細胞工程制藥技術詳解演示文稿當前1頁，總共77頁。（優選）細胞工程制藥技術當前2頁，總共77頁。第二節細胞融合技術當前3頁，總共77頁。（一）細胞融合（cellfusion)，又稱體細胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程。一、細胞融合技術的建立和發展當前4頁，總共77頁。Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內自發地融合產生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發現了細胞合并現象。1958年日本學者岡田（Okada）發現仙臺病毒具有觸發動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現了電融合技術。（二）細胞融合研究進展當前5頁，總共77頁。生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細胞融合成功的例子當前6頁，總共77頁。植物融合細胞成長狀態對比,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環境下融合的細胞

當前7頁，總共77頁。動物細胞融合實驗使用的小白鼠當前8頁，總共77頁。細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發生重組，從而產生新的核外遺傳系統。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。當前9頁，總共77頁。二、動物細胞融合和體細胞雜交植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖當前10頁，總共77頁。顯微鏡下細胞融合過程當前11頁，總共77頁。融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解當前12頁，總共77頁。1、仙臺病毒法仙臺病毒誘導細胞融合經四個階段：①兩種細胞在一起培養，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細胞膜發生反應，細胞膜受到破環，此時需要Ca2+和Mg2+，最適pH為8.0一8.2；②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細胞，仍需ATP。（一）促進細胞融合的方法當前13頁，總共77頁。病毒促使細胞融合的主要步驟如下：兩個原生質體或細胞在病毒黏結作用下彼此靠近；通過病毒與原生質體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質互相滲透；兩個原生質體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。當前14頁，總共77頁。用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖

當前15頁，總共77頁。

優點是易得，用法簡單，融合效果穩定。聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產生最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。2、聚乙二醇（PEG）法當前16頁，總共77頁。聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程當前17頁，總共77頁。PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發生融合成為可能。

PEG誘導融合的特點：其優點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。

當前18頁，總共77頁。聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養液至5ml，37℃的CO2培養箱中培養。（6）6—24小時后，換成選擇培養液篩選雜交細胞。當前19頁，總共77頁。當前20頁，總共77頁。3、電融合法電融合法是80年代出現的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發生改變，使異種細胞粘合并發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優點：融合率高、重復性強、對細胞傷害小；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。當前21頁，總共77頁。電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。

當前22頁，總共77頁。電融合誘導法原理示意圖當前23頁，總共77頁。（二）雜交瘤技術當前24頁，總共77頁。當前25頁，總共77頁。當前26頁，總共77頁。只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。當前27頁，總共77頁。單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology

）。當前28頁，總共77頁。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

當前29頁，總共77頁。雜交瘤技術的基本原理當前30頁，總共77頁。雜交瘤細胞的制備1、骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）當前31頁，總共77頁。HAT培養基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）當前32頁，總共77頁。2、免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。當前33頁，總共77頁。3、脾細胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網或尼龍紗網中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養液沖洗，令細胞通過紗網，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養液，反復抽吸數次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養液：輕輕吹打數次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉／分)計數、備用。當前34頁，總共77頁。4、細胞準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養液洗3次(37℃)，計數活力細胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養液洗3次(37℃)，并計細胞數和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。當前35頁，總共77頁。5、細胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內加完，同時并不斷輕微轉動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉動離心管中加1ml無血清培養液，60秒鐘內加完；(3)于5分鐘內慢慢加完20ml無血清培養液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉／分，8分鐘)，去上清，用完全培養液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50l

；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養，24小時后更換成HAT選擇性培養掖。當前36頁，總共77頁。6、融合后細胞培養(1)融合后7—10天用HAT培養液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養液半量換液，或仍用HAT培養液；(3)2—3周后出現雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至1／3孔時，應進行抗體檢測。當前37頁，總共77頁。HAT培養基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）當前38頁，總共77頁。7、抗體檢測免疫熒光試驗放射免疫試驗(RIA)聯免疫吸附試驗(ELISA)當前39頁，總共77頁。8、單克隆抗體的大量制備體內法培養法當前40頁，總共77頁。單克隆抗體的應用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地用于臨床醫學的疾病診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術可以生產各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰勝癌癥十分有望的潛在技術。單克隆抗體技術還可廣泛用于各種基礎醫學研究，從而推動現代醫學的不斷發展。

當前41頁，總共77頁。人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本。現有的細胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產生水平低，而且細胞不穩定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難，因為對人來說，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水達到這一目的，但是人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。當前42頁，總共77頁。當前43頁，總共77頁。單克隆抗體工業化生產及應用單克隆抗體的生產包括細胞培養、提純和制劑等工藝。作為治療藥品應用的單克隆抗體則必須采用生物反應器，大規模培養雜交瘤細胞。單克隆抗體藥物：1986年，美國FDA批準了第一個單克隆抗體藥物上市，距今已經整整20多年了。截止到現在，全世界共有21個治療用抗體藥物被批準上市，實現200億美元的銷售額，在國際，也在國內形成了抗體藥物開發熱潮。

當前44頁，總共77頁。單克隆抗體工業化生產及應用

單抗藥主要用于癌癥和免疫性疾病的治療。現在有5大單抗藥物占據了80%的市場份額，其中羅氏制藥Roche和基因泰克（NYSE:

DNA）聯合開發上市的單抗藥物有3個，分別為Avastin、Herceptin和Rituxan；另外還有雅培公司（NYSE:

ABT）的Humira和強生公司（NYSE:

JNJ）的Remicade。5大單抗藥主宰市場的趨勢到2012年不會發生太大的變化，仍將占有70%的市場。至2012年，Biogen（Nasdaq:

BIIB）、安進（Nasdaq:

AMGN）和UCB（布魯塞爾證券交易市場：UCB.BR）也將有單抗藥物上市。當前45頁，總共77頁。當前46頁，總共77頁。當前47頁，總共77頁。當前48頁，總共77頁。當前49頁，總共77頁。三、植物原生質體融合和體細胞雜交植物原生質培養和細胞融合可用產生遠緣雜種；是目前植物細胞及基因工程的核心技術。當前50頁，總共77頁。植物原生質體培養通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，即為原生質體(Protoplast)。游離的原生質體像正常的植物細胞那樣具有全能性，在一定條件下培養可以重新再生出完整植株。當前51頁，總共77頁。

自1970年首次獲得煙草原生質體再生植株成功以來，通過原生質體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國首先報道。原生質體培養包括原生質體的分離、培養、植株再生等過程。當前52頁，總共77頁。(一)原生質體的制備：1、材料來源與預處理：（1）材料來源：可以用各種組織和器官，但多應用葉片、愈傷組織及懸浮培養細胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

當前53頁，總共77頁。（2）預處理：

A.預質壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時，再于28—34℃保溫，或將材料置于與酶液中糖濃度相同的溶液中預培養1h左右，再浸于酶液中消化即可達到質壁分離目的；

B.預培養:將除去下表皮的葉片于誘導愈傷組織培養基上培養7天，再用酶消化去壁，所得原生質體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長5—7個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質體分離；

E.低溫處理:夏季應用的實驗材料其萌動種子應于4℃過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質體培養效果較佳。當前54頁，總共77頁。2.制備原生質體的酶類：高等植物細胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質及蛋白質。細胞生長的不同階段及不同物種的細胞壁組成與結構不同，木質化及次生加厚的細胞壁不被酶消化，故選擇材料和消化細胞壁的酶類是制備原生質體關鍵。當前55頁，總共77頁。常用的酶類有：A.纖維素酶，如OnozukaR—10及RS，國內常用的為EA3—867，其中含少量果膠酶；B.果膠酶，如MacerozymeR—10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2％，作用時間長有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細胞為0．05％；C.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D.半纖維素酶，如RhozymeHP150，用于懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質體的分離;E蝸牛酶，主要用于體細胞原生質體分離。當前56頁，總共77頁。酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩定劑，以維持原生質體完整性。酶液pH值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時pH5.4-pH5.6為宜，降至4．8以下則原生質體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。當前57頁，總共77頁。3．原生質體分離及純化（1）分離：原生質體分離有機械法及酶消化法，前者產量極低而不多用、后者又分一步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質體。當前58頁，總共77頁。（2）純化

A.沉降法:原生質體混合物經微孔過濾后，低速（150g）離心5min,沉淀再用與酶液具相同糖濃度溶液反復洗3-4次，后用培養液洗滌備用；B.飄浮法:離心法純化的原生質體若含較多碎片及少量老細胞時．可用20％蔗糖離心，原生質體浮于液面．碎片及老細胞沉降而得以純化，純度高，但產量低；

C.不連續梯度離心法：將原生質粗提液置于不連續濃度梯度的溶液中，經離心后分離不同比重的原生質體。當前59頁，總共77頁。

4．原生質體活力測定

純化的原生質體需經活力測定后方可用于培養。（1）根據形態特征判斷其活力：原生質體呈綠色（若來源于葉片）及圓而鼓者為活原生質體。（2）熒光染料活體染色法：熒光素染料可自由透過細胞膜，在細胞內被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細胞膜而滯留于細胞內，在熒光顯微鏡下根據熒光強度即可判斷原生質體死活。（3）酚藏花紅染色法：活原生質體能吸收呈紅色，無活性的則不能吸收而無色。當前60頁，總共77頁。（二）原生質體培養：1.培養方法：（1）固體培養：平板培養法，1.2%瓊脂。（2）液體培養：A.淺層培養法:其過程是將1mL原生質體懸液置于直徑4cm培養皿或25mL三角瓶中使成薄層后于培養箱中培養．初期振搖1—2次，防止粘壁；B.固液結合培養法：在混好原生質體的固體培養基表面加一層相同成分的液體培養基進行培養。效果較好。當前61頁，總共77頁。2.培養條件：密度：平板培養103~104個/ml,液體培養104~105個/ml溫度：多數為25-28oC,少數16~37oC光照：500lx,18h或2800lx連續光照多數要求黑暗或弱光當前62頁，總共77頁。3.細胞壁再生及細胞分裂：

l-3天即再生新細胞壁，表現為體積增加、膨大，再由圓變橢圓。可用質壁分離法證實。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經前者染色，有細胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍色熒光。經后者染色，有細胞壁者發射綠色熒光。在原生質培養過程中，胞質增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內含物分散于泡質中或圍繞于細胞核周圍．常在1一2周內發生第一次分裂。不同細胞分裂頻率不同。當前63頁，總共77頁。4、愈傷組織或胚狀體形成

原生質體再生的細胞一旦開始分裂，就可能繼續生長：A形成細胞團，發育成愈傷組織；B.形成胚狀體，再產生植株；C.形成愈傷組織，再形成胚狀體。隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規細胞和組織培養相同，故培養3—4周需添加含一定量低滲穩定劑的新培養基，以滿足細胞的營養，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。當前64頁，總共77頁。

5.植株再生

大多經愈傷組織誘導分化再生為完整植株。當愈傷組織達到1—2mm時，轉移至分化培養基上誘導器官分化。分化培養基與原生質體培養基差別在于：(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩定劑；(2)與原生質體培養基相反，細胞分裂素濃度高于生長素;(3)在誘導器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強。誘導器官分化的溫度與原生質體培養基本相同。

當前65頁，總共77頁。（三）原生質體培養的目的：

1、利用原生質體不具細胞壁的特性可以進行細胞器移植和外源物的攝取，原生質體之間可以進行融合而產生雜種細胞(即體細胞雜交）。2、是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質對植物原生質體進行改造和轉化，然后誘導分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究細胞生物學、分子生物學、體細胞無性系變異和植物病理學研究的有用工具。當前66頁，總共77頁。A-E,培養的歐當歸(LevisticumofficinaleKoch))原生