首例胚胎移植成功首創動物組織體外培養法發現哺乳動物精子獲能現象體細胞核移植成功試管家兔誕生創立單克隆抗體技術胚胎分割移植成功分離和培養小鼠胚胎干細胞克隆羊多莉誕生獲得誘導多能干細胞單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生我國科學家首次培育了體細胞克隆猴1959年1890年1907年1951年1958年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年動物細胞工程的發展歷程科技探索之路克隆猴：中中和華華克隆皮膚單克隆抗體第2節動物細胞工程動物細胞工程常用的技術有哪些？動物細胞培養、動物細胞融合、動物細胞核移植。動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎。人造皮膚：人體再生術的秘密植物組織培養是指將離體的植物器官、組織或細胞等，培養在人工配制的培養基上，給予適宜的培養條件，誘導其形成完整植株的技術。知識回顧：什么是植物組織培養？就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖的技術一、動物細胞培養1.概念：動物體組織單個細胞細胞生長和增殖取出分散適宜條件2.原理：3.地位：動物細胞工程的基礎細胞增殖<>動物細胞培養所需基本條件其他條件營養條件糖類、氨基酸無機鹽、維生素……無菌、無毒的環境適宜溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環境二、動物細胞培養條件（1）營養條件：①合成培養基：將細胞所需的營養物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養基稱為合成培養基。②血清、血漿等一些天然成分：由于人們對細胞所需的營養物質尚未全部研究清楚③培養基類型：一般使用液體培養基，也稱為培養液為什么對動物細胞進行培養時通常要添加血清？血清中含有多種維持細胞代謝和生長的物質，如蛋白質、氨基酸、未知的促細胞生長因子等。（2）無菌、無毒的環境：①對培養液和所有培養用具進行滅菌處理②在無菌環境下進行操作可根據實際情況適量添加抗生素，防止培養過程中微生物的污染。③培養液需要定期更換：

以便清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。注意說明（3）溫度、pH和滲透壓：①適宜的溫度：哺乳動物細胞培養的溫度多以___________為宜；36.5±0.5℃②適宜的pH：多數動物細胞生存的適宜pH為________7.2-7.4③適宜的滲透壓：維持細胞正常的形態和功能（4）氣體環境：①氣體的組成及作用：O2：CO2：細胞代謝所必需維持培養液的pH②容器：通常采用培養皿或松蓋培養瓶。③儀器：置于含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養箱中進行培養。傳代培養取動物組織制成細胞懸液原代培養放入CO2培養箱中培養放入CO2培養箱中培養用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細胞三、動物細胞培養過程取動物組織用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理單個細胞加培養液細胞懸液原代培養（10代以內）在培養皿或培養瓶中傳代培養（10代-50代）

細胞分化程度低，分裂能力強，容易培養（1）選材原因：（2）培養前為什么分散成單個細胞？分散成單個細胞擴大了細胞與培養液的接觸面積，利于細胞吸收營養和排出代謝廢物。（3）胰蛋白酶的作用?胃蛋白酶可以嗎？理由。將動物組織細胞間的蛋白質成分酶解，使細胞分散開，獲得單個細胞不可以(4)在用胰蛋白酶處理組織時應注意什么？

細胞膜含有蛋白質，長時間處理會損傷細胞，要控制好時間。分瓶（幼齡動物的組織器官）胃蛋白酶作用的適宜pH約為1.5，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性，多數動物細胞培養的適宜pH為7.2-7.4，胃蛋白酶在此環境中沒有活性，（5）體外培養的動物生長類型①懸浮生長類：能夠懸浮在培養液中生長增殖。會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻。②貼壁生長類：大多數體外培養的細胞需要貼附于某些基質表面才能生長增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上，這種現象稱為細胞貼壁。除受密度、有害代謝物、營養物質影響外，還會發生接觸抑制現象。接觸抑制——當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂。圓球形細胞剛開始鋪展貼壁生長（100×）培養的動物細胞貼壁生長,并進行有絲分裂（100×）細胞單層貼壁生長鋪滿瓶壁后,出現接觸抑制（100×）由于細胞之間有接觸抑制的特性，一般的正常細胞并不重疊于其他細胞之上生長，而是單層生長。癌細胞由于無接觸抑制而能夠繼續移動和增殖，可以形成多層細胞。是否接觸抑制可作為區別正常細胞與癌細胞的標志之一。接觸抑制——當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂。①收集細胞a.懸浮生長類：直接用離心法收集b.貼壁生長類：重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集。②將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養（7）分瓶培養的步驟：（6）動物組織分散后初次培養，將分瓶之前的細胞培養，稱為__________；細胞懸液培養一段時間后，分瓶后再進行的細胞培養，稱為__________。原代培養傳代培養1．細胞貼壁和接觸抑制比較(1)細胞貼壁：將細胞懸液放入培養瓶內，置于適宜環境中培養，懸液中分散的大多數細胞需要貼附于某些基質表面才能生長增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上，這種現象稱為細胞貼壁。(2)接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。2．原代培養和傳代培養比較(1)第一次：用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，對動物組織進行處理，使其分散成單個細胞后進行初次培養，稱為原代培養。(2)第二次：細胞培養過程中出現接觸抑制，用胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來，然后，將其分散到多個培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。

【歸納提升】思考：正常細胞能否一直傳代培養下去？

不可以；細胞的傳代培養一般傳至10代后就不易傳下去，這時細胞能保持細胞正常的二倍體核型；傳至10-50代左右時，增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止，這時部分細胞的細胞核型可能會發生變化，這一階段的細胞稱為細胞株；繼續傳代培養時，少部分細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細胞已經發生了突變，正在朝著等同于癌細胞的方向發展，這一階段的細胞稱為細胞系，細胞系的遺傳物質一定改變了；細胞株（10-50代）遺傳物質一般沒變。細胞系（50代-）遺傳物質一定改變。取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞懸浮生長貼壁生長(大多數）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養物質缺乏等接觸抑制傳代培養細胞懸液解決原代培養分瓶培養加培養液在培養皿或培養瓶內懸浮培養的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:先分散，后離心法收集細胞分裂受阻①收集細胞總結:動物細胞培養過程②制成細胞懸液，分瓶培養【檢測】完成下列問題：1.過程①處理方法有:_____________________。2.過程②為_____________________________3.培養的動物細胞有兩類:①懸浮在_______中生長增殖;②___________________生長增殖。4.過程③為_____培養,進行過程③的原因主要有:細胞密度過大、___________積累、_________缺乏和接觸抑制等。5.進行過程③時,懸浮培養的細胞直接用_______收集;貼壁細胞需要使用_________等處理,然后用_______收集。機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法轉入培養液中進行原代培養培養液貼附于某些基質表面離心法胰蛋白酶離心法傳代有害代謝物營養物質比較項目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養結果是否體現全能性培養目的相同點討論：植物組織培養和動物細胞培養的比較獲得細胞或細胞產物常用固體培養基植物體葡萄糖、動物血清常用液體培養基細胞增殖細胞的全能性許多細胞快速繁殖蔗糖、植物激素1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂；2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件是否植物組織培養和動物細胞培養比較(1)植物組織培養過程中存在脫分化和再分化，而動物細胞培養過程中沒有脫分化和再分化過程。(2)植物組織培養可獲得新個體，體現了細胞的全能性，而動物細胞培養只能得到細胞，沒有體現細胞的全能性。(3)兩種技術手段在培養過程中都進行了有絲分裂，不涉及減數分裂，都可稱為克隆。【典例1】如圖所示為動物細胞培養的基本過程，下列關于甲、乙、丙、丁四個操作過程的敘述，正確的是(

)CA.甲過程可選取動物個體的任何組織細胞B.乙過程可用纖維素酶和果膠酶處理細胞C.丙過程所用培養液中需添加動物血清D.丁過程中的細胞因接觸抑制而大量死亡1.干細胞的概念：

動物和人體內仍保留的少數具有分裂和分化能力的細胞。具發育全能性。在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。2.干細胞的分布：干細胞存在于_________、_____和_______等多種組織和器官中；早期胚胎骨髓臍帶血3.干細胞的分類：包括胚胎干細胞和成體干細胞等。（1）胚胎干細胞（簡稱ES細胞）①分布：存在于________中早期胚胎②特點：

具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能③應用實例：ES細胞在體外分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等四、干細胞培養及其應用也叫全能干細胞。①分布：存在于

中成體組織或器官內②舉例：③特點：

一般認為，成體干細胞具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力。（2）成體干細胞A.造血干細胞：存在于成體骨髓、外周血、臍帶血，可分化成各種

血細胞和免疫細胞。也叫做多能干細胞。B.

神經干細胞：取自神經系統，可分化成神經細胞。C.

精原干細胞：取自睪丸，可分化成精子。專能干細胞類型應用造血干細胞神經干細胞誘導多能干細胞（iPS細胞）有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發育、再生和修復等密切相關。治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展干細胞應用面臨的問題存在存在著導致腫瘤發生的風險。4.應用③誘導多能干細胞優點：A.誘導過程無需破壞胚胎。B.iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥反應。5.誘導多能干細胞（iPS細胞）①概念：

通過體外誘導小鼠成纖維細胞，獲得了類似胚胎干細胞的一種細胞，稱為誘導多能干細胞，簡稱iPS細胞。②誘導方法：①將特定基因或特定蛋白導入細胞（成纖維細胞以及已分化的T細胞、B細胞均可）；②用小分子化合物誘導形成。④誘導多能干細胞的應用：移植取成纖維細胞等iPS細胞轉入相關因子細胞發生轉化分化胰島細胞神經元血細胞腸上皮細胞心肌細胞肝細胞病人iPS細胞用于治療人類疾病示意圖取成纖維細胞轉入相關因子細胞轉化為iPS細胞誘導iPS細胞定向分化為多種組織細胞移植回病人體內動物