項目名稱：動物重要病原菌功能基因組與分子致病機理研究

周銳華中農業大學2012.1-2016.8教育部湖北省科技廳一、關鍵科學問題及研究內容（一）擬解決的關鍵科學問題病原菌在動物和人中的流行與傳播機制結核病是全球死亡人數最高的人類傳染病，主要由結核分枝桿菌引起，但10％973為人結核分枝332414162病原菌的蛋白質互作與基因調控網絡在后基因組時代，生命科學領域的研究人員面臨的問題不再僅僅是某個基提供新的藥物靶標和策略。病原菌的致病與免疫逃避的機制傳染病的發生、發展與轉歸是病原微生物與宿主相互作用的結果，不同病深入研究的重要基礎科學問題。（二）主要研究內容以結核分枝桿菌復合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌等重要動物病原菌為研究對象，綜合運用分子流行病學、現代細菌學、分子免疫學、功能基因組學、蛋白質組學、糖組學等研究手段，開展如下研究：進一步開展牛結核、豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病的病原學與流行病學研多樣性和抗原多樣性的遺傳基礎。菌的全菌蛋白質-蛋白質相互作用網絡，發掘與細菌生長、代謝、毒力調控和耐藥相關的新關鍵因子和藥物靶標。以結核分枝桿菌、豬鏈球菌等病原菌為研究對象，進行細菌糖組學研究，面多糖的合成途徑和生物學作用，深化對這兩種病原菌的生長及感染機制的認識，為抗菌藥物開發新策略提供理論基礎。研究人結核分枝桿菌對牛的致病性，鑒定牛分枝桿菌、豬鏈球菌和副豬嗜號傳導途徑，研究豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌的協同致病作用及其機制。研究結核病發生、發展和轉歸過程中炎性因子的變化及其調控機制，牛分亂的機制。二、預期目標（一）總體目標以結核分枝桿菌復合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌為研究對象，初步闡明DNA（二）五年預期目標500200（及牛型2000完善和構建結核分枝桿菌和豬鏈球菌的蛋白質相互作用網絡和轉錄調損傷修復與耐藥之間的關系。Sir2Sir2蛋白與牛分枝桿菌致病性及藥物作用機理之間的關聯性。鑒定結核分枝桿菌和豬鏈球菌表面多糖及結核分枝桿菌細胞壁多糖的105種重要表面多糖的組分和結構，明確其在細菌生長及致病中的關鍵作用。初步闡明人結核分枝桿菌對牛的致病特征；鑒定豬鏈球菌、副豬嗜血桿208－10協同致病作用和機制。發表SCI50－60/15－205－6100－150三、研究方案（一）總體研究思路、項目研究的技術路線及可行性分析總體研究思路結核分枝桿菌復合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌是嚴重危害畜牧業健康發技術路線ORF組的克隆及蛋白質互作與基因調控ORF組的克隆及蛋白質互作與基因調控菌株分離鑒定糖基供體合成酶和糖基轉移酶基( 因的克隆與功能網絡構建一)病原菌在動物和人中的流行和傳播機制DNA代謝相關蛋白相互作用亞網絡解析研究研究血清型/基因型（二）蛋白質互作與基因調控網絡（三）胞外多糖的結構與功能耐藥性代表菌株復制與損傷修復及耐藥機制功能基因和蛋白質新藥靶標胞外多糖流行環節與溯源析致病性豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌協同致病機制與宿主相互作用及信號傳導通路結核病發生發展和轉歸中炎性因子變化及調控牛分枝桿菌的免疫逃避機制豬鏈球菌誘導炎癥紊亂機制（四）感染與分子致病機制 （五）免疫應答與免疫逃避機制可行性分析工作基礎：本項目是在2010年結題驗收的973計劃重大傳染病基礎研究專（2006-2010的基礎上滾動申報的。已結題的973973人才隊伍：本項目的研究隊伍來自教育部屬大學、中科院和中國農科院等優勢單位，結構合理，年富力強，專業特長突出，學科交叉。項目組絕大多數人973本項目有優秀的人才隊伍保障。技術平臺：本項目涉及的關鍵研究技術平臺，包括分子流行病學、基因組支撐條件：本項目涉及的七個單位擁有與該申請項目研究領域相關的4個31III（二）項目的創新點與特色在我國，結核病在動物（特別是牛）樣性與抗原多樣性的遺傳基礎，為三種傳染病的防控提供科學決策依據。從結核分枝桿菌和豬鏈球菌的全局性蛋白質相互作用網絡和基因調控網從克隆鑒定參與結核分枝桿菌和豬鏈球菌的表面多糖合成途徑的重要糖從病原菌及其重要組分（蛋白質、表面多糖）與宿主相互作用及其信號為揭示三種細菌性傳染病的發生、發展與轉歸機制提供科學數據。（三）課題設置課題1、病原菌在動物和人中的流行與傳播機制1．主要研究目標揭示結核分枝桿菌復合群在牛和人中的流行規律與傳播機制、豬鏈球菌和的遺傳基礎，為這三種傳染病的防治提供理論依據。主要研究內容究人結核分枝桿菌在牛等動物中的流行情況與致病性及牛分枝桿菌在人間的流行情況；通過流行環節和溯源研究，揭示結核在牛－人間的傳播規律與機制。細菌分離鑒定和保藏：從動物和/或人中分離鑒定一批結核分枝桿菌定，為基因變異和分子流行病學研究積累材料與資料。病原菌基因變異研究：通過全基因組重測序和/或全基因組掃描分析三種病原菌的基因組序列的變異（SNPs、基因缺失和基因重排等，確定變異的基礎。承擔單位、課題負責人和主要學術骨干承擔單位：華中農業大學、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、寧夏大學課題負責人：郭愛珍主要學術骨干：劉思國、王玉炯、蔡旭旺經費比例：22％課題2、病原菌的蛋白質互作與基因調控網絡1．主要研究目標構建或完善結核分枝桿菌和豬鏈球菌的蛋白質相互作用與基因調控網絡，Sir2Sir2關系。主要研究內容DNADNA2牛分枝桿菌蛋白質乙?；捌渑c致病性和耐藥性的關系研究：鑒定牛Sir2Sir2病性及藥物作用機理之間的關聯性。承擔單位、課題負責人和主要學術骨干承擔單位：華中農業大學、中國科學院武漢病毒研究所課題負責人：周銳主要學術骨干：張華、谷晶、徐卓菲、金卉經費比例：26％課題3、病原菌表面多糖的結構與功能1．主要研究目標以結核分枝桿菌、豬鏈球菌等病原菌的表面多糖為對象，通過對參與其生疫苗及藥物開發奠定基礎。主要研究內容的基因；合成途徑；菌細胞表面多糖的生物學與免疫學功能；合成病原菌多糖或類似物，分析驗證多糖的生物學作用，進行病原菌承擔單位、課題負責人和主要學術骨干承擔單位：中國科學院微生物研究所、華中農業大學、大連醫科大學課題負責人：李學兵主要學術骨干：馬郁芳、譚臣經費比例：16％課題4、病原菌感染與分子致病機制主要研究目標初步闡明人結核分枝桿菌在牛群中的感染與致病特征；闡明豬鏈球菌和副理損傷及其機制。主要研究內容毒力因子。染后對宿主免疫系統的影響及致病力的變化，研究病原間協同致病機制。承擔單位、課題負責人和主要學術骨干行病研究所課題負責人：陸承平主要學術骨干：范紅結、姜永強經費比例：16％課題5、病原菌的免疫應答與免疫逃避機制1．主要研究目標鑒定結核病發生、發展與轉歸過程的分子標識；初步闡明自噬在牛分枝桿菌感染的先天性免疫和獲得性免疫中的作用及其機制，揭示牛分枝桿菌免疫逃避以及引起慢性炎癥的機制；闡明豬鏈球菌引起急性炎癥和導致炎癥紊亂的機制。主要研究內容結核病發生、發展和轉歸的研究：研究結核病發生、發展和轉歸過程牛分枝桿菌免疫逃避以及引起慢性炎癥的機制研究：比較研究牛分枝（ROS/siRNA承擔單位、課題負責人和主要學術骨干承擔單位：揚州大學、華中農業大學課題負責人：焦新安主要學術骨干：金梅林、張安定、貝為成經費比例：20%（四）各課題間的相互關系本項目的總體目標是：進一步闡明動物結核桿菌、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的流行特征與傳播機制，解析三種病原菌的重要基因、蛋白質和多糖的結構、功能及其相互作用與調控網路，深入揭示病原菌的致病機理和免疫機理，為這三種傳染病的防控提供必要的科學理論依據。51）病原菌在動物和人中的流行與傳播機制（2）（3）病原菌表面多糖的結構與功能（4）（5）病原菌的免疫應答與免疫逃避機制。課題設置的思路：緊密圍繞細菌性傳染病的三要素病原菌、宿主和環境及123454523務于項目總體目標的實現。病原菌環境病原菌環境課題一、病原菌在動物和人中的流行與傳播機制課題二、蛋白質互 課題三、胞外多作與基因調控網絡 的結構與功能基因、蛋白質 表面多糖課題四、感染與分子致病機制課題五、免疫應答與免疫逃避機制宿主圖1.課題設置思路示意圖四、年度計劃年度

研究內容 預期目標確定病原菌流行病學樣品的采對方案和規范進行示范和調研；病原菌新毒力相關基因的發掘糖鏈合成相關基因簇,克隆、表達部分關鍵基因。結核分枝桿菌：研究人結核分第DNAmbSir2；一豬鏈球菌：細菌雙雜交載體和表達載體改造及豬鏈球菌ORF年（中篩選可誘導技術鑒定出病原菌感染過程差異。

31305050鑒定三種細菌新毒力相關基因1058-10關蛋白；初步完成結核分枝桿菌代謝蛋白質亞網絡的構建；完成mbSir2完成載體改造，豬鏈球菌ORFPCR完成精細文庫構建；重組表達個豬鏈球菌表面蛋白和分泌蛋白；確定豬鏈球菌可以誘導宿主細胞炎性因子釋放的組份；鑒定在病原菌感染過程中宿主細胞內磷酸化水平改變蛋白；鑒定一批副豬嗜血桿菌強弱毒發表SCI6-9項。年 研究內容 預期目度獲得三種細菌流行病學樣本，序列變異的分析；構建篩選用細菌雙雜交重組質完善結核分枝桿菌DNA代謝蛋白質mbSir2化蛋白及其乙酰化位點的確認。第對結核分枝桿菌和豬鏈球菌的關鍵基因進行生物化學分析并測定3D二基轉移酶缺陷株。建立豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌年研究結核病發生、發展和轉歸鑒定牛分枝桿菌的免疫應答與免疫部分細菌蛋白為誘餌篩選宿主的相定與豬鏈球菌感染相關的宿主免疫素分子。

獲得160成分型鑒定；對所收集菌株進行全基>503302000ORF20-30個表達純化的豬鏈球菌蛋白質；完成DNA2-3DNA基因的酶特性分析；得到關鍵基因的3D5破血腦屏障的細胞模型；程中炎性因子的變化規律；篩選3-5種牛分枝桿菌免疫應答或逃逸新蛋50-60SILAC5個副豬嗜血桿菌毒素分子，表達純化毒素蛋白；發表SCI12-152-3年 研究內容 預期目度繼續獲得三種細菌流行病學樣因組序列變異的分析；豬鏈球菌文庫的雙雜交篩選；表達及純化結核分枝桿菌重要（去乙酰化?；瘜ο嚓P蛋白質功能的影響；第構建分枝桿菌和豬鏈球菌關鍵三桿菌胞壁多糖的結構和豬鏈球菌莢化學與酶法結合的合成研究；年（4）毒力因子與宿主細胞互作及互作的信號傳導途徑研究；（5）篩選結核病發生、發展與轉歸ThCTL

獲得160成分型鑒定；對所收集菌株進行全基>50320基本完成豬鏈球菌文庫的雙雜DNA61-2菌突破血腦屏障的機制；爭取獲得結核病的分子標識，闡1-2表達純化全部豬鏈球菌表面蛋白和分51-2發表SCI12-154-5年 研究內容 預期目度繼續獲得三種細菌流行病學樣因組序列變異的分析；對鑒定的豬鏈球菌相互作用共現的部分重要互作蛋白進行共沉淀系統；完成結核分枝桿菌重要復制修復基因敲除菌株及超量表達機理和對牛分枝桿菌毒力的影響;第分析結核分枝桿菌和豬鏈球菌糖基轉移酶及多糖鏈對感染過程的四活性;比較豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌年系統的影響及致病力的變化;比較研究牛分枝桿菌強弱菌株探索自噬在天然免疫和獲得性免疫中與細菌的相互作用以及這些過程

獲得150成分型鑒定，同時獲得基因組的完成300完成豬鏈球菌互作蛋白的基因500系，完成10-15個互作蛋白的共沉淀和功能分析；得到結核分枝桿菌DNA復制修復基因敲除菌株及超量表達菌株；建立牛分枝桿菌蛋白質乙酰化對細菌耐藥性的關聯性及立蛋白質乙酰化與細菌毒力的關聯性；獲得關鍵基因及多糖鏈的免疫5-82揭示病原菌在樹突狀細胞內存8-10SCI15-204-5年 研究內容 預期目度建立流行菌株菌種庫；分析基因組序列的變異與致病性及發病特DNA復基因突變菌株在不同生長條件下的差異表達分析；繪制豬鏈球菌全局性蛋白質相第毒力相關的新功能基因及蛋白質；菌毒力和藥物作用機理的影響;五研究酶底物類似物（抑制劑）糖鏈或糖鏈類似物的免疫原性;年以實驗動物為模型研究結核分的機制。研究分枝桿菌等相關分子在逃項目總結。

菌株菌種庫，總結結核分枝桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌在我國流行的基因型與血清型的動態變化規律，及結核菌在人和牛之間的傳播規律與機制；DNA復制修復基因的功能