利用轉錄組學和蛋白組學技術研究乳酸菌脅迫條件下自身應答機制郝彥玲副教授

食品科學與營養工程學院

2013年9月30日

食品微生物專題

轉錄組（transcriptome）：廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。1、轉錄組學測序技術介紹基因組（genome）：指的是細胞或生物體中所有的DNA，包括所有的基因和基因間隔區。

轉錄組具有時空特異性FromSangertoNextGenerationSequencing2、蛋白組學技術的介紹

蛋白質組(Proteome)：指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。蛋白質雙向電泳技術(2D-Gel)

熒光差異凝膠電泳技術（2D-DIGE）

iTRAQ技術蛋白質雙向電泳技術：是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后在垂直的方向再進行SDS（按照分子大小），經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。優點：雙向電泳技術具有很好的分辨率和靈敏度，可以同時顯示組織或細胞內各種蛋白，高分辨率確保蛋白質最大程度的分離。缺點：重復性是很不理想。高重復性有利于凝膠間的對比。

熒光差異凝膠電泳技術（2D-DIGE）采用專有的熒光染料與多重樣本和圖象分析的方法，在同一塊膠上可同時分離多個由不同熒光標記的樣品。

iTRAQ技術Whenchallengedwithbile,bacteriaareknowntomodifytheircellenvelopepropertiessuchascellmembranefattyacidcomposition,peptidoglycancompositionandmembranecharge.Exposuretobileisaseriouschallengetotheviabilityofprobioticsbecausetheconcentrationofbileacidsinthehumansmallintestinetypicallyvariesbetween0.2and2%Bilestresscanalsocausedeleteriouseffects,includingproteinmisfoldinganddenaturation,DNAdamage,secondarystructureformationinRNA,andintracellularacidification.14and22spotsweresignificantlyoverexpressedatthe0.6g/Land1.2g/Lbilesalts.Only4spotsweresignificantlydown-regulatedatthebothconcentrations.3spotswereonlydetectedonlywhenbilesaltswereaddedtothemedium.Oxbileextractpromotesinductionofgeneralstressresponseproteinsthematurationofnewlysynthesizedproteins,refoldinganddegradationofdenaturedproteinsandDNArepairs,suchasGroELandDnaK（2）Severalenzymesinvolvedincarbohydratecatabolism,includingthekeyenzymeoftheso-calledbifidobacterialshunt,areoverexpressedincellsgrowninthepresenceofbilesalts（4）Regulationbybilesaltsofproteinsinvolvedintranscription,translation,andmetabolismofaminoacidsandnucleotides.（3）生理指標的檢測：Endmetabolicproducts（lactate,acetateandformate）andF6PPKweredetected.利用2-Dgel結合實時定量進行研究，創新點是推測出丙酮酸的代謝流向飽和脂肪酸，從而增強了膜的rigidityandimpermeability.轉錄組：基因芯片技術蛋白質組：2D-DIGE技術在0.2%的oxgal中培養，316基因，42個蛋白質發生顯著變化。2011：

ResultsandDiscussion（1）GGAltercellsurfacepropertiesandexpressionmultipleABC-typemultidrugtransporterinresponsetobile.（2）Two-componentregulatorysystemsandbilesalthydrolasemodulatecellularresponsetobile（3）BileinducescommonstressresponseinGG.

（4）Bileaffectscentralmetabolicprocesses典型文章實驗手段：DNA芯片和實時定量PCR。推測結果：通過轉錄組發現Genesencodingthreetransportsystemsbelongingtothemajorfacilitatorsuperfamily(MFS),Bbr_0838,Bbr_0832,andBbr_1756,andthreeABC-typetransporters,Bbr_0406-0407,Bbr_1804-1805,andBbr_1826-1827在膽鹽脅迫下表達水平發生顯著變化，推測可能參與膽鹽脅迫。創新點：利用膽鹽缺陷型的L.lactisNZ9000lmrCD作為宿主，通過異源表達證明其參與膽鹽抗性。問題：酸奶對人體具有重要的益生保健功能，但是后酸化是制約酸奶行業發展的主要問題。原因：當pH值從6.5下降到5.5時，嗜熱鏈球菌的生長逐漸減慢，pH值下降到5.0后，保加利亞乳桿菌控制了酸奶的發酵（郭清泉等，2001）。

立題的背景

后酸化：酸奶在正常發酵結束后的貯存、運輸和銷售過程中，發酵微生物的繼續生長會導致產品pH值持續降低，進而發生后酸化現象（徐成勇等，2006）

乳酸菌酸耐受機制的研究進展質子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）谷氨酸脫羧酶途徑GAD

（Sandersetal.,1998）精氨酸脫氨酶途徑ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）應激蛋白和分子伴侶蛋白（Hartkeetal.,1996；

Coxetal.,2000）改變細胞膜的脂肪酸構成（CotterandHill,2003）（CotterandHill,2003）保加利亞乳桿菌的酸耐受機制的特殊性對保加利亞乳桿菌全基因組序列的分析表明,僅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH調節相關的基因，如ADI途徑中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途徑中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）保加利亞乳桿菌的酸適應機制研究情況利用蛋白組學技術研究保加利亞乳桿菌經低pH誘導后的全蛋白表達情況如，

Limetal.,2000；

Fernandezetal.,2008；Streitetal.,2008利用反轉錄和實時定量PCR的方法，考察保加利亞乳桿菌中酸耐受相關基因的轉錄水平變化如，

Penaudetal.,2006中發現酸處理后銅離子轉運蛋白CPX-TypeATPase的Ldb0660和Ldb1239基因大幅上調對于保加利亞乳桿菌感受環境壓力并作出適應性調節這一過程的分子調控機制缺少系統性的研究2.研究目的及意義本課題擬采用蛋白組學、RT-qPCR、乳酸乳球菌表達系統、細菌單雜交和EMSA等分子生物學技術，對酸脅迫反應中的關鍵基因進行分離鑒定及功能研究。進一步揭示保加利亞乳桿菌酸耐受機制；為制備弱后酸化的保加利亞乳桿菌奠定基礎；為開發具有自主知識產權的酸奶發酵劑提供理論依據。3.研究內容134蛋白組學方法分析保加利亞乳桿菌應對酸脅迫過程中的差異表達蛋白細菌單雜交和EMSA實驗分析抗酸脅迫中新轉錄因子Ldb0667的功能2RT-qPCR分析差異基因轉錄水平的變化提出保加利亞乳桿菌酸耐受模型4.研究結果SurvivalofL.bulgaricusCAUH1afteracidadaptation.Acidadapted(40minattheindicatedpH)andcontrol(pH6.5)samplesweresubjectedtoanacidchallenge(60minatpH3.7).OD600

nm=

～0.4pH4.8,40min--700倍確定酸脅迫處理條件：致死處理條件：pH3.7,60min蛋白質雙向電泳處理組對照組47pI47pIMW10904020MW10904020平均每塊膠得到644個蛋白點，經ImageMaster2DPlatinumsoftware

分析，選取變化幅度大于1.5倍的蛋白點41個進行質譜鑒定Results

通過MALDI-TOF/TOF二級質譜鑒定了27個差異蛋白（17個上調，10個下調），利用NCBIBLAST、KEGG等數據庫，確定其功能和參與的代謝途徑糖類代謝:10proteins(GlcK,Eno,Pyk,GpmA,GpmB,Gap,Ack,Gpd,XfpandPgl)核苷酸代謝:3proteins(PyrG,CmkandPurR)翻譯過程:7proteins(Tuf,FusA,TypA,Der,RplM,RpsSandRpsA)氨基酸代謝:2proteins(PepO1andPepN)脅迫反應:1

proteins(ClpC)未知功能:proteins(RnjA,Ldb0677andPthA)蛋白點質譜鑒定結果蛋白點質譜鑒定結果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR糖酵解途徑K144561.823.14glcKGlucokinase（葡萄糖激酶）YP_618316.1K226643.7229.86Ldb1036Fructose-2,6-bisphosphatase（果糖-2,6-二磷酸酶）YP_619006.1M15596-1.85-14.42gapGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（3-磷酸甘油醛脫氫酶）YP_618713.1M236141.8313.45enoEnolase（烯醇化酶）YP_619161.1L111751.8610.78pykPyruvatekinase（丙酮酸激酶）YP_618880.1K45801.595.10gpmAPhosphoglyceratemutase（磷酸甘油酸變位酶）YP_618404.1L6304-1.61-22.32ackAcetatekinase（乙酸激酶）YP_618754.1戊糖磷酸途徑M12180-1.51-6.68gpdGAPDH（磷酸葡萄糖脫氫酶）YP_619397.1M2110-1.53-24.76Ldb0534phosphoketolase（磷酸酮醇酶）YP_618635.1K103821.704.92Ldb0588putative3-carboxymuconatecyclaseYP_618678蛋白點質譜鑒定結果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR伴侶蛋白L47-2.04-13.45clpCATP-bindingsubunitClpCgb|EGD26863.1|核苷酸代謝K375-1.48-20.25pyrGCtpsynthase（CTP合成酶）YP_004033330.1M175431.5123.43Ldb0774Cytidylatekinase（胞苷酸激酶）YP_812822.1L13554-1.62-21.86purRPuroperonrepressor（pur操縱子阻遏蛋白）YP_812402.1肽類降解M2641.6218.90pep01Endopeptidase（肽鏈內切酶）YP_618394.1M203271.509.97pepNAminopeptidaseN（氨肽酶N）YP_619704.1轉錄-翻譯相關K247472.7323.75tufPutativeelongationfactorTuYP_618840.1M13561.885.66fusAElongationfactorGYP_618520.1N175131.47fusAElongationfactorGYP_618520.1K9142-1.74-13.55engAGTP-bindingproteinEngAYP_618891.1K113201.542.69typAGTP-bindingproteinTypAYP_618827.1

蛋白點質譜鑒定結果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR核糖體蛋白M137941.762.18rplM50SribosomalproteinL13YP_812477.1K19533-1.52-10.93rpsA30Sribosomalprotei