第九章吸光光度法Spectrophotometry9-1吸光光度法基本原理9-2光度計及其基本部件9-3顯色反應及顯色條件的選擇9-4吸光度測量條件的選擇9-5吸光光度法的應用9-6紫外吸收光普法簡介*概述吸光光度法

是基于被測物質的分子

對光

具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。比色法可見分光光度法紫外分光光度法*目視比色法標準系列未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高*分光光度法（紫外-可見分光光度法）UV-VIS0.575光源單色器吸收池檢測器顯示I0It參比樣品未考慮吸收池和溶劑對光子的作用注意比較*吸光光度法特點：1）檢出限低10-5-10-6mol/L2）靈敏度高，適于測定微量組分3）誤差2-5%4）測定迅速、操作簡單、價格便宜，應用廣泛*9-1吸光光度法基本原理射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光一、物質對光的選擇性吸收*單色光、復合光、光的互補單色光復合光光的互補單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現象稱為光的互補。藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠*完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現象示意復合光*光吸收原理物質的電子結構不同，所能吸收光的波長也不同，這就構成了物質對光的選擇吸收基礎。分子的紫外-可見吸收光譜是由電子躍遷引起的，故又稱電子光譜.純電子能態間躍遷S2S1S0S3hE2E0E1E3Ah分子內電子躍遷帶狀光譜A銳線光譜S2S1S0*吸收光譜（吸收曲線）測量某物質對不同波長單色光的吸收程度，以波長（）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。用來描述物質對不同波長光的吸收能力。*吸收曲線的討論：①同一種物質對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax②不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。③吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據之一。*討論：④不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作作為物質定量分析的依據。⑤在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據。*定性分析與定量分析的基礎定性分析基礎定量分析基礎物質對光的選擇吸收ABA在一定的實驗條件下，物質對光的吸收與物質的濃度成正比。AC增大*二、光吸收的基本定律-朗伯-比爾定律透光率（透射比）Transmittance透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%*吸光度與透光率AbsorbanceandtransmittanceT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%*吸光系數Absorptivityb吸光液層的厚度，光程，cmc吸光物質的濃度：

g/L,mol/LK

比例常數入射光波長物質的性質溫度取值與濃度的單位相關c：mol/LK

（或k）摩爾吸光系數，L·mol–1·cm-1c：g/LK

a吸光系數，L·g–1·cm-1c：g/100mLK

比吸光系數相互關系100mL·g–1·cm-1*吸光的加合性多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即對吸收定律偏離AC主要原因非單色光吸光質點的相互作用*非單色光引起的對吸光定律的偏離設入射光由1

和2

兩種波長組成，溶液的吸光質點對兩種波長的光的吸收均遵從吸收定律121+2或或*非單色光引起的對吸光定律的偏離對吸收光譜而言，b和c固定，反映了隨波長變化的情況，單一波長，

固定；不同波長，

不同。因此，非單色光將導致對吸光定律的偏離。A或12在實際工作中，入射光通常具有一定的帶通。為了避免非單色光帶來的影響，一般選用峰值波長進行測定。1對應的1較小2對應的2較大選用峰值波長，也可以得到較高的靈敏度。*吸光質點間相互作用引起的對吸光定律的偏離質點間的靜電作用質點間的締合作用質點間的化學反應*0.575光源單色器吸收池檢測器顯示I0It參比樣品未考慮吸收池和溶劑對光子的作用注意比較9-2光度計及其基本部件*單波長單光束分光光度計0.575光源單色器吸收池檢測器顯示*比值光源單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器單波長雙光束分光光度計*雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產生交流信號。無需參比池。△=1～2nm。ΔA=Aλ2-Aλ1=(ελ2-ελ1)bc=Kc*一、基本組成

generalprocess光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源在整個紫外光區或可見光譜區可以發射連續光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩定性、較長的使用壽命。分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類

可見光區：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區：氫、氘燈。發射185～400nm的連續光譜。*

2.單色器

將光源發射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；使不同波長的輻射以不同的角度進行傳播；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。*棱鏡—根據光的折射現象進行分光棱鏡對不同波長的光具有不同的折射率，波長長的光，折射率??；波長短的光，折射率大。平行光經過棱鏡后按波長順序排列成為單色光；經聚焦后在焦面上的不同位置上成像，獲得按波長展開的光譜；

棱鏡的光學特性可用色散率和分辨率來表征；*光柵

通過在平板玻璃或金屬板上刻劃出一道道等寬、等間距的刻痕制成。常用的光柵刻痕密度每毫米為1200條、1800條或2400條；根據工作方式不同分為：透射光柵，反射光柵；光柵光譜的產生是多狹縫干涉與單狹縫衍射共同作用的結果，前者決定光譜出現的位置，后者決定譜線強度分布；*光柵的色散原理*狹縫

單色器的進口狹縫起著單色器光學系統虛光源的作用。復合光經色散元件分開后，在出口曲面上形成相當于每條光譜線的像，即光譜。轉動色散元件可使不同波長的光譜線依次通過。

*3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區須采用石英池，可見區一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結果顯示記錄系統檢流計、數字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理*紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池檢測器信號輸出氫燈，氘燈，180~375nm；鹵鎢燈，250~2000nm.基本要求：光源強，能量分布均勻，穩定作用：將復合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光柵，反射光柵玻璃，光學玻璃，石英作用：將光信號轉換為電信號，并放大光電管，光電倍增管，光電二極管，光導攝像管（多道分析器）表頭、記錄儀、屏幕、數字顯示基本組成總結*9-3顯色反應及顯色條件的選擇顯色反應顯色反應：將待測組分轉變成有顏色化合物的反應

在吸光光度分析中所用到的顯色反應主要有配位反應、氧化還原反應等。用于吸光光度分析的顯色反應應滿足下列要求：

⑴選擇性好，干擾少；

⑵靈敏度高；εmax=104-105→靈敏度高εmax<103→靈敏度低⑶有色化合物的組成恒定；

⑷有色化合物的性質穩定

⑸色差大Δλ〉60nm

*顯色條件的選擇

吸光光度法是測定顯色反應達到平衡后溶液的吸光度，為了得到準確的結果，必須從研究平衡著手了解影響顯色反應的因素，控制適當的條件，使反應完全和穩定。*顯色反應的主要條件顯色的主要條件有以下幾點：

（1）顯色劑用量顯色反應一般可以用下式表示：M+R＝MR

為了減少反應的可逆性，根據同離子效應，加入過量的顯色劑是必要的，但過量太多，有時會有副反應產生，反而不利。*吸光度與顯色劑用量關系圖是吸光度與顯色劑用量關系的幾種情況。圖2－11吸光度與顯色劑用量的關系

從三個圖中可以得到：

可以選用的用量較寬

可以選用的用量較窄

表明隨著顯色劑用量的增加，吸光度也不斷增大。

*（2）溶液的酸度

溶液的酸度對顯色反應的影響是多方面的

:

例如由于顯色劑大多是有機弱酸，酸度影響顯色劑的離解，因而影響顯色劑反應的完全程度。又如許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，配位反應后的顏色必須與顯色劑本身的顏色有顯著的不同。二甲酚橙pH>6.3呈紅紫色，pH<6.3呈黃色，與金屬配合物則呈紅色，故只適合于pH<6.3的條件。*（2）溶液的酸度酸度還影響配合物的組成，Fe3+與磺基水楊酸(Sal2-)的反應就是一個典型的例子。pH=1.8～2.5Fe3＋＋Sal2－＝Fe（Sal）＋紫紅色pH=4～8Fe3＋＋2Sal2－＝Fe（Sal）2－紫褐色pH=8～11.5Fe3＋＋3Sal2－＝Fe（Sal）33＋黃色pH>12配合物被破壞，生成Fe（OH）3

沉淀*（3）顯色時間的影響由于反應速率不同，完成反應所需的時間常有很大差別同時，有色化合物在放置過程中也會發生變化。有的迅速反應且能穩定較長時間（如Fe3+與磺基水楊酸反應）。有的放置一段時間反應才達平衡，溶液顏色才達穩定程度（如硅鉬藍的生成）。有的放置一段時間后由于各種原因，如空氣氧化、試劑分解或揮發、光照射等而褪色（如硅鉬藍只穩定0.5～1h）。

*（4）溫度對顯色反應也有影響如Fe3＋與磺基水楊酸反應室溫就能進行，硅鉬藍的生成如果在沸水中則只需30s。

*（5）干擾離子的影響及其消除有的干擾離子本身有顏色，如Cu2＋（藍）、Co2＋（紅）、Cr3（綠）、Fe3＋（黃）；有的與試劑生成有色配合物，如硅鉬藍法測Si時，P、As也與鉬酸銨生成雜多酸且同時被還原成鉬藍干擾測定；有的與試劑或被測離子生成更穩定化合物，使被測離子配位不完全等。因此，對與一個新的比色方法的提出，往往必須做干擾離子試驗。*干擾離子的消除對于干擾離子的消除通常采用下述方法。（1）加入配位劑掩蔽干擾離子如測Ti4＋時，Fe3＋黃色干擾，可加H3PO4使其成為Fe（PO4）3－（無色）。（2）調節溶液酸度如硅鉬藍在酸度4～6mol/L仍然穩定，但磷砷鉬藍在1.6mol/L以上時則被破壞。*顯色劑無機顯色劑:有機顯色劑:生色團從廣義來說，所謂生色團，是指分子中可以吸收光子而產生電子躍遷的原子基團。但是，人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團或結構系統定義為生色團（發色團）。具有不飽和鍵π電子的基團，產生π→π*躍遷，躍遷ΔE較低,往往是生色團注：當出現幾個發色團共軛，則幾個發色團所產生的吸收帶將消失，代之出現新的共軛吸收帶，其波長將比單個發色團的吸收波長長，強度也增強助色團：有一些含有n電子的基團，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發生p—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。

*紅移與藍移有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發生變化:λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。增色效應和減色效應——波長不變

增色效應：吸收強度增強的效應

減色效應：吸收強度減小的效應有機顯色劑種類(1)偶氮類顯色分子中含有偶氮基(2)三苯甲烷類*三元配合物的分析特性如果顯色反應加兩種顯色劑可以形成三個組分的混合配合物。這種方法大大的提高了顯色劑的穩定性、靈敏性、選擇性。

三元配合物比較穩定,可提高分析測定的準確度和重現性。例如Ti-EDTA-H2O2三元絡和物的穩定性比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元絡和物的穩定性分別增加強約1000倍和100倍。*三元配合物的分析特性三元絡合物對光有較大的吸收容量,所以進行光度測定時它比二元絡合物具有更高的靈敏度。如用H2O2測定釩，靈敏度太低(=2.7×102)。而用PAR顯色靈敏度雖有提高，但選擇性差。如果將V5+、H2O2、PAR三者混合,一定條件下則形成紫紅色的三元絡合物，靈敏度可大大提高(=1.4×104)，最大吸收波長也移至540nm（原最大吸收波長為450nm），出現較大紅移。

*三元配合物的分析特性形成三元絡合物的顯色反應比二元體系具有更高的選擇性。這是因為在二元絡合物中，一種配位體常與多種金屬離子產生類似絡合反應，而當體系中兩種配位體形成三元絡合物時，就減少了金屬離子形成類似絡合物的可能性。例如：鈮和鉭都可與鄰苯三酚生成二元絡合物，但是在草酸介質中，只有鉭能與鄰苯三酚形成黃色的鉭-鄰苯三酚-草酸三元絡合物，鈮則不能形成類似的三元絡合物，因而提高了反應的選擇性。*三元絡合物在光度分析中的應用特點三元絡合物在光度分析中的應用特點還有很多：

可以改善顯色條件,例如有CTMAC（氯化十六烷基三甲基胺）存在時,Al3+與絡天青S形成三元絡合物比沒有CTMAC時形成二元絡合物的pH范圍寬;

具有較好的萃取性能,例如Mn2+在pH>11時能與雙硫腙形成有色絡合物,加入吡啶萃取時,穩定的三元配合物大大提高了萃取率。*9-4:光度測量誤差和測量條件的選擇cb

測量靈敏度=——·M·106

1000

0.001MS=——

·M·103=——(μg/cm2)εεA

顯色反應靈敏度：ε=——(L·mol-1·cm-1)bc*檢測計標尺上A與T的關系若測A時產生微小的絕對差dA，則相對誤差Er為：Er=dA/A；A=εbc當b一定時，兩邊積分得：dA=εbdcdc為測量濃度時的絕對誤差，二式相除：dA/A=dc/c=Er因c∞A，故dc亦正比dA而測量時Er相等，上式成立。一.儀器測量誤差

*ΔT-儀器刻度讀數不可靠所引起的誤差（±0.2%～±2%）*[例如]某光度計的透光率刻度讀數誤差為△T=±1%，計算下列各百分透過率時濃度的相對誤差△c/c，指出△c/c<4%時，百分透光率讀數范圍T%=1，10，20，30，50，70，80，90T=0.01，0.02，0.03，0.50，0.70，0.80，0.90△c/c（%）=21.7，4.34，3.10，2.77，2.88，4.00，5.60，10.54[解]為使結果為正，△T取負值

*用誤差公式：△c0.434△T0.434(-1%)

——=————=—————=21.7%

cT·lgT0.01·lg0.01由計算可知：此時吸光度在0.20-0.80之間A=-lgT=-lg0.368=0.434

此時相對誤差最小?！鱟當——(%)<4%時；T為15–65%

c*影響測定結果的相對誤差兩個因素：

T和ΔTΔT-儀器刻度讀數不可靠所引起的誤差（±0.2%～±2%）當T=0.368（A=0.434）時，濃度相對誤差最小當吸光度在0.15~1.0范圍內濃度的測量誤差約為1.4%-2.2%*二.測量條件的選擇1.入射光波長的選擇：最大吸收的原則λmax2.控制吸光度讀數范圍：調c或b，使A介于0.2--0.8

3.參比溶液的選擇：選合適的參比溶液，調儀器A=0，T=100%

*參比溶液的選擇⑴如果樣品溶液、試劑、顯色劑均無色時，選溶劑作參比，稱為“溶劑空白”；⑵如果樣品溶液有色，而試劑、顯色劑無色時，選不加顯色劑的樣品溶液作參比，稱為“樣品空白”；⑶如果試劑、顯色劑有色，而樣品溶液無色時，選不加樣品的試劑、顯色劑溶液作參比，稱為“試劑空白”。(4)顯色劑與試液均有顏色,可將一份試液加入適當掩蔽劑,將被測組分掩蔽起來,使之不再與顯色劑作用,而顯色劑及其他試劑均按試液測定方法加入,以此作為參比溶液,可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾.(5)改變加入試劑的順序,使被測組分不發生顯色反應,以此溶液作為參比溶液消除干擾.*9.5吸光光度法的應用

一.標準曲線法測單一組分1.選擇合適的顯色反應和顯色條件2.繪出被測組分的吸A收光譜曲線(用標液)λ3.在λmax下測一系列標準溶液A的A值，繪制工作曲線A---c4.與工作曲線相同的方法，測未知物AX，從工作曲線上查cX

AxλCx*

[例1]用phen測微量Fe2+：

(1)cFe(標)=100μg/mL100×10-6=————=1.79×10-3mol/LM——1000

b=1cm：VFe(標)(mL)：0.20，0.40，0.60，0.80，1.0/50mL容量瓶A508：0.080，0.150，0.225，0.300，0.375*(2)試樣水泥→50ml顯色與標準曲線方法相同，測A=0.770

MFe

——1000(3)計算Fe%=cXV50——×100mS

*

[例2]稱鋼樣0.500g，酸溶解，將錳全部氧化為MnO4-，轉移到50mL容量瓶中，搖勻，從中取5.00mL→50mL容量瓶定溶，用2cm比色皿在λ525nm，ε=2235，測A=0.124，計算Mn%=？(Mn=54.94)

[解]A0.124c2=——=————=2.77×10-5mol/L

εb2235×2MMn

c2

·50·——1000

Mn%=——————×100=0.1525.000.500·——50*

[例3]Phen測Fe，欲配Fe2+標液1L，使其稀釋100倍時，放在1.0cm的比色皿中，測得A=0.50，問稱取(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O(Mr=392.13)多少克？(ε=1.1×104)

[解]設稀釋后A0.50cFe2+=——=—————=4.5×10-5mol/L

εb1.1×104×1.0所以：

mS=c·V·M=4.5×10-5×100×392.13=1.8g*

[例4]某試液用2.0cm比色皿測T=60%，若改用3.0cm，求T%和A

[解](1)A=-lgT=-lg0.60=0.222=εbcA1b1b2(2)——=——A2=——A1=0.333A2b2b11100(3)A=2-lgT%=lg(——)=lg(——)TT%lgT=2-A=2-0.333=1.667T%=46.45*

[例5]稱純Fe0.5000g溶解定容1000mL作標準Fe，取10.0mL稀釋→100mL，取5.0mL顯色定溶50mL，測As=0.230；稱試樣1.500g溶解定容250.0ml，從中取5.00ml與標準曲線相同方法測Ax=0.200，求試樣Fe%=？

[解]0.500g

———·10.010005.0c標=——————

×

——=5.0×10-6g/mL100mL50A標

AS0.230c標5.0×10-6

——=——=———；——=————

A樣

AX0.200c樣

c樣

*因為BeerLaw：

ASAX

——=——

cScXAX

所以cX=——

×cS=4.35×10-6g/mLAS

4.35×10-6g/mL×50mL

所以Fe%=———————————

×1005.01.50g——

250=0.725*一.多組分的定量方法三種情況：1．兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量9-6吸光度法的其他應用*2．兩組分吸收光譜部分重疊λ1→測A1→b組分不干擾→可按單組分定量測Caλ2→測A2→a組分干擾→不能按單組分定量測Ca

*解線性方程組法3．兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測定*