高溫脅迫下擬南芥過氧化物酶活性分析

生科院植物生理教研室劉太波前言

過氧化物酶（POD）是存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶。催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)。多數(shù)植物過氧化物酶與碳水化合物結(jié)合成為糖基化蛋白。糖蛋白有避免蛋白酶降解和穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的作用。在正常條件下，植物體的活性氧產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，不會積累過多活性氧。但當(dāng)植物遭受干旱、低溫、高溫、鹽漬、高光強(qiáng)、O3和SO2等逆境，以及植物衰老時（目前有人認(rèn)為衰老也是一種逆境），體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的代謝系統(tǒng)發(fā)生變化，嚴(yán)重時會失調(diào)，導(dǎo)致?O-2、,H2O2、?OH-，等活性氧在體內(nèi)的過量積累，從而對植物造成傷害。逆境對植物的影響逆境對生物的影響高溫逆境對植物的影響干旱而植物為保護(hù)自身免受活性氧的傷害，形成了內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)，包括抗氧化酶類和非酶抗氧化劑。抗氧化酶主要是超氧物歧化酶（SOD）,過氧化氫酶（CAT）,過氧化物酶（POD）,谷胱甘肽還原酶（GR）等，抗氧化劑則包括還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA），類胡蘿卜素、2—生育酚和類黃酮等。測定抗氧化酶活性、抗氧化劑含量在逆境條件下的變化情況，對于研究植物的逆境傷害和植物抗逆機(jī)制，具有重要意義。植物對逆境的反應(yīng)實驗原理

過氧化物酶（POD）催化過氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實驗以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在此酶存在下，過氧化氫可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰氧基苯酚。紅棕色的物質(zhì)可用分光光度計在470nm處測定其吸光度，即可求出該酶的活性。實驗材料10-d-oldArabidopsis(擬南芥)儀器設(shè)備臺式高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計、1.5mL離心管、移液器（100和1000μL）、研缽、培養(yǎng)皿、1/2MS培養(yǎng)基、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、電子天平實驗步驟配置1/2MS培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min；取野生型（WT）擬南芥種子，在超凈工作臺中播種到1/2MS培養(yǎng)基上，播種8皿，確保能收集到6g以上擬南芥。4℃春花處理2天，之后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（22℃，14h光照，10h黑暗的光周期下培養(yǎng)10d）以上1，2步由教師在實驗課兩周前準(zhǔn)備材料。實驗步驟3.取四皿擬南芥，置于37℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)4h，對照組的四皿仍然在22℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。4.肉眼觀察傷害癥狀，并記錄實驗現(xiàn)象。5.粗酶的提取：分別稱取0.05g材料（全苗），加入500

μLpH=7.0PBS(磷酸鹽緩沖液),冰浴研磨，轉(zhuǎn)移1.5mL離心管中，置于10000rpm4℃離心10min,上清液即為粗酶液。實驗步驟POD酶活性的測定：取酶液50μL于比色杯中，加入2.95mL反應(yīng)液(0.3%H2O21mL；0.2%愈創(chuàng)木酚0.95mL；pH=7.0PBS1mL)，啟動反應(yīng)，測定λ470nm處OD值的上升速度。

以每分鐘OD值上升0.01定義為1個酶活力單位。測定兩分鐘內(nèi)OD470值的變化。實驗結(jié)果項目對照處理傷害癥