課題3分解纖維素的微生物的分離現在，我們都清醒地認識到，能源危機正在影響著我們每一個人的生活。國際油價不斷攀升，導致物價隨之上漲。為什么石油價格會持續上漲呢？現在，世界上的許多科學家正致力于生物燃料方面的研究。目前，第一代生物燃料以食用作物為原料，主要包括玉米、大豆、甘蔗，用可食用作物制造生物燃料是最簡單可行的，因為把這些可食用作物轉化為燃料的技術是現成的。然而，第一代生物燃料并非長久之計，原因很簡單：沒有足夠的耕地能夠滿足制造生物燃料的原料需求。

第二代生物燃料主要以纖維素為原料。富含纖維素的原料有很多：木材廢料（鋸木屑、木質建筑殘片）、農業廢棄物（各種植物秸稈）、雜草等。這些作物耕作成本低、量大，更關鍵的是，這些作物的種植生產不會干擾和危及糧食生產。這些作物大多數能夠在不能用作農田的邊際土地上快速生長。還有一些能夠在被廢水或者重金屬污染的土壤中生長并凈化土壤，如生長周期較短的灌木柳樹。一.基礎知識㈠.纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物。思考：纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，植物每年產生的纖維素超過70億噸，但卻不會在地球上大量的積累，為什么？

纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。2.纖維素酶

纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素①取二支20mL的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8、物質的量濃度為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結果：乙試管的濾紙條消失本實驗的自變量是纖維素酶的有無，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pH。實驗分析：本實驗的實驗變量是什么？是如何設置對照的？㈡.纖維素分解細菌的篩選：1.方法：剛果紅染色法。

剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶分解后，紅色復合物無法形成，出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。2.原理：該方法可以通過顏色反應直接篩選。3.優點：二.實驗設計與操作㈠.實驗設計：土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上挑選產生透明圈的菌落①分布環境1、土壤取樣：富含纖維素的環境中由于生物適應一定的環境，環境對生物有選擇作用，在富含纖維素的環境中，纖維素分解菌的含量相對較高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環境。②為什么要在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌？(旁欄思考)③實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋在土壤中多深？答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環境。一般應將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。2、選擇培養

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：分析書本P29纖維素分解菌的選擇培養基配方，回答問題。答：用牛肉膏蛋白胨培養基與之對照，或者將纖維素改為葡萄糖，菌落明顯增多。或接種不分解纖維素的細菌。②思考：A、旁欄中的配方是液體培養基還是固體培養基？為什么？答：是液體培養基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？答：具有選擇作用，本配方中以纖維素作為唯一碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養基的作用。

稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養1～2d，至培養基變混濁。吸取一定的培養液（約5mL），轉移至另一瓶新鮮的選擇培養基中，以同樣的方法培養到培養液變渾濁。③操作：提示：在選擇培養的條件下，可以使那些能夠適應這種營養條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。〖旁欄思考題〗為什么選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物？按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養后的培養基進行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上⑴制備鑒別培養基:配方見書本29頁。操作過程見課題1（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的細菌

懸液各取0.1ml涂布到平板培養基上，在30℃的條件下倒置培養。5.剛果紅染色法方法一：先

，再加入剛果紅進行顏色反應。方法二：在

時就加入剛果紅。培養微生物倒平板方法一中NaCl溶液的作用？過程見書〖旁欄思考題〗這兩種方法各有哪些優點與不足？顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題1.產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素（剛果紅），形成明顯的透明圈。挑選產生明顯的透明圈的菌落，并接種到纖維素分解菌的選擇培養基上，在300C－370C培養，可獲得純凈培養物。6、純化培養四、課題延伸

為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵產纖維素酶的實驗，纖維素的發酵方法有________和_________。纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的_______進行定量的測定。葡萄糖液體發酵固體發酵提示：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養基上，直接分離得到菌落。本課題先通過選擇培養，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在鑒別培養基上。其他步驟基本一致。〖旁欄思考題〗本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？課題成果評價

（一）培養基的制作是否合格以及選擇培養基是否篩選出菌落：對照的培養基在培養過程中沒有菌落生長則說明培養基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物（二）分離的結果是否一致：

由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環境不同，學生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。練習1、在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學觀點？（）A、生物結構與功能相適應的觀點B、生物結構與功能整體性觀點C、生物與環境相適應的觀點D、生物發展進化的觀點2、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（）①土壤取樣②梯度稀釋③選擇培養④菌懸液涂布平板⑤挑選出單個菌落A、①②③④⑤B、①③②④⑤C、①②④③⑤D、①④②③⑤3、有關選擇培養正確的敘述是（）A、可以增加纖維素分解菌的濃度B、可以減少纖維素分解菌的濃度C、所用培養基是固體培養基D、所用培養基是平板培養基CBA4.培養流感病毒時，應選用()A．固體培養基

B．含有多種無機鹽的培養液C．活的雞胚

D．無菌的牛肉湯5．微生物（除病毒外）需要從外界吸收營養物質并通過代謝來維持正常的生長和繁殖。下列有關微生物營養的說法正確的是()A．乳酸菌與硝化細菌所利用的碳源物質是相同的

B．微生物生長中不可缺少的一些微量的無機物稱為生長因子

C．培養基中的營養物質濃度越高對微生物的增殖越有利D．生長因子一般是酶或核酸的組成成分，微生物本身合成這些生長因子的能力往往不足CD6．在接種操作的過程中，不正確的是()A．要將接種環灼燒滅菌

B．取下棉塞后要將試管口灼燒滅菌C．將接種環伸入試管內，先接觸長菌多的部位

D．接種后還要將管口滅菌加塞7．高壓蒸氣滅菌的原理是()A．高壓使細菌DNA變性

B．高壓使細菌蛋白質凝固變性C．高溫燙死細菌

D．高溫使細菌DNA變性CB8．下列屬于菌落特征的是…………()①菌落的形狀②菌落的大小③菌落的多少④隆起程度⑤顏色⑥有無莢膜

A．①②③④B．①②④⑤

C．②③④⑥D．①②③④⑤⑥9．能排除培養基是否有雜菌污染的方法是……()A．將未接種的培養基放在實驗桌上培養B．將未接種的培養基放在窗臺上培養C．將未接種的培養基放在恒溫箱中培養D．將已接種的培養基放在恒溫箱中培養BC10、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(1)培養基中加入化合物A的目的是篩選

，這種培養基屬于

培養基。目的菌

選擇性

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養基中的

，實驗需要振蕩培養，由此推測“目的菌”的代謝類型是

。化合物A異養需氧某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(3)培養若干天后，應選擇培養瓶中化合物A含量

的培養液，接入新的培養液中連續培養，使“目的菌”的數量

。

減少

增加

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(4)轉為固體培養時，常采用

方法接種，獲得單菌落后繼續篩選。

劃線某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(5)實驗結束后，使用過的培養基應該進行

處理后，才能倒掉。

滅菌根據用途分選擇培養基——在培養基中加入某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長鑒別培養基——在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物。例如：伊紅和美藍,和大腸桿菌的代謝產物結合,使菌落呈黑色（老教材說法：深紫色,帶有金屬光澤）,鑒別大腸桿菌方法一中NaCl溶液的作用？

漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產生纖維素