化劑，對凝固速度影響不是太大，可以試試加大 APS的量。2、下層也就是陽極緩沖液的作用當(dāng)然是導(dǎo)電，用普通 TRIS緩沖液做陽極緩沖液，一樣跑得好，陰極就不一樣了，需要提供離子強度和 SDS環(huán)境，而在電泳過程中，陰極緩沖液的一些離子損失，而且與樣品接觸，不適合再次使用。至于有些時候跑太大濃度的膠，因為藥品，BUFFER配制過程的一些問題， 導(dǎo)致會出現(xiàn)蛋白帶無法電泳到分離膠的最下方，膠跑得難看情況比較多，一般來說， 15%的膠已經(jīng)能夠跑出大約 15KDa左右的蛋白，對于普通SDS已經(jīng)幾乎到了極限，還跑不出來的 MARK帶，就不必去追究商品的問題了。3、做SDS的時候，除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來的膠各個泳道之間的 band 能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是 WB。做法就是拿 1X的上樣緩沖液補全要加的樣做到體積一致，否則跑出來會有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。SDS問題匯總Q：蛋白質(zhì)條帶為什么走到下面逐漸變寬發(fā)散？回答：多數(shù)情況是因為小分子在膠里的運動不規(guī)律， 這種情況常發(fā)生在高濃度膠或凝固不一致的膠里，你可以加大陰極的緩沖液濃度，可能會有點改善。Q：在做蛋白表達(dá)的時候，包涵體的出現(xiàn)常常令大家頭疼不已， 現(xiàn)在給大家推薦鹽離子染SDS 的方法，這種方法簡單快速還干凈，適合于切膠免疫的同學(xué)，具體操作就是把Word專業(yè)資料.配好的0.5M的氯化鉀放在冰箱預(yù)冷， 然后加在膠上慢慢晃動， 大約5分鐘就可以看見你的蛋白條帶，切膠回收后直接乳化免疫，不會有什么影響。 如果無法識別，還可以再用實驗室傳統(tǒng)的方法染色！Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？A：在 SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是 Tris－HCl 緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠 pH8.9；而電泳緩沖液使用的 Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其 pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而 Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶， 蛋白分子就介于二者之間泳動。 由于導(dǎo)電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了 較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中 pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小， 在電場的作用下， 蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以， pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS處理、非還原 SDS處理、帶有烷基化作用的還原 SDS處理。1、還原SDS處理：在上樣buffer 中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成 SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮 5min，再離心加樣。 2、帶有烷基化作用的還原 SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù) SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶； 另碘乙酸胺可捕Word專業(yè)資料.集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。 100ul樣品緩沖液中 10ul20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫 30min。3、非還原 SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用 1％SDS沸水中煮 3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。Q：SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCl系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與APS：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高SDS電泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或 4℃冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致 SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存 4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法， 具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》 P82-103。Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。Word專業(yè)資料.Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大