植物病理學基礎研究方法

（第6章第2節)分子生物學技術在植物病原物鑒定、檢測中的應用2/5/2023

吉林農業大學

1第二節分子生物學技術在植物病原物鑒定、檢測中的應用分子生物學技術已經應用于一切生物學領域。在植物病理學研究中已應用于植物病原物的鑒定、檢測，抗病基因的克隆以及抗病轉基因植物的培育中。本節中主要學習應用PCR及相關技術進行植物病原物的鑒定、檢測等問題。2/5/2023

吉林農業大學

2第二節分子生物學技術在植物病原物鑒定、檢測中的應用一.PCR（聚合酶鏈反應）技術（一）PCR的原理（二）PCR技術的操作（三）PCR技術的發展（四）PCR技術在植物病理學中的應用二.RAPD方法與SCAR標記三.RFLP和AFLP技術四.核酸序列分析2/5/2023

吉林農業大學

3一.PCR（聚合酶鏈反應）技術PCR（polymerasechainreaction）技術，即“聚合酶鏈反應”，是體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，由美國科學家Mullis于1983～1985年發明。該技術模擬發生于生物細胞內的DNA復制過程，無需繁瑣的基因克隆程序便可在數小時內獲得大量拷貝的特異DNA片段，其步驟簡便，結果可靠，為研究和分析基因提供了一種全新的方法，被譽為分子生物學技術上的一場革命，在生物學各個領域都得到廣泛的應用。Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。2/5/2023

吉林農業大學

4（一）PCR的原理PCR的原理與體內DNA復制的過程相似，它模擬DNA聚合酶在生物體內的催化作用，在體外進行特異DNA序列的聚合和擴增。2/5/2023

吉林農業大學

5生物體內DNA分子的結構和復制2/5/2023

吉林農業大學

6DNA的結構2/5/2023

吉林農業大學

7DNA的結構:4種脫氧核苷酸組成ATGCATGC氫鍵磷酸二酯鍵3‵-OH3‵-OH3‵-OH使dNTP依次連接磷酸脫氧核糖2/5/2023

吉林農業大學

8DNA復制的方向：新鏈只能從5’端′→3’端′5’端和3’端：磷酸基團的末端稱為5’端。DNA的核糖的羥基末端稱為3’端。3‵-OH使dNTP依次聚合2/5/2023

吉林農業大學

9DNA復制的酶學底物:dNTP

即dTTP

dATP

dCTP

dGTP酶:DNA聚合酶(polymerase),

拓撲異構酶,解螺旋酶,引物酶,DNA連接酶(ligase)。模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3‵-OH使dNTP依次聚合。蛋白因子：單鏈結合蛋白(SSB)。

眾所周知，ＤＮＡ是由四種堿基按互補配對原則（即腺嘌呤Ａ對胸腺嘧啶Ｔ，鳥嘌呤Ｇ對胞嘧啶Ｃ）組成的螺旋雙鏈。在細胞內，ＤＮＡ復制時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，引物酶合成一小段引物結合到ＤＮＡ模板上，最后，DNA聚合酶以這段引物為起點，合成與ＤＮＡ模板配對的新鏈。2/5/2023

吉林農業大學

10

DNA復制的起始就是要解開雙鏈和生成引物。(一)DNA解成單鏈 由拓撲異構酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結合到單鏈上使其穩定。

生物體內DNA分子的結構和復制2/5/2023

吉林農業大學

11

(二)引物合成引發體引導引物酶到達適當的位置合成引物。引物長度約為十幾個到幾十個核苷酸不等。引物的合成方向也是5′→3′方向。2/5/2023

吉林農業大學

12

(三)延伸(elongation)：

復制體延DNA移動，dNTP依次聚合。2/5/2023

吉林農業大學

13生物體外DNA分子的復制

——PCR技術

2/5/2023

吉林農業大學

14PCR的3個基本反應ＰＣＲ即是在體外模擬ＤＮＡ復制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的ＤＮＡ片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結合到ＤＮＡ模板的兩端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量復制該模板。PCR是由3個基本反應:

變性、退火、延伸

3步反應周期反復循環。每循環一次所產生的DNA均能成為下一次循環的模板。20次PCR循環將產生約一百萬倍(220)的擴增產物。2/5/2023

吉林農業大學

15變性（雙鏈DNA解鏈成單鏈）1.變性：將反應體系置高溫下(91～94℃,1min),DNA雙螺旋的氫鍵斷裂(變性)，形成單鏈DNA。模板DNA、引物1、引物2、dNTP和TaqDNA聚合酶、Mg2+、Buffer

模板DNA：含有待擴增區域的DNA

特異性引物:與模板DNA待擴增區域兩端已知序列互補的寡核苷酸

dNTP：帶有A、T、G、C的單核苷酸（脫氧核苷三磷酸）

TaqDNA聚合酶：催化DNA復制的酶

Mg2+:保證DNA復制的酶活性

Buffer：緩沖液2/5/2023

吉林農業大學

16退火（按堿基配對原則結合形成雙鏈區）2.退火：使溫度下降

(37～65℃,1min)，PCR反應體系中的引物與模板鏈3’端互補區退火（按堿基配對原則結合形成局部雙鏈區），引物與模板結合。由于DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動（引導）新鏈的合成（在生物體內也如此），于是，TaqDNA聚合酶將單核苷酸從引物的3′端引入，催化磷酸二脂鍵生成。引物的關鍵作用有二：①啟動新鏈的合成；②引物的退火位點決定新DNA鏈的起點。2/5/2023

吉林農業大學

17延伸（DNA合成鏈的延伸）3.延伸；72℃，2min,在適當的緩沖液中，Mg2+存在條件下，Taq

DNA聚合酶按模板的堿基順序不斷引入4種dNTP（脫氧核苷三磷酸）合成互補鏈，按5′→3′的方向不斷延伸。由于兩引物都是按與擴增區段兩端序列彼此互補的原則設計的，在每一條新合成的DNA鏈上都具有新的引物結合位點。2/5/2023

吉林農業大學

18從退火

到延伸有人問：退火時為什么引物與模板雜交，而模板雙鏈不復性呢？原因：一是相對模板DNA來說引物的量大；二是模板DNA比引物分子量大且復雜。所以在復性時，引物與模板在局部形成雜交鏈的機會比模板復性要大得多。引物1引物1引物2引物22/5/2023

吉林農業大學

19PCR擴增過程2/5/2023

吉林農業大學

201234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR擴增過程2/5/2023

吉林農業大學

21PCR儀——基因體外擴增儀；熱循環儀

2/5/2023

吉林農業大學

22（二）PCR技術的操作冰上向管中依次加入下列試劑：

總體積

25μl

10×Buffer2.5μl

MgCl22mmol/L

dNTP

0.2mol/L（4種dNTP各1/4）

引物

0.2μmol/L

模板

10ng

Taq酶

2μL

雙蒸水補至終體積2/5/2023

吉林農業大學

23微量移液器的使用方法

1)吸進液體時按到第一檔，垂直進入液面幾毫米。緩慢松開控制按鈕，防止液體進入吸頭過速會導致液體倒吸人移液器內部吸入體積減少。2)打出液體時貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓1s后，待剩余液體聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。2/5/2023

吉林農業大學

24反應循環參數反應管放入PCR儀中，按如下程序操作：

94℃預變性

2～5min94℃變性

1min

45～62℃退火

1min72℃延伸

2min

循環30次

72℃延伸

7min

（以保證擴增出來的片段都是全長的）循環結束后反應產物置于4℃保存2/5/2023

吉林農業大學

25PCR條件的優化：在PCR反應中主要影響因素有：模板、Mg2+

、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、引物、TaqDNA聚合酶、溫度循環參數。2/5/2023

吉林農業大學

26⑴模板量模板的純度及量對反應有重要的影響。一般含量在2～100ng均能獲得目標產物。模板的量過少可能PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中不能被檢測出來；模板量太大也會影響PCR的效率，并且會出現非特異產物。模板可用總DNA，一般不需高度純化，甚至煮沸細胞釋放出DNA也可作模板。2/5/2023

吉林農業大學

27⑵Mg2+濃度Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。不同的引物-模板系統，最適合的Mg2+濃度可能不同。

Mg2+濃度過低，酶活力顯著降低；濃度過高催化非特異擴增。通常適合的Mg2+為0.5～5.0mmol/L，需做預備實驗來選定。2/5/2023

吉林農業大學

28⑶dNTP濃度反應中每種dNTP的終濃度為20～200μmol/L時，PCR產物量、特異性與合成忠實性間的平衡最佳。適宜dNTP濃度可根據靶序列長度和堿基組成來確定。2/5/2023

吉林農業大學

29⑷引物濃度一般PCR體系中引物的終濃度為0.2～0.5μmol/L，在此范圍內，PCR產物量基本相同。但引物量低于0.2μmol/L時，PCR產物量降低；引物量過高會促使非特異產物的合成，還會增加引物二聚體的形成。2/5/2023

吉林農業大學

30⑸退火溫度退火溫度直接影響擴增的特異性，退火溫度高則擴增特異性高，但PCR產物量低；退火溫度過低易導致非特異性擴增。需進行預備實驗選擇適宜退火溫度。2/5/2023

吉林農業大學

31⑹TaqDNA聚合酶濃度在其它參數最佳時，100μL反應液含1～2.5μL

TaqDNA聚合酶為佳。如果酶濃度太高易出現非特異擴增帶；酶濃度過低時，則靶序列產量很低。

2/5/2023

吉林農業大學

32熱啟動可提高特異性、擴增效率采用熱啟動可提高特異性，還可提高擴增效率。方法為：反應體系的最后1種成分（如TaqDNA聚合酶）暫不加入，加熱到80℃或更高再加入，接著將樣品管加熱到94℃直接進入PCR循環。2/5/2023

吉林農業大學

33分子生物學技術重要參考書2/5/2023

吉林農業大學

34DNA的提取和檢測為進行DNA的擴增，首先要進行DNA的提取和檢測。DNA提取的不同方法：

CTAB

、SDS、尿素法、SDS～CTAB、濃鹽法等紫外吸收法測定核酸種類、含量2/5/2023

吉林農業大學

35DNA提取的方法2/5/2023

吉林農業大學

36細胞破碎抽提去蛋白質沉淀核酸植物DNA提取的基本過程2/5/2023

吉林農業大學

37植物DNA提取的不同方法CTAB（溴代十六烷基三甲胺）法

CTAB是一種去污劑，可溶解細胞膜并能與核酸形成復合物，便于DNA的抽提；還可保護DNA免受內源核酸酶的降解，使蛋白質變性而沉淀。1×CTAB（溴代十六烷基三甲胺）DNA提取液

1%（W:V）CTAB50mmol/LTris-HCl（pH8.0）

10mmol/LNa2EDTA0.7mol/LNaClSDS（十二烷基硫酸鈉）法可溶解膜蛋白而破壞細胞膜，使蛋白質變性而沉淀。

濃鹽法（RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA難溶其中，據此特性可將兩者分開。DNA易溶于0.5～1mol/L的NaCl溶液中，因此可利用1mol/L的NaCl溶液提取DNA。）尿素法：尿素是一種變性劑，如6～8mol/L尿素為中強變性劑。蛋白質在受熱或在高濃度的尿素、鹽酸胍（8M脲和5M鹽酸胍）等化學試劑存在下會喪失活性，該現象稱為蛋白質的變性。2/5/2023

吉林農業大學

38植物DNA提取方法的要點細胞破碎→細胞（勻）漿可用機械破碎法：如研磨。核酸分離、純化應在0～4℃，以防核酸變性或降解。Tris緩沖液

Tris的化學性質穩定，作用是保持溶液的電中性及pH。在提取液中加入適量EDTA或檸檬酸鹽可抑制Dnase活性，又可使蛋白質變性而與核酸分離。β-巰基乙醇具還原劑性質，能防止過氧化物對分離物的破壞、分解。從核酸樣品中除去蛋白質時常常使用苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)。苯酚/氯仿可與水作用能破壞蛋白質分子周圍的水膜，同時改變溶液的介電常數，導致蛋白質變性溶解度降低而沉淀析出。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產生。異丙醇、乙醇可選擇性的沉淀DNA，而RNA仍留在溶液中。2/5/2023

吉林農業大學

39抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA。氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少泡沫產生，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。一般采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成）。2/5/2023

吉林農業大學

40實驗材料研磨加入提取液

獲得植物汁液研缽及其它容器應事先高壓滅菌，再烘干。植物汁液加入離心管2/5/2023

吉林農業大學

41DNA提取的重要儀器

高速離心機離心管加入離心機前必須對離心管進行配平衡2/5/2023

吉林農業大學

42打開離心機的蓋子離心管放入離心機轉子離心管的正確放置插好離心管2/5/2023

吉林農業大學

43紫外吸收法測定核酸種類及含量原理：DNA和RNA的吸收峰在260nm處。蛋白質由于含有芳香族氨基酸，吸收峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm和280nm吸收的比值在2.0以上，DNA的260nm和280nm吸收的比值在1.9左右，當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降(比值≥1.8，表示蛋白質含量不超過0.3％)。在實際測定中，將樣品稀釋成每mL含5～50μg核酸的濃度，可利用在260nm下的吸收值來求出核酸的濃度。DNA濃度（μg/mL）＝A260/0.020/L*稀釋倍數式中：A260為260nm下的吸收值；L為比色池厚度，一般為1或0.5；0.020為每mL溶液內含1μgDNA鈉鹽的吸光度.紫外可見光分光光度計2/5/2023

吉林農業大學

44瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA擴增產物由于DNA核酸分子比蛋白質分子大得多，通常采用有較大孔徑的瓊脂糖凝膠來分離核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以帶有負電荷，在電場中會向正極移動。試劑和儀器水平電泳槽、電泳儀2/5/2023

吉林農業大學

45PCR儀——基因體外擴增儀PCR儀配套用品2/5/2023

吉林農業大學

46PCR擴增產物的瓊脂糖電泳分析

AnaysingtheresultsofaPCRbyagarosegelelectrophoresis待分析的DNA樣本2/5/2023

吉林農業大學

47水平電泳槽、電泳儀2/5/2023

吉林農業大學

48

制備凝膠板

2/5/2023

吉林農業大學

49加樣2/5/2023

吉林農業大學

50水平電泳圖示凝膠板上的電泳條帶凝膠板上的電泳前端用溴酚藍指示加樣孔2/5/2023

吉林農業大學

51電泳分離不同大小的DNA片斷2/5/2023

吉林農業大學

52凝膠成像儀凝膠板上的電泳條帶2/5/2023

吉林農業大學

53（三）PCR技術的發展以PCR技術為基礎與其它最新技術相結合,進一步發展了反轉錄PCR

、免疫捕捉PCR、實時熒光定量PCR、多重聚合酶鏈反應等復合PCR技術。這些方法提供了更快捷、特異、準確、高效檢測植物病原物的方法.2/5/2023

吉林農業大學

541.反轉錄PCR（RT-PCR）1.反轉錄PCR（RT-PCR）目前PCR技術只能擴增DNA模板，而TaqDNA聚合酶不能以RNA為模板進行擴增。利用逆轉錄酶能將RNA逆轉錄成DNA的特性，通過合適的引物，將RNA（一般為mRNA)逆轉錄成cDNA，然后，通過PCR技術，將痕量的cDNA擴增成大量的雙鏈DNA。這種在RNA反轉錄后進行的PCR擴增稱為RT-PCR

（ReversetranscriptionPCR,簡稱RT-PCR）。大多數植物病毒基因組為RNA，為檢測植物病毒，就需要應用反轉錄PCR技術，首先在逆轉錄酶的作用下，以RNA為模板合成互補的第一鏈cDNA，之后進行常規PCR反應。cDNA：互補DNA，具有DNA的功能，且其中沒有內含子。2/5/2023

吉林農業大學

55逆轉錄示意圖cDNA鏈合成,互補mRNA鏈，一般利用polyT作引物，也可用特異性的序列作為引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆轉錄polyT引物2/5/2023

吉林農業大學

56反轉錄PCR原理示意圖逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶RNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增將mRNA逆轉錄成cDNA這個步驟與轉錄是相反的，因此叫逆轉錄酶。

逆轉錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內的依賴RNA的DNA聚合酶。至少具有以下三種活性：

1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；

2、Rnase水解活性：水解RNA/DNA雜合體中的RNA；

3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA。Taq

酶

2/5/2023

吉林農業大學

57反轉錄PCRcDNA2/5/2023

吉林農業大學

58RT～PCR檢測番木瓜環斑病毒電泳結果2/5/2023

吉林農業大學

592.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）特異性抗體抗原2.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）是根據ELISA的原理，直接從植物粗提液中進行免疫捕捉病毒，目的在于濃縮和純化病毒粒子，之后再利用RT-PCR

檢測目的片斷。基本流程（反應在0.5mL離心管中進行）：包被抗體→捕捉抗原→病毒核酸釋放（98℃，3min）→反轉錄反應→PCR擴增→產物檢測。反轉錄PCR反應體系離心管反轉錄反應→PCR擴增2/5/2023

吉林農業大學

60免疫捕捉PCR有以下優點免疫捕捉PCR具有以下優點:(1)在PCR擴增前，有免疫捕捉的過程以及引物的高度特異性,提高了檢測的靈敏度（上百倍）。ELISA一般能夠檢測到的病毒濃度是1ng/mL,但是IC-RTPCR一般只需要1～10pg/mL.(2)能直接從植物粗提液中檢測病原物，而省去PCR模板的純化,這對于核酸提取困難的樣品特別適用。利用抗原與抗體的結合，能除去植物粗提液中的PCR抑制物。2/5/2023

吉林農業大學

613.實時熒光定量PCR3.實時熒光定量PCR(RealtimefluorescentQuantitativePCR，RT-FQPCR)是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術，簡稱FQ-PCR。該技術是在PCR反應體系中加入非特異性的熒光染料（如：SYBRGREEN）或特異性的熒光探針（如：Taqman探針），實時檢測熒光量的變化。獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數CT值（CycleThreshold）；通過將已知濃度標準品的CT值與其濃度的對數繪制標準曲線，就可以準確定量樣品的濃度。FQ-PCR是PCR反應一面進行，機器一面利用螢光偵測技術與計算機分析技術記錄PCR的反應結果，當反應完成時，檢驗結果就立即呈現。2/5/2023

吉林農業大學

62

SYBRGreen能結合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結合后才發熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光。復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen法優點：使用方便不必設計復雜探針，非常靈敏，便宜。SYBRGreen法缺點：容易與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性。SYBRGreen實時熒光定量PCR方法1

SYBRGreen法2/5/2023

吉林農業大學

63實時熒光定量PCR方法2TaqMan法探針與目標序列配對時

，發生FRET光能量轉移Taq游離的探針熒光基團

淬滅劑

延伸時，Taq酶水解探針，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離而發出熒光，形成熒光信號

Taq發出熒光光另一波長的光在常規PCR基礎上，反應體系添加“熒光雙標記探針”，探針的5′端為熒光報告基團，3′端為熒光淬滅基團，兩者構成能量傳遞結構，5′端熒光報告基團的熒光可被熒光淬滅基團吸收掉，轉化為其他波長的發射光或熱能，稱之為FRET。在目標DNA擴增過程中，探針水解，熒光素和淬滅劑分開，淬滅劑對熒光素的抑制作用消失，從而引起報告基團熒光信號的增長。由于探針必須遇到模板才能實現水解，故非特異性擴增不會被檢測。2/5/2023

吉林農業大學

64實時熒光定量PCR方法3分子信標法探針雜交到DNA模板光發出熒光熒光基團DNA模板淬滅劑

莖

環光淬滅在目標DNA擴增過程中，分子信標型探針構型變化，熒光素和淬滅劑分開，淬滅劑對熒光素的抑制作用消失，從而引起報告基團熒光信號的增長。標記熒光的發夾探針：環與目標序列互補莖由互補配對序列組成2/5/2023

吉林農業大學

65實時熒光定量PCR

對起始DNA的定量方法實時熒光定量PCR對起始DNA的定量方法為：原理：初始DNA量越多,熒光達到某一值（Ct閾值）時所需要的循環數越少。Ct值和初始DNA量的對數值呈線性關系。制定標準品的Ct值和初始DNA量的對數值之間的標準曲線。根據樣品的Ct值就可準確定出起始DNA數量。Ct值（Cyclethreshold）

：指在PCR循環過程中熒光信號到達設定的域值的循環次數。經數學證明，Ct值與模板DNA的起始拷貝數的關系：N＝N0(1+E)n

logN=nlog(1+E)+logN0

n=(logN0-logN)/log

(1+E)Ct

=A

+B·logN02/5/2023

吉林農業大學

664.多重聚合酶鏈反應4.多重聚合酶鏈反應（MultiplexPCR）不同的植物病毒或其它病原物可能會同時侵染同一種植物，如要逐個檢測，操作較為繁瑣。多重聚合酶鏈反應技術可在一次PCR反應中，同時加入幾對特異性引物(要注意各引物比例適當)，從而同時擴增、檢測出不同的病原物(DNA或者RNA).這就為檢測工作提供了極大的便利。2/5/2023

吉林農業大學

67（四）PCR技術在植物病理學中的應用1.檢測病原物的種類2.檢測病原物的數量3.分析轉基因植物外源基因拷貝數2/5/2023

吉林農業大學

68檢測病原物種類的辦法找到某種病原物的特異性核酸序列，對待檢病原的核酸進行該序列的PCR擴增。擴增結果陽性，表示待檢病原為特定病原物；擴增結果陰性，表示待檢病原非特定病原物。2/5/2023

吉林農業大學

691.檢測病原物的種類王杰等（2005）建立了能直接以大豆干種子為檢測對象的SMV快速、靈敏、特異的RT-PCR檢測技術，從而為防治大豆花葉病提供了關鍵技術。Jansen等在檢測ToMV(Tomatomosaicvirus)和TMV(Tobaccomosaicvirus)的過程中，發現這兩種病毒的抗血清交互反應，ELISA不能區分出這兩種不同的血清型。但應用IC-RT-PCR

時，只要病毒濃度在10～100fg/mL之間，TMV或者ToMV

就能被檢測到，能擴增出各自的分離物。2/5/2023

吉林農業大學

70檢測病原物的種類Korimbocus

等報道，利用實時熒光PCR

檢測到侵染甘蔗的ScYLV(SugarcaneYellowleafvirus),其靈敏度是常規PCR的100倍，

能從反轉錄PCR，ELISA等方法檢測不到ScYLV的樣本中檢測到該病毒。Murray等報道，多重免疫捕捉反轉錄PCR能夠同時檢測和區分出侵染香蕉的BBTV、BBrMV

、CMV等3種病毒。Bertolini

等報道了用多重反轉錄PCR

能同時檢測到侵染橄欖樹的CMV等6種RNA病毒。2/5/2023

吉林農業大學

712.檢測病原物的數量目前，實時熒光PCR方法被評價為檢測土壤等樣品中微生物種類和數量的最有效方法。2/5/2023

吉林農業大學

723.分析轉基因植物外源基因拷貝數楊立桃等（2005）利用實時熒光定量PCR

方法分析轉基因水稻外源基因拷貝數，3個植株定量PCR分析的轉基因拷貝數稍高于SouthernBlot

的分析結果。主要原因是SouthernBlot方法在同一個插入位點有多拷貝的T-DNA片段插入時,轉基因植株的基因組在完全酶切時會產生相似的DNA片段,電泳分析時很難分辨清楚。定量PCR方法則完全避免了這種情況的發生,除非目的基因DNA片段在PCR引物處發生斷裂。兩種方法分析結果的比較顯示定量PCR方法分析轉基因拷貝數更加有效、適用。2/5/2023

吉林農業大學

73二.RAPD方法與

SCAR標記（一）RAPD方法的基本原理（二）SCAR標記（三）RAPD技術及SCAR標記在植物病理學中的應用2/5/2023

吉林農業大學

74二.RAPD方法與SCAR標記RAPD，即隨機擴增多態性DNA

(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)是由美國杜邦公司的Williams(1990)和加利福尼亞生物研究所Welsh兩個小組在PCR技術基礎上，發展起來的簡便快速的檢測DNA多態性的方法。此技術對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測多態性。由于整個基因組存在眾多反向重復序列，單一隨機引物與反向重復序列結合,使重復序列之間的區域得以擴增。由于該方法可在缺乏任何分子生物學研究背景的物種上應用（構建基因組指紋圖譜、闡明物種親緣關系等），且研究費用低廉，表現出獨特的優勢，獲得了廣泛應用。由于PCR方法只能對已經了解了基因序列的情況下才能使用，就極大的限制了其應用范圍。為在缺乏任何分子生物學研究背景的物種上應用（檢測、鑒定病原物、闡明物種親緣關系等），就產生了RAPD方法。2/5/2023

吉林農業大學

75RAPD方法的缺點在RAPD方法獲得廣泛應用的同時，也發現了該方法的最重要的缺點—標記檢測結果的不穩定性。N.F.Weeden等人的研究表明，RAPD標記檢測誤差在5%～10%之間。Paran和Michelmore(1993)提出的SCAR標記技術可以解決這一問題。2/5/2023

吉林農業大學

76（一）RAPD方法的基本原理RAPD標記技術就是用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8～10個堿基）非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。模板DNA經92～94℃變性解鏈,在足夠低的溫度下(35～37℃,一般低于40℃)與單個隨機引物(一般為10個堿基)退火,如果互補的兩條DNA鏈上的2個退火位點足夠接近(約200～2000bp),通過延伸便可擴增出DNA片段。整個基因組存在眾多反向重復序列，單一引物與反向重復序列結合,就會使重復序列之間的區域得以擴增。如此30次PCR循環也將產生上百萬倍的擴增產物。200～2000bp反向重復序列反向重復序列2/5/2023

吉林農業大學

77RAPD方法的基本原理對于特定引物，不同生物類群的基因組DNA退火位點總有不同,能否擴增以及擴增產物的種類、長度就有所不同。可用電泳檢測使用特定引物時DNA能否擴增及擴增片斷的（種類）長度的多態性圖譜。不同物種，產生的多態性不同。故，可用此方法檢測、鑒定病原物（擴增產物完全一樣，則兩者為相同生物）

；研究不同病原物的親緣關系（擴增產物越相似，親緣關系越近）。2/5/2023

吉林農業大學

780.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系22/5/2023

吉林農業大學

79通常采用30個以上的隨機引物擴增來篩選出若干可有效擴增的引物通常采用30個以上的隨機引物，進行30次以上的擴增,就可獲得一組目標基因組DNA多態性的實驗數據。同一生物類群具有相似的遺傳背景，擴增獲得的DNA多態性的實驗數據也是相似的；對不同生物類群來說，獲得的DNA多態性的實驗數據也不相同。通過對目標基因組DNA進行RAPD擴增獲得的DNA多態性實驗數據用統計方法處理后（如進行聚類分析，以樹狀聚類圖方式表達等），則可以得到相應的DNA遺傳、分類、進化等更多信息。2/5/2023

吉林農業大學

80RAPD分析技術實驗流程RAPD分析技術實驗流程包括:(1)模板DNA的提取純化；(2)用隨機引物進行DNA擴增（不少于30個隨機引物）；(3)擴增產物的檢測；(4)用統計方法處理。2/5/2023

吉林農業大學

81煙草野火病抗性基因的RAPD分析徐秀紅采用了423條隨機引物對抗病親本Ky14和感病親本SpeightG-140進行RAPD分析，其中9條引物能在抗、感親本間穩定擴增出有差異的條帶。9條引物在抗、感親本間的擴增差異見圖。

2/5/2023

吉林農業大學

82煙草野火病抗性基因的RAPD分析將以上9條引物在抗、感基因池間進行擴增檢測，結果只有引物S52在抗、感基因池間顯示出多態性差異，6次重復擴增，結果穩定。S52產生的差異片斷約2000bp，記作標記S522000。S52在抗、感基因池間的擴增結果見圖。

初步推斷，該標記與來自N.longiflora的煙草野火病抗性基因存在連鎖。一族群中所有基因的集合為基因池（genepool）抗病基因池：多個抗病品種DNA的混合物。感病基因池：多個感病品種DNA的混合物。2/5/2023

吉林農業大學

831.30001.19750.89500.77760.70660.61790.82990.67950.573100.50.60.70.80.91.01.11.21.3QYE3GXE1BEEBE4ABHU根據RAPD分析繪制出的10個生物群體的聚類圖2/5/2023

吉林農業大學

84（二）SCAR標記為解決RAPD標記的不穩定性問題，

Paran和Michelmore(1993)

提出了序列特異性擴增區技術（sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR）。與RAPD

標記法相比，SCAR標記PCR反應條件嚴謹、結果穩定、重復性強，在應用上具有快速、簡便、低成本的特點，已成為多種分子標記中的首選標記。2/5/2023

吉林農業大學

85SCAR標記原理該技術是通過對RAPD擴增產物測序的基礎上，設計一對新的引物特異地擴增原引物可擴增的DNA片段。一對新的引物：分別在原RAPD引物的3’與5’端各延長10～14個堿基。延長后的每個引物為18～24個堿基。除將引物加以改變以外，還應將PCR擴增條件加以適當調整：退火溫度為60～66℃、MgCl2

濃度常為1.5mmol/L?！?/5/2023

吉林農業大學

86（三）RAPD技術及

SCAR標記在植物病理學中的應用1.鑒定病原物的種類2.研究某些病原菌類群間的親緣關系3.進行抗病基因的標記定位2/5/2023

吉林農業大學

871.鑒定病原物的種類區別形態相似的病原物：

特定引物擴增可在某病原物中獲得特定的DNA譜帶，而在另一病原物中無此帶出現，此特異片段就是一種鑒定標記。于拴倉等（2005）利用RAPD技術篩選了4個引物，可以將番茄葉霉病菌生理3

個生理小種完全區分開來。康振生等（2005）用210條隨機引物對中國小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)5個主要生理小種進行了RAPD分析,獲得了條中29號小種?；腟CAR標記。曹麗華等建立了小麥條銹菌條中31號小種SCAR檢測標記。2/5/2023

吉林農業大學

882.研究某些病原菌類群間的親緣關系利用30個以上隨機引物的（特定）擴增條帶的有無（1，0），進行聚類分析，研究不同病原物的親緣關系（擴增產物越相似，親緣關系越近）。吳小芹等（2005）對來自日本、韓國、美國、加拿大和中國大陸6省及臺灣地區的松材線蟲和擬松材線蟲16個蟲株的基因組DNA進行RAPD分析，結果顯示,松材線蟲和擬松材線蟲明顯分為兩大類。

在松材線蟲群體中,又可分為3個亞組:

中國大陸蟲株與日本蟲株為一亞組,加拿大蟲株為一亞組,中國臺灣蟲株與美國蟲株為一亞組。

擬松材線蟲群體亦可分為兩亞組:

一為日本、中國臺灣和中國江蘇蟲株,

二為韓國和中國湖南蟲株。2/5/2023

吉林農業大學

893.進行抗病基因的標記定位如利用多個抗病、感病品種進行RAPD擴增，也可望找到抗病、感病品種有差異的擴增帶，則抗病品種共有的帶上即存在抗病基因。張志永等(1998)對30個栽培大豆品種進行了RAPD指紋圖譜分析。結果表明：較短的片段S—5600和S—05660是抗病品種的特征性條帶;而較長片段S—51000和S—51600是感病品種的特征性條帶。2/5/2023

吉林農業大學

90三.RFLP和AFLP技術（一）RFLP的基本原理（二）AFLP的基本原理2/5/2023

吉林農業大學

91三.RFLP和AFLP技術限制性片段長度多態性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）是Bostein和White等人于1980年首次提出的分子標記技術。RFLP技術的優越性在于穩定性好、可靠。但此法費用高，周期長，多態性水平低，限制了這種技術的應用。擴增片段長度多態性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）是由荷蘭科學家M.Zabeau和P.Vos于1993年提出的分子標記技術。AFLP結合了RFLP的穩定性和PCR技術的高效性，它無需基因組DNA的背景資料即可完成模板DNA多態性的檢測，可產生豐富而穩定的遺傳標記,被認為是一種高效的分子標記技術。2/5/2023

吉林農業大學

92（一）RFLP的基本原理生物不同類群的DNA序列中，總會存在許多不同的限制性內切酶識別位點。因而，當某一特定的限制性酶切割DNA時，就會產生酶切DNA片段長度的差異。這種差異可反映在電泳圖譜上。檢測出的特異帶型是鑒別物種、分析類群間類緣關系等的科學依據。對于每一個DNA基因組/限制性內切酶組合來說，所產生的片段長度多態性是特異性的，故RFLP被稱為DNA指紋。2/5/2023

吉林農業大學

93DNA提取→用DNA限制性內切酶消化

→凝膠電泳分離限制性片段

→將這些片段按原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上

→用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱Southern雜交）

→放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態性。

RFLP的基本步驟用限制性酶來酶解高等生物核DNA會產生數萬個片段，其大小變化是連續的，如進行電泳分離，只能看到彌散狀的連成一片的電泳結果。然而，各限制片段在凝膠中還是分開的，但不能分辨。進行Southern印跡轉移操作，用特定的探針與濾膜上的DNA雜交，經過放射自顯影就能檢測到高等生物核DNA的RFLP。2/5/2023

吉林農業大學

94酶切，電泳后（轉膜雜交自顯影）檢測結果較大片段RFLP標記技術的基本手段就是通過電泳的方法分離這些片段。轉膜、雜交、自顯影后檢測結果較小片段2/5/2023

吉林農業大學

95（二）

AF