植物的胚胎培養是指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳等胚胎組織進行離體培養，使其發育成完整植株或者離體研究植物胚胎發生機理的生物技術。植物胚胎培養的概念胚乳胚子房胚珠第一頁，共61頁。8.1離體胚培養8.2植物胚珠和子房培養8.3

離體授粉、受精與合子培養8.4胚乳培養第二頁，共61頁。8.1.1離體胚培養的概念離體胚培養（embryoculture）指從植物種子中分離出胚組織進行離體培養的技術。包括幼胚培養和成熟胚培養。8.1離體胚培養花生成熟胚幼胚第三頁，共61頁。8.1.2成熟胚培養（matureembryoculture）是指對發育成熟種子胚的培養。成熟胚培養主要是為了打破種子的休眠，并誘導形成小植株，因此，培養基相對簡單，一般只需要大量元素和糖即可，有些培養為了打破種子休眠也加入一些植物激素。水稻成熟胚培養第四頁，共61頁。臺灣紅豆杉成熟胚培養觀賞與藥用（紫杉醇）種子有休眠特性第五頁，共61頁。

牡丹成熟胚的離體培養與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony種子有休眠特性（種皮與未完成后熟的原因）第六頁，共61頁。8.1.3幼胚培養（immatureembryoculture）是指對發育早期胚或未成熟胚的培養，即供給一定的培養條件，使幼胚逐步發育成成熟胚，并進一步發育成小植株的技術。幼胚培養要根據幼胚發育的不同階段，選用相應的培養基、營養條件和培養條件。遠緣雜交雜種胚拯救，使胚發育不全的植株獲得大量的后代

第七頁，共61頁。適當時期未成熟種子---消毒---解剖，剝取完整幼胚。2）培養基常用的培養基有Cox、

Rijven、Rappaport、Ranaswamy、Norstog以及MS、B5、White、Nitsch等培養基。碳源：蔗糖是幼胚培養基中最好的碳水化合物。

不同發育時期的胚要求不同的蔗糖濃度，往往胚齡越小，糖濃度要求越高，成熟胚，2%；而幼胚，4％甚至更高濃度的蔗糖。如曼陀羅的前心形期胚培養要求8%的蔗糖含量，而魚雷期要降到1.0%～0.5%。1)幼胚的分離

第八頁，共61頁。氨基酸：谷氨酰胺是促進離體胚生長最有效的氨基酸；

酪蛋白水解物（CH），不同物種的離體胚對CH的濃度要求不同

。

胚乳提取物。一般認為，八分成熟的椰乳對幼胚培養作用顯著，而完全成熟的椰乳作用不明顯。大麥胚乳提取物可以促進大麥胚的生長，玉米胚乳組織的提取物能促進離體玉米胚的生長。維生素，對發育初期的幼胚培養來說，則是必須的。以不加植物生長調節劑為宜。第九頁，共61頁。離體胚培養一般用固體培養基，大多數植物的離體胚在25～30℃生長良好。一般離體幼胚培養前期在散射光下培養，后期則要在2000Lx光強度左右培養。4）胚乳看護培養非常幼小的雜種胚，采用看護培養，即把發育不全的雜種胚埋在從正常發育的胚珠中取出的胚乳內，培養至幼苗期。3)培養

第十頁，共61頁。黃瓜遠緣雜種幼胎培養第十一頁，共61頁。（1）正常胚發育

離體培養的幼胚，在控制條件下，按照活體內的發育方式發育，最終發育成成熟胚，進而萌發形成小植株。這是幼胚培養胚拯救的正常發育模式。8.1.4離體幼胚培養的生長發育類型第十二頁，共61頁。植物胚胎發生過程：原胚－球形胚－心型胚－魚雷胚－子葉胚

球形胚前期心型胚前期魚雷胚球形胚第十三頁，共61頁。A、早熟萌發離體的幼胚在培養基上不僅能越過休眠期，而且還常常終止進行此后的胚胎發育，直接長成弱小的幼苗，而且這種幼苗只具有那些當胚離體時已具有的結構，這種未完成正常的胚胎發育過程而形成幼苗的現象叫做早熟萌發。

大麥未成熟胚離體培養中，CH能促進胚胎的繼續發育，抑制早熟萌發。培養基中高濃度的蔗糖（12～18%）同樣能抑制薺菜胚的早熟萌發。（2）異常胚發育

第十四頁，共61頁。在一些植物中，植株上發育的種子并無胚根、胚芽、和子葉的分化。蘭花種子球形胚是未分化的，在離體培養條件下，胚即增大形成原球莖，最后由原球莖分化出根和莖。B、胚不完全發育

兔絲子屬（Guscuta）植物的成熟胚有胚芽，但沒有胚根，在離體培養中很難誘導根的分化。第十五頁，共61頁。離體培養的植物成熟胚和幼胚組織，在外源激素的誘導下，可發生生物鐘的強行逆轉，經脫分化形成愈傷組織或胚性愈傷組織，并經再分化形成完整植株，如水稻、小麥等（圖8-1）。C.胚脫分化和再分化圖8-1小麥幼胚體細胞無性系（左）及其再生（右）第十六頁，共61頁。8.1.5影響離體幼胚培養的其它因素

幼胚的發育時期表8-1薺菜胚胎不同發育時期對營養的需求（引自Torrey，1964）胚發育時期胚長（μm）營養要求球形胚早期22-60小于40μm的胚對營養的需求不詳球形胚晚期61-80基本培養基（大量元素①+微量元素②+維生素③+2%蔗糖）+IAA（0.1mg/L）+KT（0.001mg/L）+硫胺腺嘌呤（0.001mg/L）心形胚期81-450僅基本培養基魚雷形胚期451-700大量元素①+維生素③+2%蔗糖拐杖形胚及成熟期700及更大大量元素①+2%蔗糖第十七頁，共61頁。胚柄的作用

在培養中胚柄的存在對于幼胚的存活是一個關鍵因素。表8-3紅花菜豆中胚柄對胚在離體條件下生長和發育的作用（引自Yeung等，1979）開始培養時期①（鮮重）處理鮮重±SE②（N）形成植株的胚數占（培養的胚數）百分比心形早期（0.87±0.02mg）只有胚本身3.19±0.52（10）41.5（89）胚連著胚柄8.91±1.16③

（10）88.4（95）胚與離體胚柄直接接觸6.22±0.78③（10）72.5（51）胚與加熱殺死的離體胚柄直接接觸4.10±0.43（5）37.0（43）胚距胚柄1cm－33.3（30）心形晚期（1.07±0.07mg）只有胚本身17.2±2.84（5）94.4（18）胚連著胚柄15.4±1.41（6）94.4（18）子葉形早期（3.92±0.19）只有胚本身20.3±2.5（7）100.0（18）胚連著胚柄24.4±2.75（11）100.0（19）第十八頁，共61頁。培養基的滲透壓在幼齡胚培養中，培養基的滲透壓是控制胚生長的重要因素。母體植株上的幼齡胚是在具有較高滲透壓的液體胚乳之中生長，即幼胚被一種高滲液體包圍著。郭仲琛（1978）研究表明，向日葵不同發育時期的胚對蔗糖的要求有較大的差異：幼胚長度1～1.1mm，要求蔗糖濃度17.5%，成熟胚要求蔗糖濃度只有0.5%。第十九頁，共61頁。（1）胚拯救

A.遠緣雜交雜種胚拯救：在遠緣雜交中，常因胚發育不良或胚乳不能正常發育以及胚與胚乳之間的不協調等原因，使雜種不育。如果將這類雜種的胚在適期取出，在人工合成的培養基上進行離體培養，則有可能使雜種胚繼續發育、生長，從而獲得雜種后代。8.1.6離體胚培養的應用第二十頁，共61頁。在普通小麥與玉米的雜交中，胚胎發生的最初幾次分裂期間，父本玉米的染色體被排除，結果形成了只含有一套母本染色體的單倍體小麥胚，但受精后3～12d胚乳逐漸解體，使胚得不到營養在穎果成熟前死亡。B.單倍體胚拯救圖8-2小麥×玉米12d雜種胚拯救第二十一頁，共61頁。果樹早熟育種中有一個棘手的問題，就是果實的早熟往往伴隨著產生沒有生活力的種子。如桃與櫻桃、杏等早熟品種，有很高經濟價值，但其胚在母體組織內往往不能正常發育，或胚生理成熟速度慢于果實成熟速度。因此，以這些品種作母本進行雜交時，種子往往沒有生活力，用一般方法很難得到雜種后代。利用離體胚培養就可以獲得有活力的雜交種子或幼苗。(2)核果類胚的后熟作用第二十二頁，共61頁。有些植物種子休眠期很長，如鳶尾（lris），一般種子成熟后要休眠2～3年才能萌發，在培養基上幾天內種子就能萌發。植物種子休眠的原因可能來自胚乳，因為離體胚如果帶著胚乳培養，胚的生長就受到抑制。具有休眠特性的種子，其胚離體培養時，在培養基中加入1～2mg/L的赤霉素，對打破種子休眠有顯著作用。(3)克服種子休眠第二十三頁，共61頁。蘭花、天麻等一些寄生植物或附生植物，有的胚只有6～7個細胞，在培養基上培養，胚就能生長發育成正常的植株。(4)

使胚發育不全的植株獲得大量的后代第二十四頁，共61頁。胚培養對于一些具有珠心胚的植物，如柑桔（Citrus）、芒果（Mangiferaindica）、紫萼等，具有特殊的意義。在柑桔雜交育種中一個問題是雜交往往得不到雜種胚，由于珠心胚的生長把合子胚擠到旁邊去。(5)用于某些植物雜種胚的繁殖第二十五頁，共61頁。

離體胚培養還可用于許多重大理論問題的研究，如胚胎發育過程，影響胚發育的各種因素，胚乳作用以及與胚發育有關的代謝和生理變化等。

(7)脫分化與再分化培養

以幼胚或成熟胚為外植體誘導愈傷組織，建立胚性無性系，不僅可以應用于研究體細胞胚胎發生、分離原生質體，還可應用于植物體細胞遺傳飾變和轉基因技術的研究等。(6)用于有關理論研究

第二十六頁，共61頁。植物胚珠結構側膜胎座（右）中軸胎座葫蘆科的下位子房第二十七頁，共61頁。8.2.1胚珠培養:

概念：在人工控制的條件下，對胚珠進行離體培養使其生長發育形成幼苗的技術。

1980年成功培養了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。子房多個胚珠第二十八頁，共61頁。

由于幼胚分離難度大，而胚珠分離則相對容易，在幼胚培養時常采用胚珠培養。

分為兩種類型：授粉胚珠培養 未授粉胚珠培養第二十九頁，共61頁。（1）胚珠培養的意義:防止雜種胚早期敗育，獲得雜種植株；也為拯救心型期胚或心型期以前的胚胎提供了新的途徑。授粉前胚珠培養，可作為試管受精的基礎；未授粉胚珠培養，能培養獲得單倍體植株，用于單倍體育種。第三十頁，共61頁。（2）胚珠培養方法: A、材料的選擇和滅菌： 未授粉胚珠：開花前1-6天，

授粉胚珠：授粉后1-120天不等，較晚時期有利于胚的發育。

滅菌：先對子房或外表組織消毒滅菌后，后取出胚珠培養。

辣椒子房第三十一頁，共61頁。 B、培養基多用Nitsch、White、MS等基本培養基

植物激素：細胞分裂素對授粉胚珠發育常有促進作用。

有機物：添加有機附加物（椰汁，水解酪蛋白）可以促進授粉胚珠的發育。

蔗糖濃度：4-10%。第三十二頁，共61頁。

（3）胎座和子房對胚珠培養的影響：帶有胎座或子房組織的胚珠相對較易培養。

（4）胚發育時期的影響：一般來說，合子或早期原胚期的胚珠較難剖取和培養，對培養基的成分要求也較嚴格。C、培養：

子房培養一般溫度為20～25℃。對光照要求不嚴，大多數植物子房培養早期在黑暗，弱光照條件下生長良好。第三十三頁，共61頁。、子房培養:

包括授粉子房和未授粉子房培養。

1949年和1951年最早在黃瓜、番茄、菜豆、草莓、煙草等植物上獲得成功。 授粉子房培養形成成熟果實和種子； 未授粉子房培養形成小的無籽果實。

授粉后3d的玉米子房，其中6顆發育成種子，其余產生愈傷組織。第三十四頁，共61頁。（1）子房培養的意義:獲得雜種植株；未授粉子房培養為試管受精提供技術基礎；未授粉子房培養能獲得獲得單倍體植株，用于單倍體育種。百合子房第三十五頁，共61頁。（2）子房培養的一般方法

材料制備：未傳粉子房培養時，選用開花前1～5d的花蕾。培養基：子房培養常用的培養基有MS、Whiter、Nitsch等。碳源主要是蔗糖和葡萄糖，濃度為2～5%。B族維生素、椰子乳和其它一些天然提取物對子房發育成果實或種子都有良好的促進作用。培養基中附加一定的赤霉素，生長素和細胞分裂素，可使離體子房發育的果實增大。培養：

子房培養一般溫度為20～25℃。對光照要求不嚴，大多數植物子房培養早期在黑暗，弱光照條件下生長良好。第三十六頁，共61頁。（3）附屬花器對子房培養的作用花被在果實和胚胎發育中成起著重要的作用。雙子葉植物各種花的萼片，對培養子房的生長顯示了有利的影響。（4）胚囊的發育時期對子房培養的作用從研究較多的大麥和水稻來看，在胚囊發育的各個時期都可以誘導，而以接近成熟的胚囊易于誘導成功。第三十七頁，共61頁。兩種途徑：直接成苗的發育途徑：在離體培養條件下，合子胚在胚珠內繼續發育至成熟，最終成熟胚在胚珠內萌發，形成小植株；脫分化和再分化途徑：離體子房或胚珠內的幼胚等組織脫分化，產生愈傷組織，經誘導后，愈傷組織形成體細胞胚或經器官發生，再形成小植株。離體子房和胚珠的發育第三十八頁，共61頁。Fig1

MorphologicalaspectsofsomaticembryogenesisinovarycultureofCocosnuciferaL.aCallusderivedfromovaryexplantsafter10weeksofcultureinitiation(bar=4

mm).bEmbryogenicstructures(Es)developedfromcalliaftersub-culturingintosomaticembryoinductionmedium(bar=5

mm).cDevelopingshootsingerminationmedium.dAcompleteplantletwithroots(Rt)椰子的子房培養第三十九頁，共61頁。通過雌配子體的離體培養，可以誘導胚囊細胞發育成單倍體胚。把這種通過未授粉胚珠或子房的離體培養進行單倍體胚胎發育的過程叫雌核發育（gynogenesis）。目前已有包括甜菜、小麥、水稻、煙草和玉米等多種農作物可以通過雌核發育途徑產生單倍體。8.2.4未授粉胚珠和子房培養

第四十頁，共61頁。愈傷組織和胚狀體形成（愈傷組織再分化；胚狀體直接成苗；胚狀體-愈傷組織-分化成苗。）試管苗的移栽

單倍體加倍

鑒定為單倍體的植株，利用秋水仙素加倍。在固體培養基中附加0.01％秋水仙素處理1～2d；在液體培養基中附加0.3％秋水仙素，在25℃下振蕩培養5～6h，或用0.2％～0.4％秋水仙堿液滴注移栽成活后試管苗生長點，在盆栽條件下處理3～4d。（1）離體未授粉胚珠和子房的發育第四十一頁，共61頁。Fig2

Plantregenerationinunfertilizedovulecultureofgentian（龍膽草）.aUnfertilizedovulesinanovary.bOvulesculturedon1/2NLNsolidmedium.cELSsemergedfromovulesafter50

daysofculture.dAmagnifiedELSincplate.e,fAplantletregeneratedfromELS.gAregeneratedplantofG.scabrastrain17-260growninsoil.hSomaticchromosomesofthehaploid(2n

=

x

=

13)regeneratedfromG.scabrastrain17-260.Thebarsina,d,e

=

500

μm,b,c,f

=

10

mm,g

=

50

mm,h

=

20

μm未受精子房內的胚珠第四十二頁，共61頁。植物未授粉胚珠或子房離體培養時，由于培養物既包含有孢子體組織，如珠心、珠被、子房壁等，又包含有配子體細胞，如卵細胞、助細胞、反足細胞等，因而在培養過程中，既可以產生單倍體愈傷組織或胚狀體，也可能產生二倍體愈傷組織或胚狀體，或二者同時產生。（2）單倍體植株的起源

對于某些雄核組織培養反應遲鈍或雄核敗育的物種來說，雌核發育途徑是一個重要的創制單倍體的手段。第四十三頁，共61頁。克服遠緣雜交中雜種早亡用于試管授粉

創造雌核發育的單倍體獲得大量的體細胞胚（葡萄的末受精胚珠培養中都得到了來源于珠心細胞的體細胞胚狀體。柑桔末受精胚珠來源的體細胞胚狀體，這種胚狀體可用于脫毒苗的快速繁殖。）繁育無核植物的珠心苗（通過末受精胚珠的離體培養，是獲得無核柑桔珠心苗的有效方法。

）8.2.5胚珠、子房培養的應用

第四十四頁，共61頁。柑橘上珠心苗的作用與營養系相比,實生群體常具有變異普遍、變異性狀多而且變異幅度大的特點。對多胚性的柑橘進行實生選種,有可能獲得:①利用有性系變異選育出優良的自然雜種,例如溫州蜜柑、葡萄柚、日本夏橙等都源出于自然雜種;②利用珠心系中發生的變異選育出新的優良品種、品系,例如四川的錦橙、先鋒橙;③利用珠心胚實生苗的生理復壯作用選育出該品種的新生系,例如美國從華盛頓臍橙、伏令夏橙、檸檬中選育出的新生系均比老系表現樹勢旺盛、豐產穩產、適應性增強,而又保持原品種的優良品質。第四十五頁，共61頁。植物離體授粉（pollinationinvitro）指在離體條件下對雌蕊的柱頭、帶胎座的胚珠和單個胚珠進行人工授粉和完成受精并形成種子過程；離體受精（fertilizationinvitro）指游離的植物精細胞和卵細胞融合形成合子，進一步培養使其形成完整植株的技術；離體授粉、受精也叫植物試管受精（test-tubefertilization）。合子培養是指對離體受精合子或分離的自然受精合子的離體培養，并使其進一步發育成植株的過程。8.3離體授粉、受精與合子培養

第四十六頁，共61頁。8.3.1植物離體授粉（1）離體授粉類型:離體柱頭授粉離體子房授粉離體胚珠授粉可以克服遠緣雜交中的不親和性，特別是離體子房授粉和離體胚珠授粉，能消除柱頭和花柱所造成的受精前障礙。第四十七頁，共61頁。（2）離體授粉的程序：1）確定開花、花藥開裂及授粉時間2）去雄后將花蕾套袋隔離3）制備無菌子房或胚珠4）制備無菌花粉5）胚珠或子房的試管內授粉第四十八頁，共61頁。（3）離體授粉的方法:花粉的收集：將要開花的幼穗或花蕾，經過常規消毒后在無菌條件下讓花藥自然開裂。子房或胚珠的剝離：開花前1d將雌穗或花蕾取下，經過表面常規消毒后，剝取完整子房或胚珠，接種。第四十九頁，共61頁。授粉：一是先將子房接入培養基，后用毛筆粘取剛撒落的新鮮花粉，涂在雌蕊的柱頭上。

另一種方法是在子房剝離后，可直接用子房的柱頭直接粘取花粉或用毛筆在管外子房柱頭上涂上花粉后再接入培養基中培養。培養基多為Nitsch（1951），在進行子房培養時所用的無機鹽，此外加上蔗糖和維生素。4%～5%。培養近乎黑暗中或散光條件下，25～28℃。第五十頁，共61頁。Fig.

1.

ReproductivestructuresofA.mearnsii.(a)Racemecomprisingmultipleinflorescences,(b)stigmasextendedovernumerousanthers,(c)diploid(2n)andtetraploid(4n)polyads,and(d)ananthercomprisedoftwolocules,eachcontainingfourpolyads.第五十一頁，共61頁。Fig.

2.

Invitro(laboratory)andinvivo(field)crosspollinations.(a)Inflorescencesattheyellowbudstageareplacedontoagar,(b)andallowedtoopenovernight.(c)Invitrocrosspollinations.(d)Inflorescencestobeusedaspollendonorsareplacedinadesiccatortohelpreleasethepolyadsfromtheanthers.(e)Baggedinflorescences(invivo)flowersreadytobecrossed.(f)Fixingofinflorescences48

hafterthesecondcrosspollination.第五十二頁，共61頁。Fig.

3.

ReproductiveorgansofA.mearnsii.(a)Stigmawithasinglepolyadattached.(b)Stigmawithmultiplepolyadsattached.(c)Pollentubesgerminatingoutofthepolyadanddownthestyle(fluorescentmicroscopy).(d)Pollentubesenteringtheovary.(e)Pollentubesenteringindividualovules.(f)Pistil.第五十三頁，共61頁。克服遠緣雜交不孕克服自交不親和性在誘導單倍體植株上的應用用于花粉生理和受精生理的研究（4）離體授粉、受精與合子培養的應用Hess（1974）等試圖通過花藥培養來得到錦花溝酸漿（MimulusLuteus）的單倍體，結果失敗了。但是，當他們將雌蕊