第四章毒作用機制第一節概述毒作用機制的研究內容：①毒物如何進入機體？②怎樣與靶分子相互作用？③怎樣表現其有害作用？④機體對損害作用的反應等。毒作用機制的研究是評價化學毒物潛在危害的基礎。終毒物：終毒物：是可與內源性靶分子（如受體蛋白、酶、微纖維蛋白、DNA及脂質等）相互作用，使機體整體性結構或功能改變，從而導致毒性損害的物質。終毒物形式：母體化合物、母體化學物的代謝產物或者是毒物生物轉化期間產生的活性氧，也可能是內源性分子。外源化學物產生損害的途徑：最直接途徑：化學毒物在機體重要部位出現，而不與靶分子作用。較為復雜途徑：毒物進入機體后，抵達靶部位，與靶分子相互作用，引起損害。最復雜途徑：a

毒物先分布到靶部位；b終毒物與靶分子相互作用，引起細胞和域結構的紊亂；c啟動分子、細胞或組織水平的修復機制，當毒物所致紊亂超過修復能力，修復功能失調，毒作用發生。第二節毒物對生物膜的損害作用一、生物膜概述（一）生物膜的化學組成生物膜膜脂（磷脂、少量的糖脂和膽固醇）蛋白質糖、金屬離子、水

脂質雙層是所有生物膜的結構基礎，而膜蛋白幾乎負責生物膜的所有功能。（二）生物膜的結構特點1膜的運動性側向運動分子的擺動旋轉運動翻轉運動側向運動旋轉運動2膜脂的相變與流動性相變溫度Tc脂質凝固態液晶態（三）生物膜的“流動鑲嵌學說”脂質雙層是膜的基本結構，膜脂質分子在不斷運動中；生理條件下，呈流動的液晶態；脂雙層結構既是屏障，也是膜蛋白表現功能的舞臺。（三）生物膜的“流動鑲嵌學說”細胞膜上的蛋白質與膜脂分子之間存在相互作用，也處于運動之中；部分膜脂分子對于維持膜蛋白的構象和發揮功能有直接的影響。（三）生物膜的“流動鑲嵌學說”膜的脂質、膜蛋白和膜糖在脂雙層兩側的分布是不對稱的，膜上的糖基總是暴露在細胞膜的外表面上。這種不對稱性表明了膜功能的復雜性。（四）生物膜的三大基本功能

能量轉換；物質運送；信號跨膜轉導。二、毒物對生物膜的損害作用（一）對生物膜組成成分的影響化學毒物可引起細胞膜成分含量、結構和性質的改變。①CCl4可引起大鼠肝細胞膜磷脂和膽固醇含量的下降；②SiO2可與人紅細胞膜上的蛋白結合，使其結構中的α-螺旋減少；③有機磷農藥可抑制突觸小體及紅細胞膜上乙酰膽堿酯酶的活性。（二）對膜生物物理性質的影響膜生物物理性質：通透性、流動性、膜電荷和膜電位等。

1.對膜通透性的影響許多化學毒物可通過與膜蛋白或膜脂相互作用，改變膜的通透性來發揮毒作用。①DDT可作用于神經軸索膜，改變Na+和K+的通透性，從而產生一系列的神經中毒癥狀。②纈氨霉素可使線粒體膜對K+的通透性增大，使氧化磷酸化解偶聯，從而造成細胞損傷。氧化磷酸化作用：當電子流過呼吸鏈時，質子通過膜被泵出高[H+]低[H+]線粒體外膜線粒體內膜膜間腔線粒體基質H+Pi+ADPATP＋－＋－＋－＋－＋－線粒體e－ATP酶復合體

（二）對膜生物物理性質的影響2.對膜流動性的影響流動性是生物膜的基本特征之一。現已發現不少化學毒物可以影響膜的流動性。例如，①重金屬離子，如Pb2+可引起膜流動性下降；②SiO2可引起巨噬細胞的膜脂流動性升高等。（二）對膜生物物理性質的影響3.對膜電荷的影響膜表面糖脂、糖蛋白形成膜表面極性基團，組成膜表面電荷（如-OH、-COOH、-SO3H，以及His、Arg、Lys、Asp、Glu中的帶電基團）。化學毒物對膜電荷性質和密度的改變可能會影響到細胞的功能。第二節毒物對細胞鈣穩態的影響一、Ca2+的第二信使作用與細胞鈣穩態神經→神經遞質體液→

激素→

質膜受體→

胞內中間物質介導第一信使第二信使→生理效應細胞鈣穩態（calciumhomeostasis）Ca2+

CaM酶Ca2+，Mg2+-ATP酶肌肉收縮蛋白腺苷酸環化酶磷酸酯酶蛋白激酶離子通道蛋白[Ca2+]=1000μM[Ca2+]=0.1μM細胞“細胞鈣穩態”的維持[Ca2+]=1000μM[Ca2+]=0.1μM鈣泵Ca2+Ca2+鈣通道蛋白質、核苷酸、酸性磷脂內質網線粒體細胞二、毒物對細胞鈣穩態的影響及其危害現已發現多種化學毒物可引起細胞內Ca2+濃度不可控制地升高，從而導致細胞損傷或死亡。細胞鈣穩態紊亂的主要危害：可抑制線粒體內ATP的合成和使氧自由基的生成增加。可引起微管的解聚，進而損傷細胞的正常形態。可激活一系列水解酶，導致體內蛋白質、磷脂和核酸等的水解。細胞骨架結構：細胞骨架細胞核骨架細胞膜骨架細胞質骨架細胞外基質微絲、微管、中間纖維細胞骨架(Cytoskeleton)引自：丁明孝，等《分子細胞生物學》引自：丁明孝，等《分子細胞生物學》引自：丁明孝，等《分子細胞生物學》鈣穩態紊亂的危害—水解損傷：許多膜蛋白是Ca2+激活的中性蛋白酶或鈣蛋白酶的靶分子。鈣蛋白酶介導的肌動蛋白結合蛋白的水解可引起質膜大皰形成；Ca2+對磷脂酶的激活引起膜的破壞；

Ca2+-Mg2+

依賴的核酸內切酶的激活引起染色質的斷裂；

Ca2+濃度升高可封閉拓撲異構酶Ⅱ，使已斷裂的DNA無法重新連接。第三節生物分子的氧化損傷一、自由基概述概念：一般指含有一個或多個未配對電子的離子、原子或分子。性質：①具有順磁性；②化學反應性極強；③生物半減期極短。一、自由基概述類型：①活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS）：

A氧自由基：O2-·、?OH；LO?、LOO?；

B含氧的非自由基衍生物：單線態氧（1O2）、氫過氧化物、次氯酸、過氧化物、內源性脂質和外源化合物的環氧代謝產物。一、自由基概述②其他自由基：碳中心自由基（?CCl3），硫中心自由基（烷硫自由基R-S?），氮中心自由基（苯基二肼自由基C6H5N=N?）；此外，過渡金屬離子Cu+/Cu2+、Fe2+/Fe3+、Ti3+/Ti4+可作為自由基反應的催化劑，在自由基的損傷作用中起重要作用。二、氧化應激（Oxidativestress）自由基來源：外源化學物代謝產生；細胞正常生理過程產生。機體抗氧化系統：非酶類抗氧化系統GSH、Vc、VE、VA、尿酸、牛磺酸和次牛磺酸等；酶類抗氧化系統超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化酶、谷胱甘肽還原酶等。二、氧化應激（Oxidativestress）氧化應激：機體促氧化與抗氧化之間的平衡失調，而傾向于前者，所導致的細胞損傷。“目前多數觀點認為外源因素誘導的細胞氧化應激及隨后啟動信號通路在細胞損傷中發揮重要作用，同時認為氧化應激可同時激活多種信號轉導途徑和核轉錄因子，它們之間相互串話，形成了一個復雜而精細的調控網絡，共同決定氧化損傷最終引起何種生物學效應”。——曹佳，鄭玉新，周宗燦，等.《毒理學研究進展和熱點》，中國科學基金，

2011年，第03期

（一）對脂質的過氧化損傷脂質過氧化損傷：在O2存在下，自由基或其活性衍生物引發脂質過氧化及其鏈式反應。生物膜是生物體內最易發生脂質過氧化的場所。因為它具備脂質過氧化的兩個必要條件：氧氣和PUFA（polyunsaturatedfattyacid）。膜脂質的結構：X=-OH?

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磷脂酸X=-OCH2CH2N+(CH3)3??

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磷脂酰膽堿X=-OCH2CH2NH3+

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磷脂酰乙醇胺X=-OCH2CHCOO－

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磷脂酰絲氨酸H3N+R1、R2：脂酰基的烴基，R1多為飽和烴基，R2常為不飽和烴基。H2CO–C-R1R2-C-OCHH2CO–P-X甘油磷脂通式OOHOO脂質過氧化反應過程：膜脂質（LH）脂質自由基（L?）O2抽氫作用脂質過氧自由基（LOO?）氫過氧化物（LOOH）脂質氧自由基（LO?）Fe3+Fe2+Fenton反應環過氧化物自由基環內過氧化物自由基丙二醛（MDA）+短鏈的酮、羧酸或烴類HO?H2O分子內雙鍵加成過氧化作用LHL?單電子氧化還原：凡是能發生單電子氧化還原的金屬離子（屬于過渡金屬）都可與H2O2反應，使其發生裂解，產生自由基，例如Fenton反應：

Fe2++H2O2Fe3++?OH+OH－除Fe2+外，可氧化為較高價態的過渡金屬還有銅、鈷、鈦等離子。LH+L·鏈啟動鏈擴展脂質（花生四烯酸）過氧化的總過程LHLOOH鏈終止LOOLO2，水解或熱裂＋

其他產物環化作用環內過氧自由基脂質過氧化的其他損害：①脂質過氧化中間產物L·、LOO·、LO·可作為引發劑通過抽氫使蛋白質變成自由基，后者可以引起鏈式反應，導致蛋白質聚合，使蛋白質的運動和功能受到限制。-CO-NH-C-CO-NH-＋-CO-NH-C-C-NH--CO-NH-C-C-NH--CO-NH-C-CO-NH-R1?R2R1R2自由基蛋白A蛋白BHOOH?交聯物脂質過氧化的其他損害：②終產物丙二醛（MDA）可與蛋白質分子中的NH2作用導致多肽鏈的鏈內交聯或鏈間交聯。此外，醛類產物也能與蛋白質中Cys的-SH反應，使蛋白質失去活性。丙二醛與蛋白質分子的交聯：鏈內交聯：CH2C-HC-HOO＋H2NH2NPCH-NHCH=NPCH鏈間交聯：CH2C-HC-HOO＋2P–NH2CH–NH–P1CH=N–P2CH丙二醛蛋白質交聯產物脂質的過氧化損傷小結：直接結果是使膜PUFA減少，膜脂流動性降低和膜骨架損傷；過氧化中間產物和終產物引起的膜蛋白共價交聯與聚合，影響膜蛋白的構象及其運動性，必然導致膜功能的異常。（二）對蛋白質的氧化損傷對蛋白質的氧化損傷，主要是自由基對氨基酸的作用。例如，所有氨基酸殘基均可被?OH損傷，其中以含硫氨基酸和芳香氨基酸最為敏感。（二）對蛋白質的氧化損傷1.含硫氨基酸的損傷?OH可使甲硫氨酸氧化為甲硫氨酸亞砜；使半胱氨酸（Cys）氧化成Cy-S-S-Cy、Cy-SOH及Cy-SO2H。-NH3+CH3SCH2CH-COO－CH2甲硫氨酸CH3SCH2CH--NH–R2R1-C=OCH2含甲硫氨酸的蛋白質?OHO含甲硫氨酸亞砜的蛋白質CH3SCH2CH--NH–R2CH2R1-C=O聚合（二）對蛋白質的氧化損傷2.芳香族與雜環氨基酸殘基的損傷

如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸與組氨酸。經活性氧作用：①Trp的氧化產物為2-、4-、5-、6-或7-羥基色氨酸，甲酰基犬尿氨酸，3-羥基犬尿氨酸或硝基色氨酸。②Tyr轉變為3-、4-二羥基苯丙氨酸，二酪氨酸交聯產物或3-硝基酪氨酸。③Phe轉變為2-、3-或4-羧基苯丙氨酸，2-、3-二羥基苯丙氨酸。④His轉變為2-氧組氨酸。（二）對蛋白質的氧化損傷3.脂肪族氨基酸殘基的損傷

如，Asp、Glu、Pro、Lys、Arg、Leu、Val與Thr。可能的損傷機制：在α-C原子上除去一個氫原子，形成C中心自由基；其上再加O2，生成過氧基衍生物；后者分解成NH3和α-酮酸，或是NH3、CO2與醛類或羧酸，從而破壞相應氨基酸的結構。（二）對蛋白質的氧化損傷4.肽的折斷-NH–CH–CONH–CH–CONH–CH-CR3R1R2-NH–CH–CONH–C?

–CONH–CH-CR3R1R2?OHH2OO2過氧化物肽的折斷（二）對蛋白質的氧化損傷5.蛋白質-蛋白質的交聯蛋白質之間的交聯將形成分子量更大的“分子”，進而限制蛋白質的運動性及其功能。（三）對DNA的氧化損傷1堿基的損傷CCNHNCHHCNNNH2C腺嘌呤CCNHNCHH2N-CHNNOC鳥嘌呤1.對堿基的損傷CCHCNNHC嘧啶CCNHNC-OHH2N-CHNNOC8-羥基鳥嘌呤2.對脫氧核糖的損傷脫氧核糖中的每一個C原子和-OH上的氫都能與?OH反應；在C位置上抽氫、加氧，而破壞戊糖的結構。3.對DNA鏈的損傷HCCHHOH2CCCOHOHHOHH脫氧核糖3.對DNA鏈的損傷DNA鏈斷裂的后果：①可能會造成部分堿基的缺失；②修復的DNA可能存在堿基的錯誤摻入和錯誤編碼；③也可能引起原癌基因的活化或抑癌基因的失活等，從而導致細胞的突變或癌變。（四）對多糖的氧化損傷ROS中活性很強的自由基如?OH可無選擇地攻擊糖類，抽提氫，使其變為碳中心自由基，后者與O2結合成為過氧化物，然后裂解。第四節化學毒物與生物大分子的共價結合一、概述概念：共價結合是指化學毒物或其活性代謝產物與機體內一些重要的生物大分子如核酸、蛋白質等發生共價結合，從而改變這些生物大分子結構或功能的過程。一、概述方式：一般為親電子劑與大分子的親核基團作用，同過共價鍵形成穩定的復合物——加合物，使外源化學物或其代謝產物進入大分子內而成為其中的組成成分，一般用生化或化學手段處理不能使其解離。特點：永久性、不可逆地改變內源性物質的結構。二、與蛋白質的共價結合蛋白質分子中可與外源化學物共價結合的功能基團：①氨基和羧基；②Ser和Thr的羥基；③Cys的巰基；④Arg的胍基；⑤His的咪唑基；⑥Tyr的酚羥基；⑦Trp的吲哚基。1.與白蛋白的共價結合白蛋白是血液和組織間質中的主要蛋白質，也是血液中重要的運輸載體。血清白蛋白由肝細胞合成，而肝臟正是外源化學物活化代謝的主要場所，因而白蛋白更易受到由肝細胞活化形成的親電子劑的攻擊。2.與血紅蛋白的共價結合外源化學物進入血液后，先與紅細胞膜結合，繼而進入細胞與血紅蛋白共價結合。血紅蛋白中參與結合的基團主要有氨基、巰基和芳香胺基團。應用：血紅蛋白加合物可用于人群接觸外源化學物的監測，具有樣品容易獲得，壽命長的優點，方便檢測。3.與組織細胞蛋白質的共價結合與膜蛋白或胞漿蛋白共價結合，將影響到細胞的正常代謝或信號傳遞過程；而與核蛋白的共價結合將對細胞生長、增殖和分化等的調控產生影響。

核蛋白（nuclearprotein）是指在細胞質內合成，然后運輸到核內起作用的一類蛋白質。三、與核酸的共價結合毒物類型：親電性代謝產物為主，親核性代謝產物和自由基也可。結合部位：堿基、核糖或脫氧核糖、磷酸均可，但以堿基損傷的毒理學意義最大。結合后果：細胞突變、癌變及其他一些細胞損傷。應用：一般，DNA加合物一旦形成，致癌過程即已啟動。因此，DNA加合物是一類重要的生物標志物，可用于化學物致癌的早期檢測。四、共價結合的毒理學意義：①加合物是一類重要的生物標志物，可用于反映機體對毒物的接觸、損傷程度；②有助于毒性損傷的早期診斷和防治；③可用于解釋某些化學毒物的中毒作用機制。第五章影響毒性作用的因素第一節毒物因素一、化學結構1.同系物的碳原子數脂肪烴類的毒性主要為麻醉作用。一般隨碳原子數增多，毒性增強；但達到9個碳原子以后，碳原子數增多，毒性作用反而減弱。2.飽和度碳原子數相同時，不飽和鍵增加，毒性增強。一、化學結構3.構型碳原子數相同，一般，毒性：直鏈>支鏈，成環>開環。多取代基：分子對稱的>不對稱的；如，帶兩個取代基的苯環化合物的毒性：對位>鄰位>間位。立體構型：一般，受體或酶只能與一種旋光異構體結合而產生生物效應，故同一化學物的不同旋光異構體的毒性不同。一般L型有生物活性，D型則反之。同分異構體的毒性差異：有機氯農藥六六六，有7種同分異構體，常用的有α、β、γ和δ等。

γ、δ-六六六急性毒性強；

β-六六六慢性毒性大；

α、γ-六六六對中樞神經系統有很強的興奮作用；β、δ-六六六則對中樞神經系統有抑制作用。一、化學結構4.烴基取代非烴類物質中引入烴基，脂溶性增高，易于透過生物膜，毒性將增強。此外，烴基也能增加毒物的空間位阻，而影響其毒性。如，乙酰膽堿在體內易被水解，作用時間較短；但乙酰甲基膽堿水解緩慢，作用也較持久。一、化學結構5.鹵素取代鹵素具有強吸電子能力，結構中引入鹵素，化學物極性將增強，更易與酶結合，使毒性增高。例如，肝毒性：CCl4>CHCl3>CH2Cl2>CH3Cl>CH4。一、化學結構6.羥基芳香族化合物引入羥基，極性增強，毒性增加。如，苯→苯酚。多羥基芳香族化合物毒性更高。脂肪烴引入羥基后，麻醉作用增強，并可損傷肝臟。一、化學結構7.巰基-SH的極性弱于-OH，因此硫醇的脂溶性較高，更易滲入組織；可干擾蛋白質中半胱氨酸和胱氨酸之間的氧化還原作用的平衡。故-SH引入化合物其毒性增強。一、化學結構8.酸基與酯基酸基（如-COOH、-SO3H）引入分子，電離度和水溶性增高，脂溶性降低，難以吸收，毒性降低。酸基酯化后，脂溶性將增高，毒性增大。9.氨基胺具有堿性，易與核酸、蛋白質的酸性基團反應。-NH2引入，毒性將增強。二、物理性質1.溶解性脂溶性高的化學物易通過脂質雙分子層，易在脂肪組織中蓄積，易侵犯神經系統。但是，脂溶性極高的化學物不利于經體液轉運。水溶性高的化合物不易通過生物膜而吸收，較易隨尿排出體外。二、物理性質2.揮發性常溫下揮發性大的液態化學物易形成較大的蒸氣壓，易于經呼吸道吸入。拌飼染毒時應注意，揮發性的化學物加入飼料后可因揮發而減少接觸劑量。二、物理性質3.分散度物質顆粒越小，分散度越大。經口攝入的固態化學物質，其分散度可影響經消化道的吸收率，進而影響其毒性。三、化學物的穩定性和不純物毒物在使用情況下的“不穩定性”可影響其毒性。當待評價化學物不是純品時，須注意其雜質的性質。四、毒物進入機體的途徑1.接