各種特殊生物顯微鏡的原理和使用第1頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四特殊生物顯微鏡的原理與使用第2頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四主要內容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡第3頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1暗視野顯微鏡根據丁達爾效應原理設計的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡觀察到明場看不到的極其微小的物體最高分辨率可達0.004微米第4頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1.1原理丁達爾現象：在日常生活中，室內飛揚的微粒灰塵是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒粒可見了，這就是微粒發光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發光原理設計的。1.2結構特點使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發生反射或散射，散射的光線投入物鏡內，因而整個視野是黑暗的。第5頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四暗場顯微鏡原理第6頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1.3成像特點及優缺點在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結構。但被檢物體為非均質時，并大于1／2波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。第8頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1.4應用：微小粒子、細菌形態、細菌記數，透明標本觀察等。1.5暗場顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求第9頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1.6暗場觀察方式調節(1)換上暗場聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側兩個調節螺絲進行調整，再將其開大到相應位置。第10頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四2相差顯微鏡2.1原理光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。當光通過物體時，如波長和振幅發生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經染色的生物標本，因細胞各部微細結構的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發生變化，僅相位有變化(相應發生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。第11頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。2.2結構特點相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸調節用的望遠鏡。環狀光闌是由大小不同的環狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。第13頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發生變化的作用。調軸望遠鏡是用來進行合鈾調節的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調節光闌的亮環和相板的環狀圈重合（共軛重合），才能發揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。第14頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四2.3使用方法（1）相差裝置的調換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調焦打開光源，旋轉集光器轉盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調焦。旋轉環狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40X時應用40X標示孔的光闌。第15頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四（3）合鈾調整拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動望遠鏡內筒使其上升，當對準焦點就能看到環狀光闌的亮環和相板的暗環，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節其下的螺旋使亮環的大小與暗環一致，然后左右前后調節環狀光闌聚光器上的調節鈕，使兩環完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環狀光闌。第16頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四2.4用途用于觀察組織培養中活細胞形態結構。活細胞無色透明，一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結構，組織培養研究常用的是倒置相差顯微鏡。第17頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四偏光顯微鏡依據波動光學原理觀察和精密測定標本細節,或透明物體改變光束的物理參數,以此判別物質結構的一種顯微鏡分辨率可達0.04微米將普通光改變為偏振光進行鏡檢,以鑒別某一物質具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)第18頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四一、偏振光與自然光1.橫波的偏振性光矢量的振動方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內,可有不同的振動方向。v0HE只有橫波才有偏振現象第19頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四2.線偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振動。E播傳方向振動面3.自然光—普通光源發出的光,在垂直于傳播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E的振幅都相等。第20頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四二、起偏和檢偏起偏：使自然光（或非線偏振光）變成線偏振光的過程。檢偏：檢查入射光的偏振性的過程。雙折射現象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光的現象。尼科耳棱鏡。在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。第21頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四尋常光線(o光):遵守折射定律。對于晶體一切方向都具有相同的折射率，且在入射面內傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內傳播。o光和e光都是線偏振光,且振動方向相互垂直第22頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四二向色性：某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）對光振動有強烈的選擇性吸收能力，這種性質稱為二向色性。如電氣石晶體對自然光的某一振動方向上的光振動幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動只稍微減弱后通過。旋光現象：線偏振光通過某些透明介質后，它的光振動方向將繞著光的傳播方向旋轉某一角度的現象，稱為旋光現象。這種介質稱為旋光物質。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。第23頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....第25頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....第26頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....第27頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四偏振光經過旋轉的檢偏器后光強發生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....第28頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四尼科爾棱鏡第29頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第30頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四用途用于研究組織晶體物質及纖維等的光學性質第31頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四微分干涉顯微鏡無色透明活體標本的細微結構圖象呈浮雕狀的立體感觀察效果更加逼真第32頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四1原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強度相等的光束，光束載極近的兩點（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現出立體三維感覺。2特點可以使被檢物體產生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調節背景和物體的顏色變化而達到理想的效果。第33頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光365nm或紫藍光420nm)作為激發光、激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。第35頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四

什么是熒光：物質中的電子吸收光的能量由低能狀態轉變為高能狀態，再回到低能狀態時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質吸收短波光，發射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發——光化熒光第36頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第37頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光的種類：自發熒光（固有熒光）二次熒光第38頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光的性質：

吸收光，必需有激發光源熒光波長＞激發波長（損失熱能）熒光強度極小于激發光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發光強度、被檢物濃度、熒光效率第39頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四二、熒光顯微鏡的種類：透射式落射式第40頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第41頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第42頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光顯微鏡第43頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡物鏡

落射式汞燈光源激發濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡第44頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光顯微鏡內部構造第45頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四落射熒光顯微鏡光路圖第46頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四透射熒光顯微鏡光路圖第47頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四落射式熒光顯微鏡優點由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調節。采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。物鏡數值孔徑不受限制，在高放大被率時，也可以獲得高分辨率的像。厚的或不透明的標本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。其它觀察法也能與反射熒光結合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結合。可以避免不必要的熒光色衰褪現象。第48頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四超高壓汞燈第49頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產生最強熒光的激發光波長，所以需加用激發濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發濾片），僅使一定波長的激發光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發光照射后，在極短時間內發射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。第50頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光濾色片組紫外光（UV）：激發光譜區域：330-400nm；

可見熒光起紿光譜：425nm紫

光（V）：激發光區域：395-415nm；

可見熒光起紿光譜：455nm藍

光（B）：激發光譜區域：420-485nm；

可見熒光起紿光譜：515nm綠

光（G）：激發光譜區域：460-550nm；

可見熒光起紿光譜：590nm第51頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光專用物鏡FL25X/0.65FL40X/1.0（甘油）FL100X/1.25（甘油）第52頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四熒光染料：核酸：溴化乙錠、吖啶橙、PI、DAPI等。細胞骨架：鬼筆環肽。蛋白：抗原抗體免疫熒光各種熒光蛋白（GFP、YFP等）第53頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四四、使用方法．1．打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；第54頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四

4．高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經5分鐘后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。第55頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四五、用途1觀察標本中的自發熒光物質或以熒光素染色或標記的細胞和結構2標本中的熒光物質在紫外線激發下產生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質在細胞和組織內的分布。組織中的自發性熒光物質如神經細胞和心肌細胞等內的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細胞和視網膜色素上皮細胞內的維生素A呈綠色熒光，某些神經內分泌細胞和神經纖維內的單胺類物質（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內含有的奎寧、四環素等藥物也呈現一定的熒光。第56頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四3細胞內的某些成分可與熒光素結合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進行細胞內DNA含量測定。

4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體（一抗或二抗），用該標記抗體直接或間接地與細胞內的相應抗原結合，以檢測該抗原的存在與分布。第57頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標本的單色和雙色觀察第58頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光掃描共焦顯微鏡技術介紹：激光掃描顯微鏡是建立在光學顯微鏡及各種掃描顯微鏡基礎上的一種新型的掃描成象系統。采用激光作為光源，使用激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，利用聚焦的激光束在樣品表面掃描，同時利用光電檢測器件接收樣品反射光（或透射光），樣品結構的變化使反射光（或透射光）強度改變，因而使光電檢測器的輸出電流改變，經信號處理，同步顯示在計算機屏幕上。

第59頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光物鏡標本共聚焦針孔(Pinhole)光電倍增管(PMT)熒光濾光片

(發射光濾色片)共聚焦原理第60頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第61頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四掃描？X線上的熒光強度變化多條線構成2維圖像第62頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四XY掃描顯微鏡Z顯示器標本63第63頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四標本PMTPC為什么用PMT（光電倍增管）？相比CCD，PMT擁有更高的感光效率更快的讀出速度（微秒級）PMT采集時間信息——電腦還原為位置信息第64頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續光學切片3.增加側向分辨率4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響第65頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四寬場照明顯微鏡和共聚焦圖像比較第66頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:1.點照明，激光光源2.具有照明小孔和探測小孔3.照明小孔和探測小孔共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統——逐點掃描成像5.無損傷、連續光學切片，顯微“CT”6.真正的三維重組7.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物

第67頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光共聚焦顯微鏡的組成激光共聚焦顯微鏡一般由激光光源，顯微鏡和成像系統三部分組成第68頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光光源Laserlines（Cofocal)

405,442,457,477,488,

514,543,568,637nm第69頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四例如：藍光激光二極管405nmexcitation.HQ442/45emissionfilter(DAPI)Applicationse.g.DAPI,HoechstCFPPacificBlueothers…..第70頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四

氦-氖激光(

HeNelaser)

543nm,633nm第71頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四氬激光(

Arlaser)

458,477,488,514,568nm,

第72頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四顯微鏡UprightMicroscopesNikonE600NikonE800NikonE1000NikonOptiphot2ZeissAxioplan2ZeissAxioskopOlympusBX50/51OlympusBX50WIOlympusBX60OlympusBH2InvertedMicroscopesNikonTE2000,TE300NikonDiaphot300ZeissAxiovert200andTVZeissAxiotechOlympusIX70andTVR第73頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四激光共聚焦顯微鏡在生物學中的應用。第74頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四組織光學切片第75頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四三維圖像重建第76頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四第77頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四Cy2-anti-basementmembraneproteinCy3anti-neuronalprocessesCy5anti-bloodvesselprotein.多熒光標記分析第78頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四動物細胞間的胞間通訊研究第79頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四植物細胞間的胞間通訊研究植物細胞中胞間連絲相關蛋白Rab11的定位第80頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四Aconfocalimageofa6-day-oldzebrafish(dorsalview)embryothathasbeendouble-labeledwithantibodiesagainstcelladhesionmoleculesshowsstainingofdifferentsubpopulationsofaxonsinthenervoussystem..PhotonicSolutionsforBiotechnologyandMedicineNovember2002第81頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四活體狀態下細胞的動態變化擬南芥側根頂端分生細胞的分裂第82頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四活細胞延時實驗：第83頁，共91頁，2023年，2月20日，星期四根據激光發生器的不同，目前可分為單光子激光共聚焦顯微鏡（ConfocallaserscanningMicroscopy

）、雙光子激光掃描顯微鏡(

two-photonexcitationMicroscopy)和多光子激光共聚焦顯微鏡（Multi-photonMicroscopy）。第84頁，共91頁，2023年，2月2