第十九章

基因工程簡介一基因工程基因工程是由七十年代初才開始發展起來的一門科學。其主要內容是一種生物的基因在體外結合在另一生物的基因組（DNA分子）中，再把它引入到生物的細胞內進行表達，形成具有新遺傳性狀的生物。而這種具有新遺傳性狀的生物是按人們的設想制造出來的，它將有益于人類。

二獲得目的基因的方法為了把某種基因轉移到細菌中去表達，首先必須獲得純的該種基因（稱為目的基因）。目前獲得目的基因的方法大致有三種。（1）從含有目的基因的生物DNA中獲得，即將此生物的DNA分離出來后，用限制性內切酶（此種酶由DNA鏈內部的一定部位將DNA切斷）將其切成許多碎片，然后分離出含有目的基因的碎片。（2）先分離出目的基因的轉錄物mRNA，再用此mRNA反轉錄出DNA，稱為cDNA，亦即目的基因。（3）如果已知目的基因的核苷酸順序，可人工合成它，此法適用于分子量比較小的基因。三載體得到目的基因之后，一般要通過一定的載體才能將目的基因轉移到宿主細胞內。目前最常用的載體是細菌的質粒，質粒是細菌細胞中含有的一類環狀DNA分子。載體必需具有的性質是：（1）能與目的基因結合在一起。（2）新組成的DNA分子必需能在適當的寄主細胞中進行復制，目的基因要能夠表達。例如，以大腸桿菌為寄主細胞，則質粒和λ噬菌體是適當的載體。在理論方面，目前主要是用基因工程作為手段，以純化和擴增基因，從而獲得大量純系DNA片段，作為核酸序列分析、基因組的組織分析和基因表達調控研究的材料。這三項工作的開展，將大大促進細胞分化、腫瘤發生、進化等重大生物學問題的研究。在生產實踐方面，目前主要是把一些目的基因轉移到細菌中，利用此種細菌大量生產人們所需要的蛋白質，而這些蛋白質是用其他方法不能大量生產的。人類已能利用基因工程的方法，使細菌產生大量牛的生長激素，用以提高牛奶和牛肉的產量。又如用同樣方法已制造出胰島素和干擾素等用于臨床治療。四.基因工程的應用生物學家把大鼠的生長激素基因轉移到小鼠的受精卵細胞內，發育成新型小鼠，其生長速度比原來快50%，體重也比對照大很多，并把這種新型的小鼠，稱為超級小鼠。這個成果提示，如果我們能用類似的方法制造出具有類似性能的家畜（豬、雞等），將具有重大的生產意義。目前人們還在研究把固氮細菌的固氮基因轉移到其他細菌中以解決氮肥問題；把大豆蛋白的基因轉移到小麥、玉米等中以提高這些作物的蛋白質含量；用基因工程方法制造豬的生長激素，以提高豬肉產量和增加瘦肉率等。總之，基因工程的研究成果，將變成為巨大的生產力。它能迅速提高農業、畜牧業的產量，為人醫、獸醫提供優良的藥物，以及解決許多生物學中的重大問題。

位點專一性重組限制性內切酶

逆轉錄PCR原理雞輸卵管上皮細胞特異性表達載體的構建Thelistofeukaryoticexpressionvectorsconstructed

No.NamePromotorTargetgene1

pEGFP-N1

CMVIEEGFP2pEGFP

Lysozyme

CMVIE

Lysozyme-EGFP3pOVAGOval-promotorEGFP4

pOVAG-2Oval-promotor

Oval-signalpeptide；EGFP5pOVALGOval-promotor

Lysozyme-EGFP6

pEOVALGOval-promotorSV40enhancer

Lysozyme-EGFPExpressionofGFPgeneindifferentvectorsinChickenEmbryonicFibroblasts(CEFs)

pOVAGpEGFP-N1.pEGFP-Lyso

pOVALG

pEOVALGExpressionofGFPgeneindifferentvectorsinratmammaryepitheliaSHZ-88pOVAGpEGFP-N1pOVALGpEGFP-LysopEOVALGpOVAGNegativecontrol500bp

M123456789samplesDetectionofExogenousgeneinchimericchickenembryosbyPCRP1P2P3P4DetectionofPCRproductsbysouthernblotting

500bp1.2kb

1234567891011M100bpladderPCRproductsfrom8-dchimericembryogenome

(+)(－)(+)

DesignofPlasmidswithMARRT-PCRresultsofgenomeDNAfrom3~22daysoldembryosaftertransplasimdincludeMAR

SouthernhybridizationofradioactivityisotopeProductionoftransgenicchicken

bynucleartransferEmbryosProducedbyNuclearTransfer

Invitrodevelopmentofchicken-rabbitinterclassclonedembryos

KaryotypeAnalysisofReconstructedBlastocystNuclearDNAAnalysis

avianfeatherkeratingeneDP15‘-GGAGAAGGTCCAGGGCTGACTTTA-3‘P25‘-ACTTCTCTTGGCAAACATGCAACC--3‘P35‘---GCGTCCACCTCATCCTTAGCAG---3'

ElectrophoreticanalysisofPCRproductusingspecificavianfeatherkeratin

Lane1,markers(100bpladder);Lane2,chichendonorcells;Lane3,8-cellclonedembryo;Lane4,blastocyststage;Lane5,morulastage;Lane6,water(negativecontrol);Lane7,rabbitsomaticcells;TF,targetfragment.

MitochondrialDNAAnalysis

PrimersforamplificationrabbitmitochondrialDNAPR1:5‘-TCTACATACACGTAGGCCGCGGAA---3'PR2:5‘-GAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAAA-3PrimersforamplificationchickenmitochondrialDNA

PC1:5‘-CCCCAGCAAACCCACTAGTA--3'PC2:5‘-TGGTCTAGGGTTCCGATTGT---3'.

ElectrophoreticanalysisofPCRproductusingspecificrabbitandchickencytochromeprimers

Lane1,markers;Lane2,rabbitsomaticcells;Lane3andLane8,morulastage;Lane4andLane9,blastocyststage;Lane5,chickensomaticcells;Lane6andLane11water(negativecontrol);(lane2~6usingrabbitcytb

primers);Lane7,chickensomaticcells;Lane10,rabbitsomaticcells;,negativecontrol;(lane7-11usingchickencytbprimers);TF1,TF2,targetfragment.SequencesofPCRproductsbyusingspecificrabbitandchickencytochromebprimers

(A)chickensomaticcells;(B)morulastage;(C)blastocyststageNTembryoMuitipleovulationsinduced

byCAPEinhensOneovumovulatedafterintra-peritonealinjectionof100mgCAPEthreeovaovulatedafterintra-peritonealinjectionof200mgCAPEOver10oocytesnearmaturityinahen’sovaryafterintra-peritonealinjectionof200mgCAPEThegerminaldiscofanimmatureovum(100x)Lightmicrographofacross-sectionofthegerminaldiscofapreovulatoryfolliclefromthedomesticfowl,thegerminalvesicle(GV)waslocatedinthecentreofthegerminaldisc(GD).Thechromosomeswereobservedinthecentreofthegerminalvesicle.TransplantationoffertilizedegginhenInvitroFertilizationprocess

observedundertheESEM

A:5minutesafterinvitroFertilization;B、CandD:15minutesafterinvitroFertilization.Twohours

afterIVF(400x)Closepairingoftwopronuclei,presumedtobemaleandfemalejuxtaposition,wasdetectedinmultipleovulatedovaincubatedfor2hrafterinvitrofertilization.TheseovawerehistologicallyexaminedbyepifluorescentmicroscopyafterstainingwithDAPI.合子核，Heidenhain氏鐵蘇木精染色(400x)Thezygotenucleus(400x)Associationoftwoonuclei,presumablymaleandfem