他克莫司通過抑制TH17治療咪哇莫特誘導的銀屑病小鼠模樊超;向華國;陳宏翔【摘要】目的研究他克莫司對銀屑病小鼠模型中Th17和相關細胞因子表達的影響?方法以咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導建立銀屑病樣的小鼠模型?采用組織病理分析研究銀屑病樣皮損炎癥狀況;流式細胞儀分析循環血中T細胞的水平;免疫組化法檢測細胞因子水平;Westernblot法分析體外分離的T細胞中Jak/Stat3的表達;實時定量RT-PCR檢測RORc-tmRNA的表達?結果他克莫司治療能改善IMQ誘導的角質形成細胞的增殖，減少銀屑病皮損處浸潤的CD3+T細胞數，減少循環血中CD4+和CD8+T細胞數，并降低循環血中炎性細胞因子(IL-17A、TNF-a、IL-6、IFN-y、IL-10、IL-4和IL-2)水平?此外，他克莫司可抑制Th17細胞分化和體外分離的T細胞分泌IL-17A,抑制Th17細胞中的Jak/Stat3信號通路，上調銀屑病皮損處細胞信號抑制因子1(SOCS1)的表達?結論他克莫司對銀屑病的治療作用可能是通過抑制Th17相關炎癥,減輕銀屑病樣皮損實現的.期刊名稱】《華中科技大學學報(醫學版)》年(卷),期】2016(045)005【總頁數】7頁(P484-489,495)【關時】銀屑病;他克莫司;輔助性T細胞17;咪喹莫特作者】樊超;向華國;陳宏翔【作者單位】深圳市福永人民醫院皮膚科,深圳518103;深圳市福永人民醫院皮膚科,深圳518103;華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚科,武漢430022【正文語種】中文【中圖分類】R758.63銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發病率較高和主要累及青壯年等特點而在皮膚科臨床備受重視。從病理學上看，角質形成細胞增殖和分化的異常，角質層中性粒細胞聚集所形成的Munr。微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤是銀屑病的三個最主要的特點［1］。三者之間存在非常復雜的相互作用和因果關系，且許多研究表明輔助T細胞17(Thelper17，Th17)在銀屑病皮損發展中起重要作用［2］。銀屑病患者皮損處Th17浸潤，外周血中Th17水平升高并與銀屑病皮損面積和嚴重指數(psoriasisareaandseverityindex，PASI)呈正相關［3］。Th17分泌的IL-17被認為是建立和維持銀屑病表型的關鍵細胞因子［4］°IL-17A通過結合角質形成細胞、樹突狀細胞、皮膚纖維母細胞和內皮細胞上的IL-17A受體而發揮作用［5］。目前治療銀屑病的藥物主要有：維A酸類藥物和蔥林、傳統免疫抑制劑(糖皮質激素和MTX等)以及新型免疫抑制劑(環抱素A、他克莫司、匹美克莫司、西洛莫司等)。新開發的靶向IL-17A及IL-17A受體抑制劑(Secukinumab、Ixekizumab和Brodalumab)已在臨床口期成功用于治療銀屑病、銀屑病關節炎和脊椎關節炎［6］。其中免疫抑制劑他克莫司(Tacrolimus,TAC)具有與細胞內FK506結合蛋白12(FK506-bindingprotein12,FKBP12)結合，不直接和鈣調神經磷酸酶(Calcineurin,CaN)作用的免疫抑制特性，它能抑制T細胞的活化和輔助T細胞依賴的B細胞增生，同時抑制細胞因子IL-2、IL-12及IFN-y等的表達，但目前尚未見到他克莫司對Th17影響的報道。在本研究中，我們用咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導的銀屑病樣小鼠模型研究他克莫司對Th17以及相關的細胞因子的影響，為他克莫司用于銀屑病治療提供實驗依據。1.1實驗動物分組及處理BALB/c小鼠，雄性,18-20g,8周齡，購自廣東省實驗動物中心，在無特異病原體條件下飼養。所有對動物的操作均按照醫院倫理學委員會制定的指導手冊進行。小鼠隨機分成3組：正常對照組(CTRL)、IMQ銀屑病模型組、TAC治療組，每組8只。后兩組參照文獻［7健立IMQ誘導的銀屑病模型，即在去毛的背部用含5%IMQ軟膏(劑量為62.5mg，國藥準字H20040283，聯邦制藥)，涂抹去毛的部位，1次/d，持續9d。TAC(Sigma公司，No.101095651)治療組在建模當天即以2mg/kg劑量腹腔給藥,1次/2d,直到小鼠處死前1d。皮損的嚴重程度采用修正的人評分系統PASI分級評價［8］，累計得分表明炎癥的嚴重性。第10天用斷頸法處死小鼠，收集皮損標本、脾、腹股溝淋巴結以及血清標本。外周血細胞因子的濃度用Th1/Th2/Th17CBA試劑盒(BDPharmingen,USA)檢測，操作按試劑盒說明書進行。1.2體外Th17細胞的誘導分化取小鼠脾細胞，制成單細胞懸液，小鼠初始CD4+T細胞用免疫磁珠分離試劑盒陽性選擇純化，流式細胞術檢測其純度可達到95%。將CD4+T細胞以2x106細胞/孔接種于結合有抗CD3抗體(5pg/mL,BDPharmingen,USA)和可溶性抗CD28抗體(2pg/mL,BDPharmingen,USA)及15%胎牛血清(Hyclone,Carlsbad,CA)的RPMI1640培養液(Hyclone,Carlsbad,CA)。純化的CD4+T細胞在含5ng/mLTGF-p、20ng/mLIL-6、10ng/mLIL-邛和15ng/mLIL-23的培養體系中培養5d后，采用流式細胞儀檢測Th17的分化［9］。流式細胞術檢測細胞用anti-CD3-APC、anti-CD8-PE和anti-CD4-FITC抗體(BDPharmingen,USA)染色。IL-17A檢測前，細胞用白細胞活化混合物和BDGolgiPlug孵育6h，再用抗IL-17A-PE抗體(BDPharmingen，USA)染色，流式細胞儀(BeckmanCoulter)分析檢測。免疫組化檢測從小鼠背部皮損處取的皮膚樣品用10%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，厚度4~5pm,采用免疫組化SP法檢測。以兔抗鼠CD3、PCNA(Abcam,USA)為一抗(1:500稀釋)，用增敏二氨基聯苯胺(DAB)顯色液染色(南京金斯瑞生物公司)，蘇木精復染，顯微鏡(Olympus,Japan)下觀察。對外皮蛋白的觀察采用TRITC-Involucrin抗體染色及DAPI染色。用TRITC-IL17A抗體和CF647-PCNA抗體對組織切片染色，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強度，以觀察皮損組織中IL-17A和細胞增殖的相關性。Westernblot檢測裂解液RIPA(Roche公司)裂解皮膚樣品，然后4°C16000g離心10min，收集上清液，BCA試劑盒(Beyotime)檢測總蛋白量。20pg總蛋白用10%SDS蛋白電泳，轉膜到0.22pmPVDF膜上。膜以含5%脫脂牛奶的TBST(10mmo/LTri-HCl,150mmo/LNaCl,0.25%Tween-20,pH7.5)室溫下封閉1h，然后加入一抗［Stat3、pStat3、Jak3和pJak3單抗和細胞因子信號抑制因子1(SOCS1)兔抗鼠多抗，SantaCruz公司］孵育過夜。TBST洗滌后，膜在室溫下以羊抗兔IgG-HRP二抗(KPL公司)孵育1h。ECL顯色。卜actin作為對照。1.6實時定量RT-PCR檢測用Trizol(Invitrogen,USA)試劑盒從皮損提取總RNA,NucleoSpinRNA試劑盒(Macherey-Nagel,Germany)純化。用AffinityScript多個溫度cDNA合成試劑盒(AgilentTechnologies,USA)和特異引物產生互補cDNA，實時定量RT-PCR檢測基因的相對表達水平（Roche,USA）。目標mRNA的表達量以與Actin表達量的相對倍數表示。1.7統計學分析數據以±s表示，采用SPSS17.0統計軟件進行分析，兩組間均數比較采用t檢驗，以PvO.05為差異具有統計學意義。2.1他克莫司可減輕銀屑病皮損的病理改變及減少角質形成細胞的異常增殖和分化5%IMQ誘導后，IMQ組小鼠皮損處出現典型紅斑、鱗屑和皮膚增厚等典型的銀屑病外觀（圖1），而TAC組的小鼠皮膚光滑、呈淺色紅斑、鱗屑較少，PASI分級得分明顯降低（表1）°IMQ組皮損樣本以蘇木精-伊紅染色顯示上皮增生，棘層肥厚，表皮脊延長，真皮上層血管周圍炎癥細胞浸潤，為銀屑病的典型表型，使用他克莫司（TAC組）可顯著減小表皮層厚度，減輕銀屑病樣病變（圖2）。細胞增殖的標志蛋白PCNA在增殖的細胞中表達，特別是基底細胞。免疫組化檢測顯示，TAC組小鼠皮損中PCNA表達較IMQ組減少，表明他克莫司可減少IMQ誘導的角質形成細胞的增殖（圖2）。在IMQ組整個皮損上皮層中都觀察到上皮細胞表達角化形成細胞的標志蛋白——外皮蛋白，而TAC組小鼠的外皮蛋白表達減少且僅限于上層（圖2），表明他克莫司能有效改善IMQ誘導的角質細胞分化。2.2他克莫司抑制T細胞介導的炎性細胞浸潤及炎性因子表達在IMQ誘導的皮損中用免疫組化法觀察到CD3+細胞的浸潤，而TAC組則明顯減少（圖3A）OIMQ處理小鼠腹股溝淋巴結和脾變大，流式細胞術檢測顯示CD4+和CD8+細胞數增加，與之相比，TAC組小鼠淋巴結和脾的重量減輕，淋巴結和脾中的CD4+/CD8+失衡有所改善（圖3B、3C）。同時,IMQ上調小鼠外周血銀屑病相關細胞因子水平，激活了系統免疫，Th1/Th2/Th17CBA試劑盒檢測外周血中IL-17A、IL-10、IL-4、IL-2、IL-6、IFN-y和TNF-a的水平分別提高了5、15、9、&6、6和3倍。而TAC組小鼠外周血中上述細胞因子水平均顯著降低。2.3他克莫司抑制Th17分化和IL-17A分泌為了研究他克莫司如何影響Th17的細胞功能，我們首先用CCK8檢測試劑盒(DojindoLaboratory，Japan)分析其是否影響體外分離的Th17細胞的活性，結果表明他克莫司抑制Th17的增殖，而IMQ促進Th17的增殖。為了研究他克莫司對Th17細胞分化的影響，我們用流式細胞儀和基于磁珠的免疫實驗分別檢測IL-17A+細胞數和IL-17A的分泌，結果發現他克莫司抑制Th17細胞分化(圖4)和IL-17A分泌。IMQ組分泌IL-17A的量為(510±35)pg/mL，而TAC組則為(290±23)pg/mL，兩者差異有統計學意義(Pv0.05)。在模型小鼠中，IL-17A主要表達在上皮角質形成細胞和真皮層，但在他克莫司治療的小鼠浸潤到真皮的IL-17A+細胞減少，他克莫司抑制角質形成細胞增殖的同時也抑制IL-17A的表達(圖5)。并且他克莫司抑制Th17特異的轉錄因子孤兒核受體c-t(orphannuclearreceptorc-t,RORc-t)mRNA的表達(TAC組為1.32±0.18,IMQ組為1.56±0.34,PvO.05)。以上結果表明他克莫司能直接抑制Th17細胞的分化和功能，進而抑制角質形成細胞的增殖。2.4他克莫司對銀屑病模型鼠Jak/Stat3信號通路的影響Stat3是角質形成細胞和Th17細胞分化的重要調節因子［4,10］。為了研究他克莫司是否通過抑制銀屑病中Stat3信號影響Th17細胞，我們采用Westernblot檢測Stat3信號通路相關因子的表達水平。與對照組相比，在IMQ誘導的皮損中Stat3和Jak3磷酸化增加。而與IMQ組相比，這些蛋白在TAC組小鼠中磷酸化和非磷酸化水平均下降。有趣的是，在他克莫司處理的小鼠中SOCS1的表達較IMQ組增加(圖6)。這些結果表明他克莫司可能通過抑制或者干擾Stat3信號途徑的分子機制抑制Th17細胞活性。他克莫司是一種鈣調神經磷酸酶的免疫抑制劑，常常用于器官移植的抗排斥反應，也用于如脂溢性皮炎［11］、狼瘡腎炎［12］等疾病的治療，目前在銀屑病的治療中也取得較好效果，但機制尚不完全明確。用5%IMQ(—種Toll樣受體7/8配體和潛在的免疫激活劑)反復涂抹去毛的小鼠背部能誘導和加重炎癥性皮損，已被廣泛用于建立具有皮膚炎癥特征的銀屑病模型［8］。該模型能模擬人類銀屑病表現，包括紅斑、過度角化、鱗屑、表皮中性粒細胞的微小膿腫和真皮T細胞浸潤。本研究應用IMQ誘導的銀屑病樣小鼠模型探討他克莫司對Th17以及相關的細胞因子的影響，為其用于銀屑病治療提供實驗依據。在本研究中，我們從表觀、組織、細胞和分子層面研究了他克莫司對IMQ誘導的銀屑病小鼠模型的影響。研究發現他克莫司顯著改善角質形成細胞的增殖和炎性細胞浸潤，減少CD3+細胞浸潤到銀屑病皮損處，并顯著減少循環血中CD4+和CD8+T細胞以及炎性細胞因子的水平。在體外，他克莫司抑制Th17細胞分化、IL-17A的分泌，抑制Jak/Stat3信號，上調SOCS1的表達(Pv0.05)。因此，他克莫司代表一種以干擾Th17細胞功能的拮抗銀屑病炎癥的藥物。盡管Th1細胞是銀屑病的主要T細胞類型，但目前認為Th17/IL-23在銀屑病免疫致病中起關鍵作用［13］。Th17細胞與各種自身和炎癥性疾病，如類風濕關節炎(RA)、哮喘、實驗自身免疫腦膜炎(EAE)相關°IL-23是初始CD4+T細胞在TGF-P和IL-6誘導下分化出的、維持致病Th17的關鍵上游細胞因子。DCs和巨噬細胞產生的IL-23結合到激活的Th17細胞上的IL-23受體，加強RORc-t的表達。RORc-t進一步和IL-6相互作用，共同誘導Stat3信號刺激效應細胞因子IL-17AIL-17F、IL-21和IL-22的產生。通過CCR6-CCL20化學趨化因子軸招募Th17到炎癥部位,Th17通過激活不同細胞信號途徑的細胞因子(例如IL-17、IL-21、IL-22)而發揮作用［14］。在IMQ處理的小鼠脾臟中檢測到DCs(pDCs)和T細胞比例更高，CD4+IL-17+T細胞也上調，而CD4+IFN-Y+T細胞的數量沒有顯著變化。他克莫司減少皮損和外周血中的IL-17A的表達，直接減少CD4+IL-17A+細胞的百分比，抑制IL-17A的表達，表明他克莫司不僅能抑制Th17細胞分化而且抑制Th17細胞功能，進而抑制Th17相關的炎癥反應。需要注意的是細胞毒T細胞(CD8+)也產生IL-17［15］，本研究發現他克莫司處理的小鼠脾臟和淋巴結中CD8+細胞數也發生改變，因而需要進一步評估他克莫司對細胞毒T細胞IL-17水平的特異影響。Th17細胞和其它炎癥細胞分泌前炎癥細胞因子TNF-a,該細胞因子被認為是銀屑病治療的重要靶點［16］。在本研究中，他克莫司抑制IMQ誘導的小鼠銀屑病模型TNF-a的表達，而且減少Th1相關細胞因子IFN-y的表達。此外，他克莫司抑制IMQ誘導的IL-10表達°Scot帖等［17］也報道他克莫司減少Tregs產生IL-10,抑制LPS介導的IL-10基因表達［18］°IL-4具有平衡Th1/Th2的作用,IL-10表達伴隨前炎癥細胞因子IL-4、TNF-a的分泌增加，他克莫司抑制IL-17A和IL-10的表達，破壞了銀屑病樣小鼠模型的Th17/Treg平衡，從而有助于改善小鼠銀屑病樣皮損癥狀。很多研究已表明在銀屑病和IMQ誘導的銀屑病樣的皮損中Stat3表達上調［19］。Jak1、2與角質形成細胞的增殖、激活和凋亡有關，而Jak3則主要激活T細胞及其增殖［20］。RORc-t，是Stat3途徑的下游效應分子，涉及Th17細胞的激活。我們發現他克莫司抑制Stat3和Jak3的磷酸化，減少RORc-t的表達，提示他克莫司可通過Jak3/Stat3途徑抑制Th17。此外，他克莫司上調SOCS1的表達，表明他克莫司直接影響IMQ誘導的銀屑病樣炎癥的Stat3信號的多個過程。總之，我們證明了他克莫司可通過減少炎癥細胞分化和細胞因子分泌，特別是直接抑制Th17細胞的分化和IL-17A的分泌而減輕IMQ誘導的銀屑病樣炎癥。本研究表明他克莫司能作為抑制銀屑病局部炎癥的藥物。相關文獻】NestleFO，KaplanDH，BarkerJ.Psoriasis[J].NEnglJMed，2009，361(5)：496-509.MartinDA，TowneJE，KricorianG，etal.TheemergingroleofIL-17inthepathogenesisofpsoriasis：preclinicalandclinicalndings[J].JInvestigDermatol，2013，133(1)：17-26.AfzaliB，LombardiG，LechlerRI，etal.TheroleofThelper17(Th17)andregulatoryTcells(Treg)inhumanorgantransplantationandautoimmunedisease[J].ClinExpImmunol，2007，148(1)：32-46.RebeC，VegranF，BergerH，etal.STAT3activation：akeyfactorintumorimmunoescape[J].JAKSTAT，2013，2(1)：e23010.LyndeCW，PoulinY，VenderR，etal.Interleukin17A：towardanewunderstandingofpsoriasispathogenesis[J].JAmAcadDermatol，2014，71(1)：141-150.ChandrakumarSF，YeungJ.Interleukin-17antagonistsinthetreatmentofpsoriasis[J].JCutanMedSurg，2015，19(2)：109-114.[7]QinS，WenJ，BaiXC，etal.Endogenousn-3polyunsaturatedfattyacidsprotectagainstimiquimod-inducedpsoriasis-likeinflammationviatheIL-17/IL-23axis[J].MolMedRep，2014，9(6)：2097-2104.vanderFitsL，MouritsS，VoermanJS，etal.Imiquimod-inducedpsoriasis-likeskininflammationinmiceismediatedviatheIL-23/IL-17axis[J].JImmunol，2009，182(9)：5836-5845.XuY，LiZ，YinY，etal.GhrelininhibitsthedifferentiationofThelper17cellsthroughmTOR/STAT3signalingpathway[J].PLoSOne，2015，10(2)：e0117081.SimanskiM,RademacherF,Schr6derL,etal.IL-17AandIFN-gammasynergisticallyinduceRNase7expressionviaSTAT3inprimarykeratinocytes[J].PLoSOne，2013，8(3)：e59531.KimHO，YangYS，KoHC，etal.Maintenancetherapyoffacialseborrheicdermatitiswith0.1%tacrolimusointment[J].AnnDermatol，2015，27(5)：523-530.AbeY，ShimaT，IzumiY，etal.Successfulmanagementoflupusnephritiswithhightitersofmyeloperoxidaseanti-neutrophilcytoplasmicantibodiesusingtacrolimus[J].InternMed，2015，54(22)：2929-2933.HardenJL，KruegerJG，BowcockAM.Theimmunogeneticsofpsoriasis：acomprehensivereview[J].JAutoimmun，2015，64：66-73.MarinoniB，CeribelliA，MassarottiMS，etal.TheTh17axisinpsoriaticdisease：pathogeneticandtherapeuticimplications[J].AutoImmunHighlights，2014，5(1)：9-19.WonTJ，LeeYJ，HyungKE，etal.SUMO2overexpressionenhancesthegeneration