檢定菌種保存、傳代、使用、銷毀標準操作規程.目的：為規范微生物學檢定用菌的管理，確保菌種的溯源性與穩定性，從而確保微生物學檢驗結果的準確可靠。.范圍：本規程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義：標準菌種是指由中國藥品生物制品檢定所醫學微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標準菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標準菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養基上或培養基內，每萌發一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。.職責：檢驗科負責提出菌（毒）種的購買申請，并按國家有關生物安全法規的要求做好使用管理和銷毀工作。總務科負責實施采購，檢驗科負責保存、驗收。.規程：.檢定菌的申購檢驗科每年根據檢定菌種的使用情況（包括臨時檢驗需要），提出購買計劃，交由中心分管主任審批后，向中檢所菌種保藏中心購買凍干菌種（標準菌種）；也可以直接向省（市）疾控部門申請提供傳代用菌種，需詢問與確定菌種的代數，以便傳代時控制代數。.檢定菌的接收菌種到達實驗室后，由菌（毒）種保管人接收菌種，檢查其名稱和數量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在《檢定菌種接收記錄》（附表1）上，并將其暫貯存于4?8℃冰箱中，在一周內必須完成轉種。.檢定菌的保存工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌生長充分以后，轉移至2?8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發現異常情況，經應滅活處理后銷毀。保存時間根據菌種種類而不同，細菌：1個月；酵母菌：2個月；霉菌及芽胞：3個月。傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。甘油冷凍管保存法用無菌接種環輕輕刮取經冷凍復溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環與試管壁之間的輕輕摩擦而使細菌充分擴散到預先裝入試管中的無菌純化水中，調整菌液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%）,即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-80℃冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）。可以每隔2年轉種一代。使用時，取出一支放至室溫，轉種增菌培養或接種至瓊脂斜面復蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。液體石蠟保存法無菌液體石蠟的制備：選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121℃滅菌30分鐘，置40℃恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養基中，在適宜條件下培養結束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養好的菌種管內，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍或2?8℃冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽抱桿菌的保存（如枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。各菌種的保存方法、條件及期限，見《傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限》（附件1）。.檢定菌的傳代檢定菌菌種的傳代因凍干菌（標準菌種）與傳代用菌種而不完全相同。標準菌種的復蘇、確認、傳代標準菌種的復蘇把凍干菌種管、滅菌毛細滴管（加1）、雙碟、鑷子、營養肉湯培養基（或其它適宜培養基）數支，移入接種室或超凈工作臺。將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將標準菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌毛細滴管吸取營養肉湯培養基（或其它適宜的培養基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取營養肉湯培養基（或其它適宜的培養基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，接種至營養肉湯培養基（或其它適宜的培養基）內，并根據不同菌種類型而將其培養于相宜的溫度下24?72小時（細菌需要24?48h的培養物，酵母菌需要72小時的培養物，形成抱子的微生物則宜保藏抱子，放線菌和絲狀真菌則應培養7?10天）。最后將毛細滴管及菌種管經高溫滅菌（121℃,45分鐘）。取出培養物，仔細觀察液體培養基是否渾濁，渾濁說明菌種復活生長，若不渾濁，在將其作為無活菌生長的培養物丟棄以前，細菌應至少培養1周以上，真菌和酵母菌至少應培養2周以上，并在丟棄之前應高溫滅活處理（121℃,45分鐘）。標準菌種的確認用無菌接種環取上述培養物接種到營養瓊脂培養基（細菌）或玫瑰紅鈉培養基（真菌和酵母菌）平板上，或相應的宜于該菌生長的鑒別培養基平板上，然后在30?35℃下培養3天（細菌）；20?25℃下培養5天（真菌和酵母菌）。培養后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養基，每種菌劃4個平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落，進行保存和鑒定。鑒定時作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態特征。最后再做生化實驗以進一步鑒定該菌種。若在該平板上發現有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應將此被污染了的培養物滅活處理，并尋找原因。應根據其原因采取措施重新分離挑選純菌落。菌種的確認結果，記錄在《檢定菌種鑒定記錄》上。各檢定菌種的復活、劃線用培養基、培養條件，見《菌種復活、劃線用培養基、培養條件》（附件2）。標準菌種的傳代按菌種說明書要求復溶菌粉，轉種于適宜的增菌培養基內，稱第1代（G），復壯后轉接至平板上，并在適當溫度下培養適當時間，分離單個純種菌落，此為1第2代（GJ。菌種確認后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，作為保存菌種（G2）,也稱傳代用菌種，同時挑取純菌落轉接斜面菌種數支，作為工作用菌種，此為第3代（WJ。將第2代（GJ菌種管冷凍保存，將工作用菌（WJ于適當溫度下培養適當時間后用于日常檢驗。取一支冷凍保存的第2代（GJ菌種轉種于平板和斜面培養基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G）；斜面培養基的菌種經適當溫度下培養適當時間后3用作工作用菌種，此仍為第3代（WJ。將第3代菌種（GJ冷凍或低溫保存，將生長、轉種后的第2代（GJ菌種經高溫滅活處理后丟棄。按上述規程操作，直至G4轉為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復上述規程操作，保存和使用菌種。當工作用菌種代數小于5時，在規定保存期限內，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種。2.傳代用菌種的傳代當無標準用菌種時，可從省（市）疾控部門申請提供菌種作為傳代用菌種，不需經過復溶增菌，但應劃線接種確認。將無異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據日常檢驗工作的需要量，挑取純菌落轉接斜面菌種數支，作為工作用菌種（為第4代），同時，結合菌種的代數和最長保存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“5.3.2.”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。工作用菌種的傳代當工作用菌種代數小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種。取在冰箱4?8℃保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面傳代，并將新傳代的培養物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌種，進行復蘇，直接作為工作用菌種。細菌每1個月傳代一次；酵母菌每2個月傳代一次；霉菌及芽胞每3個月傳代一次。當超過5代，須用傳代用菌種傳代。傳代時注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時實驗人員也要采取有效的預防措施進行自我保護，如工作時必須穿工作服，佩帶無菌手套，實驗完成以后消毒實驗進行的區域、實驗儀器和器具。如發生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學檢驗人員應立即向檢驗科科長報告以便及時進行處理。傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標簽，標簽內容包括：名稱、編號、代數、傳代日期、操作人、有效期。同時及時填寫《檢定菌種傳代記錄》（附表2）。.檢定菌種的編號采用漢字加數字表示：漢字簡稱一代次一傳代日期一順序號菌種的漢字簡寫：大腸埃希菌（簡稱：大腸）、金黃色葡萄球菌（金葡）、沙門氏菌（沙門）、志賀氏菌（志賀）、銅綠假單胞菌（銅綠）、副溶血弧菌（副溶血）、蠟樣芽胞桿菌（蠟樣） 代數用一位帶有下標數字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數字表示：年份取四位數，月、日分別用兩位數。如2014年1月12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號為：大腸-G-20140112-01。3.檢定菌種的保管檢定菌種設專人加雙鎖保管，并對所保存的菌種建立《檢定菌種保存、領用登記臺賬》（附表3）。檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保存期間，應每天檢查保存菌種冰箱的溫度、菌種管的塞子是否松動或生霉，并及時填寫《檢定菌種觀察記錄》（附表4）,如有異常應及時處理。菌種在保存期內均應根據菌種的特性（工作用菌種每轉種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態及生化特性等項目，若發現與原菌種變異較大，應重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好《檢定菌種鑒定記錄》（附表5）。所保管的菌種，不能隨意轉讓其他單位和個人，需要時應有單位證明和批準手續方可供應。.檢定菌種的領用與使用微生物學檢驗人員根據檢驗需要，需向菌種保管人員領取工作用菌種或傳代用菌種，同時填寫《檢定菌種領用登記臺賬》相關內容。微生物學檢驗人員領取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗或驗證試驗，使用后及時填寫《檢定菌種使用登記臺賬》（附表6）,以便追蹤菌種使用歷史。.檢定菌種（廢棄）的銷毀下列情況的菌種或培養物或被污染的器具等，必須采用121℃、45分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；使用完后的菌種和帶有標準菌種的器具和培養物；超過有效期的菌種；凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；其他應廢棄的菌種。廢棄菌種的銷毀由菌種保管人提出申請，由檢驗科科長批準后，由微生物學檢驗員進行滅活處理，并有其他人在場監督，并填寫《廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄》（附表7）。.記錄歸檔本標準涉及的記錄由質量管理部門保存，保存期5年。.附則：本標準附件二份，附表六份：附件1：《傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限》附件2：《菌種復活、劃線用培養基、培養條件》附表1：《檢定菌種接收記錄》附表2：《檢定菌種傳代、分離記錄》附表3：《檢定菌種保存、領用登記臺賬》附表4：《檢定菌種觀察記錄》附表5：《檢定菌種鑒定記錄》附表6：《檢定菌種使用登記臺賬》附表7：《廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄》

附件1:傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌［ATCC8808〕甘油冷凍管-80℃3年金黃色葡萄球菌［ATCC6538〕甘油冷凍管-80℃3年志賀氏菌（福氏6型）［ATCC00572〕甘油冷凍管-80℃3年銅綠假單胞菌［ATCC27853〕甘油冷凍管-80℃3年副溶血性弧菌［ATCC17802〕甘油冷凍管-80℃3年鼠傷寒沙門氏菌［ATCC50098〕甘油冷凍管-80℃3年蠟樣芽胞桿菌［ATCC2906］甘油冷凍管-80℃3年附件2：菌種復活、劃線用培養基、培養條件菌種名稱復活培養基劃線用培養基培養溫度培養時間大腸埃希菌TSB或營養肉湯TSA或營養瓊脂培養基平皿36℃24h金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌鼠傷寒沙門氏菌副溶血性弧菌3%NaClTSB或3%NaCl營養肉湯3%NaClTSB或3%NaCl營養瓊脂培養基平皿36℃24h白色念珠菌TSB或改良馬丁SDA或玫瑰紅鈉培養基平皿24℃48h黑曲霉7d胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）

記錄名稱檢定菌種傳代記錄名稱及編號購進（領取）日期年月日傳代前菌種保存方法傳代用培養基傳代日期傳代用菌種編號總數量傳代用菌種工作數量編號有效期保存方法數量編號分