第三章菌種的衰退、復壯與保藏第一節菌種的衰退和復壯一、菌種的衰退

菌種衰退（degeneration）是指菌種經過長期人工培養或保藏，由于自發突變的作用而引起某些優良特性變弱或消失的現象。（一）菌種衰退的具體表現1、菌落和細胞形態改變。每一種微生物在一定的培養條件下都有一定的形態特征，如果典型的形態特征逐漸減少，就表現為衰退。2、生長速度緩慢，產孢子越來越小。3、代謝產物生產能力的下降，即出現負突變。4、致病菌對宿主侵染能力下降。5、對外界不良條件（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）抵抗能力的下降等。總之，退化是發生在群體細胞中的一個從量變到質變的逐步演變過程，由于個別突變細胞表現生長優勢，導致在群體中最后數量占優勢。（二）菌種衰退的原因1、基因突變（1）有關基因發生負突變導致菌種衰退菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。（2）表型延遲造成菌種衰退如，在誘變育種過程中，經常會發現某菌株初篩時產量較高，進行復篩時產量卻下降了。（3）質粒脫落導致菌種衰退質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控制的。2、連續傳代連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面，傳代次數越多，發生自發突變（尤其是負突變）的幾率越高；另一方面，傳代次數越多，群體中個別的衰退型細胞數量增加并占據優勢越快，致使群體表型出現衰退。3、不適宜的培養和保藏條件不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養條件如營養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發衰退型細胞的出現，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。（三）菌種衰退的防治1、控制傳代次數

即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發突變的機率。2、創造良好的培養條件

1)結構類似物抗性菌株在保藏培養基中應添加相應藥物，及時淘汰回復突變細胞。

2)基因工程菌添加抗生素于培養基中防止質粒的丟失。

3）培養營養缺陷型菌株時應保證適當的營養成分，尤其是生長因子。

4）控制好碳源、氮源等培養基成分和pH、溫度等培養條件，使之有利于正常菌株生長，限制退化菌株的數量，防止衰退。3、利用不易衰退的細胞移種傳代

在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細胞常含幾個細胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就不會發生這種現象。另外，有些霉菌（如構巢曲霉）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。4、采用有效的菌種保藏方法有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退極其必要的措施。在實踐中，應當有針對性的選擇菌種保藏的方法。例如，釀酒酵母，保持其優良發酵性能最有效的保藏方法是－70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，而冷凍干燥保藏法和液氮保藏法并不理想。短期保藏——一般斜面冰箱保藏法長期保藏——砂土保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法。對于比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。5、講究菌種選育技術

在菌種選育時，應盡量使用單核細胞或孢子，并采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力,避免表型延遲現象。同時，在誘變處理后應進行充分的后培養及分離純化，以保證菌種的純度。6、定期進行分離純化定期進行分離純化，對相應指標進行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。

二、菌種的復壯俠義的復壯：菌種已經發生衰退后，再通過純種分離和性能的測定等方法，從衰退的群體中找出尚未衰退的少數個體，以達到恢復該菌種原有典型性狀的一種措施。廣義的復壯：一種積極的措施，即在菌種的生產性能尚未衰退前經常有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，使菌種地生產性能逐步提高。純種分離法寄主體內復壯法淘汰法遺傳育種法復壯措施方法1、純種分離法

通過純種分離,可將衰退菌種細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來,經擴大培養,就可恢復原菌株的典型性狀。“菌落純”的水平——稀釋平板法、涂布平板法、平板劃線法等方法獲得單菌落。“細胞純”即“菌株純”的水平——培養皿或凹玻片等作分離室的方法、顯微操縱器的純種分離法。2、宿主體內復壯法對于寄生性微生物的衰退菌株，可通過接種到相應昆蟲或動植物宿主體內來提高菌株的毒性。例如：蘇云金芽孢桿菌——感染菜青蟲的幼蟲，然后再從病死的蟲體內重新分離典型菌株。根瘤菌屬——回接到相應豆科宿主植物上,令其侵染結瘤,再從根瘤中分離出根瘤菌,其結瘤固氮性能就可恢復甚至提高。3、淘汰法將衰退菌種進行一定的處理（如藥物，低溫、高溫等），往往可以起到淘汰已衰退個體而達到復壯的目的。例如：有人曾將“5406”的分生孢子在低溫(－10～30℃)下處理5～7d，使其死亡率達到80％，結果發現在抗低溫的存活個體中留下了未退化的健壯個體。4、遺傳育種法即把退化的菌種，重新進行遺傳育種，從中再選出高產而不易退化的穩定性較好的生產菌種。第二節菌種的保藏一、理想的菌種保藏方法應具備的條件1

經長期保藏后菌種存活健在；2

保證高產突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力。3菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。世界上國際知識產權組織承認的法定保藏機構有28家。Ex：美國的標準菌種保藏所（ATCC）美國農業部農業研究服務部（ARS）英國國立標準菌種保藏所（NCTC）我國：中國科學院微生物研究所的普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）武漢大學的中國典型培養物保藏中心

（CCTCC）二、微生物菌種保藏技術

原理：根據微生物的生理生化特性，人為地創造條件，使孢子或菌體處于代謝不活潑，生長繁殖受到抑制的休眠狀態，以減少菌種的變異。一般可通過保持培養基營養成分在最低水平，缺氧狀態，干燥和低溫等。斜面保藏法穿刺保藏法石蠟油封藏法沙土管干燥保藏法真空冷凍保藏法液氮保藏法懸滴保藏法低溫保藏法麩皮保藏法斜面保藏法接種適宜斜面培養基→培養→4℃保藏適用：各大類保藏期：3~6個月缺點：保存期短，傳代多，易退化

點接：把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。中央劃線：從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。密波狀蜿蜒劃線法:從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。挖塊接種法:挖取菌絲體連同少量培養基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。斜面接種法培養：

將接種后的培養基放入培養箱中，在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30～37℃，真菌培養溫度一般為25～28℃。保藏：培養好的菌種于4～6℃保存，根據要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和污染造成損失。

半固體穿刺保藏法穿刺接種適宜半固體→培養→4℃保藏適用：細菌，酵母等保藏期：6~12個月

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。石蠟油封藏法措施：阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態下，而且又防止了水分揮發。方法：液體石蠟150～170℃烘箱內滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內烘干除去水分→倒入菌種管中（高出1cm）→4℃保存。適用：霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等保藏期：1～2年，或更長

砂土管干燥保藏法措施：無營養，缺氧，干燥方法：孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→5℃保藏適用：產孢子的絲狀真菌、放線菌；有芽孢的細菌保藏期：1~10年或更長河沙60目篩棄去大顆粒及雜質80目篩去掉細沙吸鐵石吸去鐵質10％～20％的鹽酸浸泡24h去除有機物水洗至中性烘干或曬干土：取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩,水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30min。沙土管制作沙：向培養好的斜面培養物中注入3～5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。真空抽去沙土管中水分。將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4～6℃)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內保存。保藏時間2～10年。無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養基上，長出菌落后再轉接一次。或取沙土粒于適宜的液體培養基中，增殖培養后再轉接斜面。沙土管恢復培養真空冷凍干燥保藏法：措施：低溫、干燥，缺氧，保護劑方法：菌種培養→用保護劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結（-25~-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏適用：各大類（不產孢子的絲狀真菌除外）保藏期：5~10年或更長常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質。復蘇方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——將安瓿管頂部燒熱，——用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，——用無菌水或培養液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養基上，進行適溫培養。安培瓶凍干機

液氮超低溫保藏法措施：低溫、加保護劑（10%甘油、DMSO）方法：菌懸液→加入保護劑→分裝至安醅管中（0.2-1cm菌懸液）→逐步降溫至-35℃→液氮罐保藏適用：范圍廣泛保藏期：一般2～3年，長則15年。常用保護劑有甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環、吐溫80菌種的準備可采用下列幾種方法：刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；接種液體培養基，振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基，接種菌種，培養2-10天后，加入保護劑，待保藏。復蘇方法：從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。菌種凍存管懸滴保藏法措施：無營養，懸浮，溶液方法：寡營養保藏，放置10℃或室溫適用：絲狀真菌、酵母、腸道細菌保藏期：1年或更長低溫保藏法方法：-20℃適用：無芽孢厭氣菌，放線菌等保藏期：1