常規PCR引物設計實例分析武漢東湖學院生命科學與化學學院涂毅主要內容一、PCR及引物設計的一般原則二、常用的引物設計軟件三、引物設計流程四、實例分析五、使用Primer–BLAST工具快速設計引物一、PCR及引物設計的一般原則聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR引物設計引物設計是PCR技術中至關重要的一環。使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗，表現為：擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。引物設計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。如引物長度（primerlength），產物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發夾結構（duplexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發效率，引物及產物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。具體因素一般原則1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應大于38。引物過短又同時會引起錯配現象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3x109/412=200).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個.較長的引物（28-35bp)一般是用來區分同源性較高的模板序列或者使用于產生一些突變位點.Tm值的計算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對于長一些的引物可用更為準確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）一般原則2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。

一般原則3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。（能值越高越容易結合）一般原則6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。

一般原則7.引物二級結構對PCR反應的影響。盡可能少的引物二聚體。

二、常用的引物設計軟件Oligo7（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer-BLAST（在線服務）*三、引物設計流程序列查找和下載序列同源性比較引物設計與篩選引物加工與修飾引物評價分析引物二次篩選引物最終評估擴增基因：BPMVRNA2鏈上的CP基因片段。實驗目的：根據RNA2中的CP基因序列的保守區域設計特異性引物，然后進行PCR實驗，以此來檢測BPMV在樣品材料中的存在情況。四、

實例分析研究背景：菜豆莢斑駁病毒（BPMV）

具有大小分別為41kDa和22kDa的兩種外殼蛋白（coatprotein，cp），由RNA2鏈編碼，CP基因序列相對保守，可對此進行PCR擴增來檢測BPMV。☆酶聯免疫方法檢測的是表面指標，只能提供間接證據，而PCR技術直接檢測的是核酸，適用于病毒密度很低的臨床標本檢測軟件資源BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)站點:

/BLAST/PrimerPrimier、Oligo下載：

/q2.htmlDNAMAN下載/?Go=Show::List&ID=125704.1在NCBI上查找BPMV的相關序列4.2BLAST同源序列（相似性序列）查找登陸ncbi的blast主頁搜索核苷酸數據庫使用核苷酸查詢搜索蛋白質數據庫用蛋白查詢搜索蛋白質數據庫，使用一個翻譯的核苷酸查詢搜索翻譯的核苷酸數據庫使用的一種蛋白質查詢搜索翻譯核苷酸數據庫，使用一個翻譯的核苷酸查詢會彈出一個頁面有10秒鐘的更新提示圖形示意結果24匹配序列描述帶有genbank的鏈接，點擊可以進入相應的genbank序列匹配情況，分值，e值具體匹配情況將四條序列保存在一個txt文檔中4.3DNAMAN同源序列比對獲取保守區域4.4PrimerPrimier引物設計與篩選4.5Oligo引物的評價分析Ctrl+O打開序列顯示引物的位置和長度選擇的引物左右拖動到引物的位置點擊Change–CurrentOligoLength，更改引物的長度（默認為21）移動這個標尺到引物起始的地方此處會顯示你選擇的引物的位置，可通過點擊下面的標尺進行調整引物的Tm值在72℃左右最佳；合理的Tm值應在60~75℃，退火溫度比Tm低5℃；上下游引物的Tm差不應超過5℃。GC%應在40~60%可見此對引物的Tm值不符合要求，可考慮在5’端加幾個G或C，再做分析。找到上下游引物的位置后，點擊Analyze–PCR使用Oligo7自帶的引物設計功能搜索引物點擊Search–forPrimers&Probes使用默認參數雙擊第一條結果這是對此引物的PCR反應的歸納，最具有參考價值。而且沒有Comments，說明這個結果可以被接受。Oligo的引物搜索結果先檢查各條結果的產物序列是否位于保守區！切換到Sequence窗口，中間一個框顯示了選擇的正反引物的位置和長度，點擊i標志3’ΔG的絕對值不要超過9，否則會在錯配點形成雙鏈接下來進行引物具體分析。點擊Analyze分析二聚體和發夾結構點擊Analyze–DuplexFormation–ForwardPrimer發夾結構要求ΔG小于4.5，配對堿基對不超過3上游引物間形成二聚體要求ΔG小于4.5，配對堿基對不超過3下游引物的二聚體和發夾結構分析堿基組成和Tm值點擊Analyze–Composition&Tm–ForwardPrimer不同算法得到的Tm值要在50~70℃GC%要在40%~60%下游引物的Tm值和GC%，與上游引物不能相差太大。分析錯誤引發位點點擊Analyze–FalsePrimingSites–ForwardPrimer一般，錯誤引發效率應在100以下。若正確引發效率大于400，該值可適當放寬。這里是可以接受的。正確引發效率為437（超過閾值）下游引物的錯誤引發效率通過上述分析，引物評價完成。將結果保存。將篩選出來的引物逐個在Oligo7軟件中評估。點擊Edit–ForwardPrimer，編輯上游引物。可以在5’端前添加G或C以提高Tm值，或加入酶切位點，然后再做Analyze。決定后，將該引物選中，Ctrl+C、Ctrl+V粘貼：GCCAGTTCTGATATTTACACC同理，編輯并保存下游引物下游引物：AATGAAATCCAGTACGCTTC，方向默認是5’→3’4.6引物的二次篩選引物確定后，要在數據庫中進行BLAST比對。注意：該病毒基因組中CP基因之外的其它基因是否也能和引物匹配；該病毒寄主（菜豆）基因組是否有和引物匹配的片段（因為有時病毒存在于寄主中，因而擴增的模板就包含兩個物種的基因組）。如果是，就要棄掉這樣的引物，以防止PCR出現非特異性擴增。1、進入網頁：/BLAST/

2、點擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項3、進入blastn界面GCCAGTTCTGATATTTACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATGAAATCCAGTACGCTTC（1）輸入上下游引物序列，都從5→3，中間用20個以上的N隔開Others（2）在Database選中Others數據庫SomewhatsimilarsequencesShowresultsinanewwindow打鉤AlgorithmparametersExpectthresholdWordsizeExpect值越高，匹配到的結果序列越多Word-size，字長。BLAST的字長缺省值為11，即BLASTN將掃描數據庫，直到發現那些與未知序列的11個連續堿基完全匹配的11個連續堿基長度片段為止。降低字長能增加搜索到的結果。基因找到了目的基因，可見引物的正確性沒有問題。五、使用Primer–BLAST工具快速設計引物Primer–BLAST為NCBI開發的一款引物在線設計工具，將引物設計和序列比對一步完成，從而快速篩選獲得的引物。上傳模板序列如果你已經設計好了引物，可以來驗證引物的好壞。這里是引物設計，所以不用填對上傳的模板序列返回10對引物設定Tm值選擇引物比對的數據庫和物種搜索的結果對每對引物進行分析后，根據實驗需求選擇合適的引物用于合成，然后進行PCR。注意：在選擇數據庫時，BLAST提供了4種數據庫：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前兩個數據庫是經過專家注釋的數據，這樣可以給出更準確的結果。一些Tips

1，在任何時候都要優先使用參考序列的Gi號或Accession號（盡量不要Fasta格式的序列）。另外，確保你的序列是最新版本的（在填AccessionNumber時后面不加版本號就會自動拿最新的序列）2，就算你對整個序列的某部分感興趣（如某條染色體上的某個區域），你也應該優化使用Gi號或Accession號（Primer-BLAST有參數可以設置設計引物的范圍，”Form-To”）。因為用Gi號或Accession號，NCBI會自動讀取該序列的一些注釋數據，對引物的設計更加有利。3，盡量使用沒有冗除的數據庫（如refseq_rna或genomedatabase），nr數據庫包括了太多的冗除的序列，會干擾引物的設計。4，請指定一個或幾個PCR擴增的目標物種。如果不指定在所有的物種搜索，將會使程序變得很慢，引物的結果也會受其它不相關的物種影響。小結一、引物設計流程（1）序列查找和下載GenBank數據庫（2）同源性比較獲取高度保守的序列，PCR引物應位于其中（3）引物設計與篩選PrimerPremier、Oligo、Primer-BLAST小結一、引物設計流程（4）引物加工與修飾酶切位點、特異性標簽（5）引物評價分析Oligo（6）引物二次篩選BLAST（7）進行PCR實驗做最終評估小結二、引物設計原則（1）引物長度18~27bp（2）引物特異性引物應位于保守區內（做模板同源性比對）（3）引物堿基分布3’端避免出現GGG、CCC，末端避免出現A小結二、引物設計原則（4）引