核酸分子雜交技術與應用2/24/20231核酸分子雜交：來源相同或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在合適的條件下通過堿基互補形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交(molecularhybridization)。核酸分子雜交技術是目前生物化學和分子生物學探討中應用最廣泛的技術之一，也是臨床分子檢驗的重要技術。2/24/202322/24/20233核酸分子雜交的基本原理與分類核酸分子雜交的基本原理：DNA分子由兩條互補的單鏈形成的雙螺旋結構。維持結構穩(wěn)定的力有三：1、兩條鏈間互補堿基的氫鍵；2、堿基間的積累力(范德華力)；3、中和鏈內的負電荷。變性：在理化因素作用下，雙螺旋結構間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開形成單鏈的過程。2/24/202342/24/20235變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時，從起先變性到變性結束，是在一個很窄的溫度范圍內進行的，當變性進行到核酸分子解鏈一半時的溫度，稱變性溫度，也稱融解溫度。2/24/202362/24/20237影響變性的因素：1、堿基組成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，兩者之間的關系可以用閱歷公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3為無G＋C存在時的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm約上升0.41oC。2/24/20238影響變性的因素：2、溶液的離子強度DNA鏈骨架上的磷酸基團帶有較多的負電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩(wěn)定因素之一。在無鹽的水中，DNA在室溫下就會變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團的負電荷，使DNA穩(wěn)定性增加，Tm值上升。2/24/20239影響變性的因素：3、pH值pH值在5～9范圍內，Tm值變更不明顯。在高pH值下，可使堿基失去形成氫鍵的實力。當pH大于11.3時全部氫鍵均被破壞，DNA完全變性。4、變性劑可以干擾堿基積累力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC。2/24/202310復性：變性核酸分子在合適的條件下重新形成雙螺旋結構的過程稱復性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25oC的溫度下維持相當長的一段時間，則可使之復原到自然的雙鏈結構狀態(tài)。復性的速度受以下因素影響：1、DNA濃度DNA濃度越大復性速度越快；2、DNA的分子質量大分子質量的DNA擴散速度慢，復性速度慢；2/24/2023113、溫度溫度過高，有利于DNA變性而不利于復性；4、離子強度5、DNA分子的困難性DNA總量確定時，基因組越困難，其中特定依次的拷貝數(shù)越少，互補依次的濃度越低，復性反應速度越慢。2/24/202312分子雜交技術就是利用了核酸分子的變性與復性原理，使變性的核酸分子與檢測核酸分子在堿基互補的條件下形成雜交雙螺旋的過程。探針(probe)：在核酸變性試驗中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開來所運用的帶有標記的單鏈核酸分子。2/24/202313核酸分子雜交分類：以雜交分子分類：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交。以探針標記分類：以雜交介質分類：液相雜交與固相雜交。液相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術。2/24/202314液相雜交(solutionhybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術。待測分子與探針在雜交液中完成反應，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開后用液閃儀進行計數(shù)或利用紫外吸取特性變更分析雜交結果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶疼惜分析法、核酸酶S1疼惜分析法。2/24/202315RNA酶疼惜分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到疼惜的特點，用體外轉錄合成的放射性標記的RNA探針與待檢mRNA進行液相雜交，使互補序列RNA探針和待測RNA形成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結果。2/24/202316RNA酶疼惜分析法的應用：mRNA定量mRNA未端定位內含子在相應基因中的位置2/24/202317RNA酶疼惜分析法的主要步驟：1、制備待測RNA從細胞或組織中提取總RNA或mRNA；2、RNA探針標記接受體外轉錄的方法制備和標記探針；3、分子雜交：將待測樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級結構；4、RNA酶消化單鏈RNA；5、電泳分析雜交分子。2/24/202318核酸酶S1疼惜分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理與RNA酶疼惜分析法的原理類似，核酸酶S1能專一性地降解單鏈DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。接受M13體系克隆和擴增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過程中加入核素標記物，即可合成出高放射性的單鏈DNA探針。將探針與待測RNA樣品在液相中進行雜交，形成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進行分析。2/24/202319核酸酶S1疼惜分析法可用于基因轉錄起始位點分析及內含子剪切位點分析。液相雜交的優(yōu)點：設備簡潔、操作便利。液相雜交的缺點：過量未雜交探針難以除去，產生高背景；同源與異源核酸均可形成雙螺旋結構使得雜交結果難以分析。2/24/202320固相雜交：將欲分析的樣品先結合在固相支持物上，再與探針進行雜交反應。雜交結果可用儀器或放射自顯影技術分析雜交結果。固相支持物的選擇：可用于固相支持物的種類很多。一種良好的固相支持物應具備以下幾個特性：1、具有較強的結合核酸分子的實力；2、與核酸分子結合后不影響與探針的結合；3、與核酸分子的結合穩(wěn)定堅實；4、非特異性吸附少；5、具有良好的機械性能便于操作。2/24/202321硝酸纖維素濾膜優(yōu)點：具有較強的吸附單鏈DNA或RNA的實力，特殊是在高鹽濃度下，其結合實力可達80～100μg/cm2。吸附的單鏈核經真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而結合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號本底低的特點廣泛用于各種雜交試驗。缺點：與單鏈核酸的結合實力不特殊堅實，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(特殊是在高溫下)DNA會出現(xiàn)脫膜現(xiàn)象，硝酸纖維素膜質地較脆使操作不便。2/24/202322尼龍膜：是目前較志向的一種核酸固相支持物，它有多種類型，不同類型的膜上網孔大小不同。經正電荷基團修飾后與核酸的結合力更強。尼龍膜與核酸的結合實力為350～500μg/cm2。經烘烤或紫外線照射后，特殊是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團相互交聯(lián)，使結合更加堅實。2/24/202323菌落雜交：主要用于克隆篩選的固相雜交。2/24/202324Southern印跡雜交：Northern印跡雜交：基本原理與Southern相同，但目的被分析樣品為RNA。選擇的變性劑為甲醛。斑點雜交及狹縫雜交：原位雜交(insituhybridization)：基因芯片技術：2/24/202325雜交過程預雜交：為了削減非特異性雜交反應，在雜交前應進行預雜交，將非特異性DNA位點封閉。常用的封閉物有兩類：其一是變性的非特異性DNA，大多接受鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封閉DNA上的非特異位點；封閉膜上與非特異性DNA結合位點。2/24/202326預雜交液的配制6×SSC（1×SSC為0.15mol/LNaCl和o.o15mol/L檸檬酸）5×Denhardt’s溶液0.5％SDS100μg/ml變性的鮭魚精子DNA50％甲酰胺(可不用)50×Denhardt：聚蔗糖(Ficoll400)5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(組分V)5g加水至500ml，分裝后保存于－20oC2/24/20232710mg/ml鮭魚精DNA：超聲法或用注射器通過6號針頭反復抽打將DNA打斷。煮沸后置－20oC保存，運用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中。甲酰胺：運用前用DowexXG8混合床陰陽離子交換樹脂處理1小時，小量分裝后置－70oC保存。2/24/202328膜的處理：將結合了DNA(或RNA)的硝酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6×SSC溶液中2分鐘，使其充分潮濕。預雜交：將潮濕的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入預雜交液，盡量解除其中的氣泡后用封口機封口。2/24/202329溫育：將雜交袋浸入適當溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時用68oC；加入50％甲酰胺時，恒溫42oC)，溫育1～2小時，也可延長至12～16小時。保溫過程中應不斷搖動塑料袋，以趕走蓋在濾膜表面的氣泡，否則這些氣泡將阻礙雜交液與濾膜的接觸。(假如將預雜交液加熱到適當溫度后再加入塑料袋內，可以削減氣泡產生)。2/24/202330雜交：雜交反應是單鏈核酸探針與待測核酸分子中的特異基因序列在確定的溫度下雜交復性的過程。雜交包括以下過程：1、雜交液配制：同預雜交液2、探針變性：放射性標記的探針為雙鏈時，于100oC加熱5分鐘變性并快速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無須變性2/24/2023313、打開預雜交袋棄去預雜交液，加入雜交液及變性的探針。解除氣泡后重新封好口4、在與預雜交相同溫度下，保溫8～16小時2/24/202332洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去的過程，非特異性雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在確定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體則保留在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強度兩個要素，同源性越高離子強度越高，雜交體的穩(wěn)定性越高。2/24/202333洗膜的操作如下：1、雜交完畢，取出雜交袋，剪去一角，棄去全部的雜交液，取出膜并快速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。留意不要使濾膜干燥。2、5分鐘后，將濾膜轉移至一盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫振蕩15分鐘。2/24/2023343、將濾膜轉移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，37oC振蕩漂洗30分鐘至1小時。4、將濾膜轉移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，65oC振蕩漂洗30分鐘至1小時。直到用蓋革計數(shù)器在無DNA區(qū)域檢測不出放射信號為止。5、室溫下，濾膜用0.1×SSC稍稍漂洗。然后置濾紙上吸去溶液，置－70oC放射自顯影。2/24/202335非放射性標記探針雜交非放射性標記探針的缺點是雜交后本底信號較強，因此雜交條件與放射性標記探針稍有差別以削減本底。主要變更為用甘氨酸代替雜交液中的牛血清白蛋白，并削減硫酸葡聚糖用量，此法也適用于放射性探針雜交。2/24/202336雜交液組成：50％甲酰胺5xSSC1xFPG25mmol/L磷酸緩沖液25μg/ml變性鮭魚精DNA5％硫酸葡聚糖0.2％SDS50xFPG1％聚蔗糖4001％聚乙烯吡咯烷酮1％甘氨酸過濾后分裝，于－20oC存放。2/24/202337雜交反應的影響因素長探針雜交影響雜交速率和雜化分子穩(wěn)定性的因素1、核酸分子濃度與雜交速率：在探針和固定的核酸濃度都很低的狀況下，雜交初始速度由探針和核酸濃度確定。當探針是單鏈而不存在自身互補的區(qū)域，雜交的速率隨探針濃度的上升而上升。在雜交中可通過提高探針的擴散速率而提高雜交速率，如使小片段探針、減小反應體積提高反應溫度和不斷振搖等措施。2/24/2023382、高濃度雙鏈探針的雜交：限制性內切酶標記的探針，在雜交過程中可能發(fā)生兩種反應：1、與固定在膜上的靶序列雜交；2、雙鏈探針的自身退火。雙鏈探針的自身退火可使探針有20％～30％探針不能與靶序列發(fā)生雜交，因此盡量運用單鏈探針。3、堿基組成：G＋C的含量越高，雜交的速率越高，但對速率的影響不明顯，可忽視不計。但G＋C含量越高雜交核酸的穩(wěn)定性越高。2/24/2023394、鹽溶液的濃度：對雜交速率的影響：對雜交穩(wěn)定性的影響：5、溫度6、甲醛7、錯配的核酸序列：2/24/202340酶聯(lián)探針屬于非放射性探針，探針與生物素或地高辛結合后與氫過氧化酶或堿性磷酸酶連接。雜交反應體積雜交時間2/24/202341探針的種類DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長度在幾百堿基對以上。DNA探針又分為：基因組DNA探針：有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針，多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。cDNA探針：以mRNA為模板經過逆轉錄酶催化產生的互補于mRNA的DNA鏈。2/24/202342探針的種類DNA探針優(yōu)點：1、多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖；2、DNA探針不易降解3、DNA的標記方法比較成熟。2/24/202343探針的種類RNA探針：可以是標記分別的RNA，也可以是重組質粒在RNA聚合酶作用下的轉錄產物。其優(yōu)點是：RNA探針為單鏈，困難性低，與靶序列雜交反應效率極高因不存在重復序列，因此特異性高本底低缺點：2/24/202344探針的種類寡核苷酸(oligo)探針：由17～50mer組成的短探針。優(yōu)點：可依據須要人工合成相應的序列；因片段短，只有一個核苷酸突變，其Tm值也有明顯變更，特殊適用于點突變的檢測雜交速度快特異性強缺點：所帶標記物少靈敏度低；片段短雜交體不穩(wěn)定2/24/202345探針的標記標記物：標記探針的標記物有兩大類1、放射性標記2、非放射性標記非放射性標記又分為：(1)半抗原：如生物素和地高辛，可以利用這些半抗原的抗體進行免疫檢測(2)配體：如生物素還是一種抗生物素蛋白和鏈霉素類抗生物素蛋白配體，可以利用親和法進行檢測(3)熒光素：可以被紫外線激發(fā)出熒光進行視察，主要用于原位雜交。2/24/202346探針的標記切口平移法標記原理：是目前試驗室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標記。帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板。2/24/202347DNaseIDNAPolI,α-32P-dNTP2/24/2023482/24/2023492/24/202350標記步驟1、取1μgDNA溶于少量無菌蒸餾水中2、加入μl10x切口平移緩沖液，混勻10x切口平移緩沖液0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mol/LMgSO41mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)500μg/ml牛血清白蛋白2/24/202351標記步驟3、加入除標記核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標記核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。以下操作要在同位素工作室中有防護措施的狀況下進行操作4、加入100μCi(10μl)標記的核苷酸溶液。注：應貯存在－20oC冰箱中，運用前在室溫下放置15～30分鐘溶化。要盡量削減凍融次數(shù)。2/24/202352標記步驟5、加入無菌蒸餾水，至終體積為46.5μl，混勻6、加入0.5μl稀釋的DNaseI溶液，混勻7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻注：以上操作均在冰浴中進行8、置14～16oC水浴中保溫1～2小時9、加入2μl0.5mol/LEDTA終止反應10、純化標記的DNA探針2/24/202353探針的標記隨機引物法標記原理：隨機引物是含有各種可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反應的引物作用。將待標記的探針模板與隨機引物一起退火，合成標記探針。2/24/2023542/24/2023552/24/202356標記步驟1、冰浴中，在一微量離心管內依次加入下列溶液，并混勻20mmol/LDTT1μl5mmol/LdATP、dGTP、dTTP1μl10x隨機引物緩沖液1μl標記dCTP3μl水1μl2/24/202357標記步驟2、取200ng雙鏈DNA溶于1μl蒸餾水中，在蠟膜上與1μl隨機引物充分混勻，吸入一毛細玻璃管中，用火封嚴兩端。置沸水浴中30分鐘并快速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉入上述離心管中3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反應3小時以上2/24/202358標記步驟4、取10μl終止緩沖液，置－20oC保存?zhèn)溆媒K止緩沖液50mmol/LTris.Cl(pH7.5)50mmol/LNaCl5mmol/LEDTA0.5%SDS2/24/2023592/24/202360隨機引物標記法特點1、除能進行雙鏈DNA標記外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標記。當用RNA為模板是，操作方法同上，但必需接受反轉錄酶。2、標記活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時內使40％～60％以上甚至90％的標記dNTP摻入到探針DNA鏈上3、操作便利2/24/2023613’末端標記末端標記屬于部分標記。特點是可得到全長DNA片段，但標記活性不高。3’末端標記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個過程，3’標記有兩種方式：大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標記法T4DNA聚合酶標記法2/24/202362大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標記法：標記反應步驟：(1)在反應管中依次加入下列試劑并混勻DNA1μg10xKlenow片段緩沖液2μl2mmol/L3種dNTP(無dATP)1μl[α-32P]dATP30μCi加水至25μl10xKlenow片段緩沖液2μl0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mmol/LMgSO4

1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)500μg牛血清白蛋白2/24/202363(2)加入1單位Klenow聚合酶片段，室溫反應30min。(3)加入12μl0.5mol/LEDTA以終止反應。酚/氯仿抽提1次。(4)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分別標記的DNA片段。大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標記法：2/24/202364留意事項：(1)要依據不同限制酶產生的不同粘性末端選擇不同的標記核苷酸。(2)選擇適當?shù)南拗泼讣唉?32P-dNTP,利用DNA聚合酶IKlenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標記。(3)此方法不能干脆用于3’凸出末端DNA的標記。2/24/202365CCTAGGAATTCAATTCCCTAGGEcoRIBamHI加入DNA聚合酶，dNTP(其中一種為標記核苷酸)AATTCCCTAGG2/24/202366T4DNA聚合酶標記法T4DNA聚合酶具有兩種功能，5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性。當反應體系中缺乏dNTP時，T4DNA聚合酶主要表現(xiàn)為外切酶活性。利用這一特性可產生5’凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一為標記核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標記探針。2/24/202367T4DNA聚合酶，無dNTP加入dNTP,其中一種為標記核苷酸2/24/202368標記反應步驟：(1)在反應管中加入下列試劑并混勻DNA0.2~0.5μg1xT4DNA聚合酶緩沖液2μl加水至20μl(2)加入所需的限制酶，并在適當條件下溫育(3)加入適量T4DNA聚合酶。(4)當切除了所需數(shù)量的核苷酸后，加入1μl2mmol/L四種核苷酸(其中一種為標記核苷酸)，37oC保溫一小時。(5)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分別標記的DNA片段。2/24/2023695’末端標記標記原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP分子上的γ磷酸基團轉移到DNA或RNA分子的5’－OH基團上。因此接受γ-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5’端標記。但核酸樣品5’端必需是去磷酸的。2/24/202370PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP2/24/202371標記反應步驟：(1)堿性磷酸酶的預處理：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一個月以上。(2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/Ltris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：2/24/20237210xCIP緩沖液5μlCIP緩沖液適量加水至48μl置37oC30分鐘。加入其次份CIP，接著保溫30分鐘，即可脫去5’端磷酸基團。0.01U的CIP，可脫去1pmol5’磷酸基團(1.6μg4kb線性DNA的5’端數(shù)相當于1pmol)。10xCIP緩沖液Tris.Cl(pH9.0)10mmol/LMgCl21mmol/L