細胞培養(yǎng)技術(shù)Technologyof

CellCulture王莉細胞培養(yǎng)技術(shù)⑴細胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究：細胞結(jié)構(gòu)功能,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡。⑵細胞培養(yǎng)藥物測試：藥物單因素及多因素的影響作用。⑶淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：檢測T、B細胞數(shù)量及功能。⑷細胞用作毒性實驗及安全性實驗：環(huán)境毒物等。⑸細胞工程學(xué)研究手段已基本建立：克隆技術(shù)等。⑹遺傳疾病的產(chǎn)前檢查：羊水細胞、絨毛細胞培養(yǎng)。⑺體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化：腫瘤細胞與癌基因研究。⑻在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用：單克隆抗體技術(shù)與應(yīng)用等。⑼細胞培養(yǎng)在病毒學(xué)中的應(yīng)用：SARS結(jié)構(gòu)與功能等。⑽細胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用

：如基因分離，基因測序與表達、基因轉(zhuǎn)移與重組，癌基因研究等。細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用細胞培養(yǎng)概述細胞培養(yǎng)概述

細胞培養(yǎng)(cellculture):使離體細胞在實驗室人工模擬機體內(nèi)的條件下，生長發(fā)育、分裂增殖的一項重要的細胞生物學(xué)研究技術(shù)。動物和植物細胞培養(yǎng)(這里僅討論動物的細胞培養(yǎng))，簡稱細胞培養(yǎng)。組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)器官培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是把取得的組織用機械或消化的方法，分散成單個細胞懸液，然后進行培養(yǎng)、增殖。細胞培養(yǎng)的優(yōu)點1.活細胞：能長時間、直接觀察、研究

活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動2.可控制：重復(fù)性?？煽刂?調(diào)節(jié)條件：各種因素：物理、化學(xué)、生物等因素3.研究的樣本具有均一性：可選擇對象：哪一種類型：上皮？間質(zhì)？性質(zhì)：正常？腫瘤？階段：

4.便于觀測、檢測和記錄：

研究觀察：倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標記；記錄：攝影照片、縮時電影、電視--細胞培養(yǎng)的優(yōu)點5.應(yīng)用廣

學(xué)科多：對象廣：

各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓＃[瘤--）6.較經(jīng)濟

可提供大量、同時、重復(fù)性好的生物學(xué)性狀相似的實驗對象。

細胞培養(yǎng)的缺點

現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高，但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況，仍不完全相同。當細胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，久了，必然發(fā)生變化。與體內(nèi)主要不同：①相對孤立、相對單一；②缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。主要表現(xiàn)：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)；分化減弱或不顯；

細胞趨向單一化。

要正確認識體外培養(yǎng)細胞；是一種特定條件下生長的細胞群體。一、細胞培養(yǎng)基本原理與技術(shù)

(一)細胞在體外生長的條件體外培養(yǎng)的細胞需要合適的環(huán)境和必需的條件才能生存和繁殖。

1.細胞的營養(yǎng)需要血漿或血纖維蛋白原凝塊中（早期），或在組織提取液等中生長。現(xiàn)知需要一些基本營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子等物質(zhì)。

⑴基本營養(yǎng)物質(zhì)包括：氨基酸(12種必需AA)、維生素、碳水化合物及一些無機離子。

⑵促生長因子等物質(zhì)除基本營養(yǎng)物質(zhì)外，培養(yǎng)細胞還需要促細胞生長因子等物質(zhì)(如EGF,,IGF,IL等)才能正常生長、增殖。血清中含多種，但也有些組成不明，對細胞有害的成分。2.細胞的生存環(huán)境細胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性，包括溫度、氣相及pH等。⑴溫度：人及哺乳動物體外培養(yǎng)細胞的理想溫度是35℃～37℃。高溫比低溫對細胞的影響更為明顯。當溫度為25℃～35℃，細胞生長很慢；4℃下能存活數(shù)天(不低于0℃)，－196℃(保護劑)。41℃～42℃下1h損傷嚴重，43℃以上則多數(shù)細胞將死亡。⑵氣相及pH：5％CO2+95%空氣，大多數(shù)細胞適于在pH7.2～7.4下生長。⑶滲透壓：260～320mmol/L的滲透壓適于大多數(shù)細胞。培養(yǎng)細胞生長的條件

3.無污染及無毒

無毒是培養(yǎng)細胞的必需條件。包括與細胞直接接觸者和間接接觸者（器皿和材料）。

污染包括細菌等微生物（細菌、霉菌、支原體）的污染。即使使用抗菌素仍是細胞培養(yǎng)中要非常注意的問題。污染的另一問題是不同細胞類型的交叉污染。對不同細胞系操作時，應(yīng)避免使用同一瓶培養(yǎng)液。

培養(yǎng)細胞生長的條件

合適的環(huán)境和必需的條件1營養(yǎng)需要2環(huán)境要求3無毒及無污染培養(yǎng)細胞生長的條件(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品無菌室孵育室洗滌消毒滅菌室觀察室準備室貯藏室細胞培養(yǎng)實驗室操作間緩沖間更衣間

細胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)能進行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品1.常用設(shè)備和用品

⑴超凈工作臺：組織細胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實驗室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺的廣泛使用，很大程度上方便了組織細胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實驗室有可能用于進行細胞培養(yǎng)。

(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品

1.常用設(shè)備和用品

⑵CO2培養(yǎng)箱:提供進行細胞培養(yǎng)時所需要的一定量的CO2(濃度為5％),易于使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開放或半開放培養(yǎng)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通,培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔,應(yīng)定期以紫外線照射或酒精消毒。同時培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無菌蒸餾水的水槽,防止培養(yǎng)液蒸發(fā),使箱內(nèi)相對濕度始終保持為100％。(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品

1.常用設(shè)備和用品⑶倒置顯微鏡⑷冰箱⑸離心機⑹電熱干燥箱⑺水純化裝置(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品1.常用設(shè)備和用品⑻高壓蒸汽消毒裝置⑼過濾除菌裝置⑽細胞冷凍裝置其他移動式臭氧空氣消毒機儀器

細胞冷凍儲存器：常用液氮容器。新型的細胞冷凍儲存器可通過先進的電子控制器實現(xiàn)凍存自動化并監(jiān)測液氮水平和樣品溫度；可配備先進的報警系統(tǒng)，分別警報液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：同時具備熱氣體旁路系統(tǒng)，防止高于-130℃的暖空氣進入液氮罐，從而更有效地保護樣品，防止升溫。(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品2.培養(yǎng)器皿

⑴培養(yǎng)瓶⑵培養(yǎng)皿⑶多孔培養(yǎng)板⑷離心管⑸移液管和吸管⑹其他玻璃器皿凍存管

1.2ml2ml，5ml離心管

5ml，10ml，15ml50ml細胞刮(二)培養(yǎng)細胞常用設(shè)備和用品3.解剖器械

4.微量移液器

(三)培養(yǎng)用品的清洗清洗和消毒滅菌的主要目的是去除器皿上雜質(zhì)及其對細胞生長有影響的物質(zhì)及各種微生物。

1.玻璃器皿：供細胞生長的玻璃表面不但要清潔干凈，而且要帶適當電荷。一般玻璃器皿的清洗分為4步。

(1)浸泡：新的玻璃器皿表面呈堿性，并帶有如鉛等，使用前必須徹底清洗。先用自來水初步刷洗，5％HCl中浸泡過夜，以中和其堿性。使用后的玻璃器皿應(yīng)立即浸入清水中，避免器皿內(nèi)蛋白質(zhì)干涸后黏附于玻璃上難以清洗。

(2)刷洗：去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。有兩點需注意：一是防止損壞器皿表面光潔度，應(yīng)選擇軟毛毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑,不宜用力過猛；二是不留死角,要特別注意瓶角等部位。刷洗后要將洗滌劑徹底沖洗干凈,晾干。

(3)清潔液浸泡：清潔液由濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水配成。具有很強的氧化作用和去污能力,對玻璃器皿無腐蝕。經(jīng)清潔液浸泡后,殘留的未刷洗掉的微量雜質(zhì)可被完全清除。

清潔液可配制成三種不同的強度,其成分用量見下表。弱液

次強液

強液重鉻酸鉀（g）100120

63濃硫酸（ml）

100200

1000蒸餾水（ml）

1000

1000

200

細胞培養(yǎng)物品清洗所需配制的清潔液常為次強液。新配制的呈棕紅色，經(jīng)多次使用、水分增多或遇有機溶劑時為綠色，已失效，應(yīng)重新配制。

10%～30%的硝酸溶液也常用作清潔液。(三)培養(yǎng)用品的清洗(三)

培養(yǎng)用品的清洗

2.橡膠用品：組織培養(yǎng)液中使用的膠塞、培養(yǎng)瓶蓋子、針頭等均不能以清潔液浸泡。清洗過程中，新的膠塞因帶有滑石粉，應(yīng)先用自來水沖洗干凈，再進行常規(guī)清洗；使用后的膠塞、蓋子應(yīng)及時浸泡在清水中。然后用洗滌劑刷洗。

3.塑料器皿：包括各種培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品主要為進口的一次性物品，供應(yīng)商提供給用戶時已消毒滅菌并密封包裝，打開包裝即可使用。由于各種原因，部分實驗室尚未能做到將這類物品完全作一次性使用，仍需經(jīng)過清洗和消毒滅菌后反復(fù)使用。清洗方法通常是：用后立即以流水沖洗干凈或浸入水中，防止干涸。超聲波清洗機內(nèi)加入少量洗滌劑清洗30min，流水徹底沖洗干凈，清潔液浸泡過夜，流水徹底將殘留清潔液沖洗干凈，蒸餾水漂洗2～3次，三蒸水漂洗2次，晾干備用。亦可采用下述步驟：器皿經(jīng)沖洗干凈后，晾干，2％NaOH浸泡過夜，自來水沖洗，5％鹽酸浸泡30min，流水徹底沖洗，蒸餾水漂洗。但不宜反復(fù)使用次數(shù)太多。

（三）

培養(yǎng)用品的清洗

4.包裝:組織培養(yǎng)的器皿需清洗、晾干。在消毒前必須進行包裝，以便消毒及儲存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。一般用皺紋包裝紙、硫酸紙、牛皮紙、棉布等作為包裝材料，對培養(yǎng)瓶、濾器、存放培養(yǎng)液用貯液瓶、吸管和膠塞（或培養(yǎng)瓶蓋子）等物品的容器瓶口部分做局部包裝密封，再用牛皮紙、玻璃紙或布包起來備用。對體積小的培養(yǎng)皿、移液器吸頭等可以全封閉包裝。注射器、金屬器械可直接裝入鋁制飯盒或不銹鋼等容器內(nèi)。重復(fù)使用的培養(yǎng)板則用優(yōu)質(zhì)塑料紙嚴密封口。

（四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒根據(jù)材料的要求可采用不同的消毒滅菌方法?？偟恼f來有物理方法及化學(xué)方法兩大類。物理方法包括用濕熱(高壓蒸汽)、干熱、紫外線、射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物；化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。以下重點介紹組織細胞培養(yǎng)常規(guī)工作常用的幾種消毒方法：

1.干熱消毒：一般在烤箱中進行，主要用于消毒玻璃器皿。干熱消毒后的器皿干燥，易保存。缺點是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要用較高的溫度和較長的時間才能達到消毒的目的，需加溫到160℃，保持90～120min方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。

2.濕熱消毒：濕熱消毒是一種有效的消毒方法,一般使用高壓蒸汽滅菌器進行消毒。為了保證消毒的效果，消毒物品不應(yīng)裝得太滿，以便消毒器內(nèi)氣體流通；導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞，在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，開始升壓，待達到所需要的壓力時，開始記錄時間，并控制壓力恒定。高壓消毒可在5、10、15、20磅的壓力下進行，持續(xù)時間可為10、15、20、30min。

根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時間，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20min，一些常規(guī)使用的液體的消毒要求為15磅15min，橡膠用品為10磅10min。一般認為在這種情況下于1min內(nèi)幾乎可殺死所有微生物，但由于在消毒物品的包裝內(nèi)可能仍有冷空氣未全部排出或蒸汽尚未能達到消毒器內(nèi)的各部分，所以要延長消毒時間。消毒完畢后一定要先打開閥門放氣，再打開消毒器的蓋，以免發(fā)生意外。

（四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒脈動真空滅菌器

消毒滅菌的方法

3.紫外線消毒：紫外線直接照射消毒是目前各實驗室常用的方法之一，主要用于實驗室房間里的空氣、操作臺表面及桌椅等消毒。但在房間內(nèi)安裝不能高于2.5m。要使各處達到0.06μw/cm2的能量照射，否則影響消毒效果。也可以用紫外線消毒一些塑料培養(yǎng)器皿（如塑料培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)板等）。缺點是消毒有死角?，F(xiàn)已有電子滅菌燈可以代替紫外線燈進行實驗室的空氣消毒。

消毒滅菌的方法

4.過濾除菌消毒：血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等不能用高壓消毒的方法進行滅菌，可采用過濾方法除菌。濾器有抽吸(抽濾)式及加壓式兩種類型；濾板(或濾膜)結(jié)構(gòu)可為石棉板、玻璃或微孔膜。

(1)

玻璃濾器：以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上。一般都使用G6型。其缺點是速度較慢。

(2)微孔濾膜濾器：為金屬結(jié)構(gòu)，但其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜。可用于包括血清在內(nèi)的各種培養(yǎng)液的過濾除菌，速度較快，效果較好。微孔濾膜濾器可為加壓式(正壓式)或抽濾式,由于加壓式微孔濾膜濾器過濾效果好、使用方便、易清洗，目前使用最為廣泛。消毒滅菌的方法針頭式濾器消毒滅菌的方法

5.消毒劑及抗菌素：組織細胞培養(yǎng)工作中也可利用消毒劑來進行滅菌處理，消毒劑主要是75％酒精、過氧乙酸、乳酸等化學(xué)制劑。可分別用于操作人員的皮膚、實驗臺、器械、器皿的操作表面，實驗室的桌、椅、墻壁、地面及空氣等的處理。如75％酒精最為常用，用途也最廣泛；0.1％新潔爾滅可對器械、皮膚、操作表面進行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空氣消毒；另外尚有各種用于地面消毒的消毒液（例如三花消毒液、過氧乙酸等）可供選用。

抗菌素也常在組織細胞培養(yǎng)中使用，但多數(shù)是為了預(yù)防。要注意的是不能完全依賴抗菌素來達到消毒滅菌。常用的抗菌素為青霉素和鏈霉素。

消毒滅菌的方法

6.其他方法：

(1)

電子消毒器消毒滅菌：使用市售的電子滅菌器可消毒不宜高熱滅菌的器皿及用物，例如塑料制品等，消毒時間通常為30min，消毒完畢應(yīng)及時關(guān)閉消毒物品容器。

(2)

輻射滅菌：通常采用放射性60Co照射需滅菌的各種不宜高熱滅菌的器皿及用具以及部分實驗用藥物、制劑等。。

(五)無菌操作的基本要領(lǐng)和要求

細胞培養(yǎng)工作中的消毒滅菌方法如上面所述可有多種，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用適當?shù)姆椒ā?/p>

實驗室環(huán)境的消毒：實驗室中空氣的消毒，最理想是采用過濾系統(tǒng)與恒溫設(shè)備結(jié)合使用，但價格較昂貴。亦可用紫外線消毒。另外尚可用乳酸等蒸汽或電子滅菌燈消毒。實驗室的地面多用新潔爾滅溶液等處理。桌椅等亦多用消毒劑消毒處理，最常用的是以酒精擦拭，亦可用紫外線照射。

超凈工作臺的消毒洗手和著裝火焰消毒無菌培養(yǎng)操作

組織細胞培養(yǎng)時除必須有培養(yǎng)基（液）外，還需要水和大量不同的溶液，包括鹽溶液、消化液、緩沖液、抗菌素液及用于檢測的各種染液等。

所需試劑及器械主要包括：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素、純凈水系統(tǒng)、電子天平、pH計、磁力攪拌器、濾器、微孔濾膜、O2、燒杯、量桶、貯液瓶、瓶塞、注射器、三蒸水、胎(小)牛血清、NaOH、HCl、高壓滅菌器等。

平衡鹽溶液(六)細胞培養(yǎng)用液(六)細胞培養(yǎng)用液

1.平衡鹽溶液

平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用，并可供細胞生存所需的能量和無機離子成分，另外尚可用作洗滌組織、細胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。平衡鹽溶液(BSS)主要是由無機鹽和葡萄糖組成，其中無機離子是細胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細胞代謝提供能量。水體外培養(yǎng)細胞對水的質(zhì)量非常敏感，要求很高。水的純度不夠,即使有害元素含量極少對，細胞也會產(chǎn)生不利的影響，有時引起細胞中毒死亡。因此配制所有的培養(yǎng)液和各種溶液應(yīng)使用純化水。組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水。二次蒸餾水或一次蒸餾水可用以清洗器皿或配制一般洗液。平衡鹽溶液

平衡鹽溶液(BSS)主要是由無機鹽和葡萄糖組成，其中無機離子是細胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細胞代謝提供能量。

目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在細胞培養(yǎng)中，BSS用途如下：①作為配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液。②配制各種試液：如配“胰酶”消化液。③用于洗滌組織和細胞。平衡鹽溶液PBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl8.006.808.008.008.00KCl0.200.400.400.200.40Ca(Cl)20.200.140.10Mg(Cl)2·6H2O0.10MgSO4·7H2O0.200.20Na2HPO4·2H2O1.560.061.420.06NaH2PO4·H2O0.14KH2PO40.200.060.200.06NaHCO32.200.350.35Glucose(葡萄糖)1.001.00Phenolred(酚紅)0.020.020.020.02

為了便于保存和減少有關(guān)成分的化學(xué)反應(yīng)，此液可配成20×、10×和5×濃縮液的儲存液(母液)。

10×母液配制法

甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑

NaC180.0gKCl4.0gMgSO47H2O2.0gCaC121.4g(2H2O1.85g)

待完全溶解后，補足三蒸水至500ml。

乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑

Na2HPO40.6g(12H2O1.52g)KH2PO40.6g

葡萄糖10.0g0.4％酚紅50.0ml平衡鹽溶液

消化液（細胞分離液）常用的細胞分離液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和膠原酶等，它們在制備原代細胞時可消化組織、分散細胞，在傳代細胞時使細胞脫離生長表面(瓶壁)和使細胞團離散成單個細胞。它們可單獨使用，也可按一定比例混合使用，這主要取決于所培養(yǎng)細胞的要求。消化液胰蛋白酶

⑴胰蛋白酶:主要來自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞離散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分別能解離125份和250份酪蛋白,胰酶的離散作用與細胞的種類和特性密切相關(guān)。不同細胞系對胰酶溶液的作用濃度、溫度和時間等的要求也不一樣。濃度大、溫度高、作用時間長對細胞的分離能力也越大，但超過一定限度也會損傷細胞、胰酶在pH8.0，溫度37℃時，作用力最強。Ca2+、Mg2+

、血清、蛋白質(zhì)的存在會降低其活力，可用無Ca2+、Mg2+的溶液配制，需要終止消化作用時，可加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液或胰酶抑制劑來終止胰酶對細胞的繼續(xù)作用。

（2）乙二胺四乙酸鈉（EDTA）

EDTA是一種化學(xué)螫合劑，對細胞有一定的解離作用，且毒性小，常用濃度為0.02%。將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用，會提高分散細胞的效力。

0.02%EDTA溶液(亦稱為Versen液)：稱取適量EDTA，用D-Hanks溶液溶解，10磅15min高壓滅菌，分裝小瓶，4℃冰箱保存。用于分散消化細胞。

（3）膠原酶

膠原酶的常用劑量為200U/Ml(約為1mg/ml）。培養(yǎng)用液-消化液

常用培養(yǎng)基（液）培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基，主要來自動物體液或從組織分離提取制備的，其營養(yǎng)成分較高，但成分復(fù)雜，個體差異較大，來源也有一定的限制。

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的，具有一定的組成，是較理想的培養(yǎng)基。但對動物細胞來說，它只能維持細胞的生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充天然培養(yǎng)基，即兩者混合在一起使用,效果更好。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn),促進了組織培養(yǎng)的發(fā)展，避免了生物差異的影響,細胞生長健康透明,延長了體外存活的時間，價廉易制取。培養(yǎng)基（液）

天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血清、組織提取液等。血清是細胞培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。血清中含有許多能維持細胞生長增殖不可缺少的成分，如蛋白質(zhì)、多肽、激素及各種氨基酸、葡萄糖、酮酸等營養(yǎng)成分。

⑴血清：分人血清和動物血清兩大類。細胞培養(yǎng)中最常用的是動物血清，來自牛、馬、兔等動物，其中牛血清比馬血清用得更廣泛。牛血清分為胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）和小牛血清（calfserum，CS）兩種。培養(yǎng)基－天然培養(yǎng)基

FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價格貴；CS是從剛出生但尚未哺乳的小牛中分離到的血清。

購置的血清應(yīng)做熱滅活處理。將小牛血清置于56℃水浴中滅活30分鐘，以破壞補體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4℃冰箱中，無菌試驗陰性。未滅活的血清不穩(wěn)定，應(yīng)保存于-20℃冰箱中。

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。

CS(calfserum)

則是指小牛血清HS(horseserum)則是指馬血清

天然培養(yǎng)基

許多早期的組織培養(yǎng)基主要成分是由動物產(chǎn)品或組織抽提物。1950年。Morgan和他的同事曾報道了他們努力生產(chǎn)一種完全限定營養(yǎng)來源的細胞培養(yǎng)基（69種成分的199配方，開始了人工合成培養(yǎng)基的歷史）。

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是根據(jù)研究和了解細胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基。但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基，它只能維持細胞不死，而不能促進細胞增殖生長，使用時尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培養(yǎng)液等。合成培養(yǎng)基（液）

合成培養(yǎng)基(液)基本成分合成培養(yǎng)基的種類雖多,但一般均含有氨基酸、維生素、糖類、無機離子和一些其他的輔助成分。

隨著科學(xué)技術(shù)的進步和細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人工合成培養(yǎng)基不僅品種增加，配方相對固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養(yǎng)基成分趨于簡單化?，F(xiàn)今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養(yǎng)液比以前已有了較大改進，增減了一些成分，以滿足細胞培養(yǎng)中新技術(shù)的需要。如雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培養(yǎng)基，使用時需補加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進分裂原的反應(yīng)和DNA合成，增加細胞轉(zhuǎn)化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時每升培養(yǎng)液加0.5mL。PHA有市售的商品。合成培養(yǎng)基（液）

人工合成培養(yǎng)基的優(yōu)點

①人工培養(yǎng)基是用已知成分配制，培養(yǎng)條件一致。②它可以精密地測定培養(yǎng)的細胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實驗條件下不同組織細胞的生長和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細胞生長的更趨簡化的培養(yǎng)基。③用人工培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞比較透明清楚，胞漿內(nèi)的顆粒很少，換液時間可適當延長，從而節(jié)省人力、物力。④人工合成培養(yǎng)基克服了天然培養(yǎng)基中可能潛在病毒污染的缺點，有利于培養(yǎng)和研究病毒。⑤培養(yǎng)基成分便于儲存和大量配制，便于細胞大量生產(chǎn)。合成培養(yǎng)基（液）

合成培養(yǎng)基種類已有幾十種。

⑴199培養(yǎng)液

是第一個合成培養(yǎng)基于1950年問世，它含69種成分(見教材P43-45)，幾乎包括了所有的氨基酸、維生素和一些核酸衍生物、生長激素、脂類，加上硝酸鐵和生理鹽溶液，此較為復(fù)雜的合成培養(yǎng)液僅能短時間維持各類細胞的生長，只有加了血清之后才能作為生長培養(yǎng)基。199成分復(fù)雜，最近已不大使用。常用合成培養(yǎng)基（液）

⑵Eagle培養(yǎng)基(DMEM)

常用的是MEM(MinimumEagleMedium，低限量培養(yǎng)基)，僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素，成分簡單，適合各種已建成細胞系的培養(yǎng)，同時宜于添加或減少某些成分，也特別適于特殊研究的細胞培養(yǎng)工作。在它的基礎(chǔ)上改良的DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）應(yīng)用也十分廣泛。

DMEM增加了各成分的用量(雙倍)，葡萄糖用量可選擇低糖(1000mg/L)或高糖(4500mg/L)，對于生長速度較快，附著性較差的腫瘤細胞生長有利。特別應(yīng)用在附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點的克隆培養(yǎng)時，采用高糖的培養(yǎng)液效果較好。常用于雜交瘤技術(shù)中骨髓瘤細胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)。常用合成培養(yǎng)基（液）

⑶RPMl-l640

是一種常用的培養(yǎng)液，最初是針對淋巴細胞的培養(yǎng)而設(shè)計的，問世后發(fā)現(xiàn)能廣泛適應(yīng)許多種類的細胞，包括正常細胞和腫瘤細胞的培養(yǎng)，而且成分簡單，和MEM一樣應(yīng)用十分廣泛。

⑷F12培養(yǎng)基

F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含多種微量元素，最初設(shè)計用于克隆二倍體的中國地鼠卵巢細胞。起初是作為一種無血清配方設(shè)計的，現(xiàn)常補加血清用于支持各種正常的和轉(zhuǎn)化細胞的增殖。F12常和DMEM以1：1結(jié)合，稱為DME/F12培養(yǎng)基(DME/F12medium)，作為開發(fā)無血清配方的基礎(chǔ)，以利用F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營養(yǎng)成分的優(yōu)點。常用合成培養(yǎng)基（液）常用合成培養(yǎng)基（液）

人工合成培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因它提供細胞生存所需的營養(yǎng)成分，還稱為細胞營養(yǎng)液。人工合成培養(yǎng)基有干粉型、1倍工作液型和10倍濃縮型。常用的干粉型培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲存和運輸，使用方便。使用時按照說明書要求配制，要確保營養(yǎng)液所有組分完全溶解，并在消毒和保存過程中不產(chǎn)生沉淀。下面以RPMI-1640培養(yǎng)液為例，簡介配制方法。合成培養(yǎng)基(液)的配制

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液

甲液：RPMI-164010.4g,Hepes2.7～5.4g,三蒸水700ml,磁力攪拌至顆粒完全溶解(3～4h，橙黃色)。

乙液：NaHCO32.0～2.2g,三蒸水30ml。37℃，30min顆粒溶解。將甲、乙兩液混合，加水至終體積1000ml，在4℃靜止2～3h。濾過除菌，分裝，抽樣做無菌試驗，－20℃凍存。

RPMI-1640血清細胞培養(yǎng)液

RPMI-1640基礎(chǔ)營養(yǎng)液80ml滅活小牛血清20ml青霉素、鏈霉素各100U/ml,pH7.1～7.2。合成培養(yǎng)基(液)的配制

血清細胞培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基，常用的是血清、谷氨酰胺等。另外，為防止污染，培養(yǎng)液中還要添加一定量的抗菌素。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物質(zhì)后，叫細胞培養(yǎng)基，也叫完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)基按血清含量多少又分為兩種，即細胞生長培養(yǎng)基和細胞維持培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基(液)的配制

細胞用液的分裝要求①行嚴格無菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時間。②根據(jù)配量準備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規(guī)格、數(shù)量應(yīng)根據(jù)實驗需要準備。避免因包裝瓶過大、貯液時間過長或反復(fù)凍融使用造成營養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內(nèi)用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4℃保存。③分裝前做好分裝量標記，分裝瓶內(nèi)液體量要小于瓶容積的2/3。④做好分裝瓶標記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號。合成培養(yǎng)基(液)的配制

生長液與維持液:血清含有多種促進細胞生長、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度(如2％）血清，僅能維持細胞生存，細胞不能很好生長，這種培養(yǎng)基稱為維持液。加入5％的血清，對大多數(shù)細胞來說，能維持不死和緩慢生長。一般需加入10％－20％血清，有利于細胞生長，稱為生長液。添加血清，雖利于細胞生長，但不明成分也增多了，對分析實驗結(jié)果增加了困難。人們正在探索不用血清的無血清培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基(液)的配制

無血清細胞培養(yǎng)基血清中究竟哪些成分是細胞生長所必需的呢?幾十年來沒有明確答案。還有一些細胞在血清培養(yǎng)基中不能生長。另外，由于血清成分復(fù)雜，常常給細胞培養(yǎng)后的研究工作，如細胞產(chǎn)物的提取、激素和藥物作用機理的研究帶來困難。

1975年，Sato成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株CH4，還有人用HamF12無血清細胞培養(yǎng)基成功地克隆了CHO細胞。近20多年來已報道了幾十種細胞系(株)在無血清細胞培養(yǎng)基中成功地生長和增殖，這些細胞有內(nèi)分泌細胞、表皮細胞、神經(jīng)細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和腎細胞等。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細胞污染，簡化了提純和鑒定McAb、淋巴因子、干擾素等細胞產(chǎn)物的程序，降低疫苗反應(yīng)。無血清培養(yǎng)基(液)

無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:必須根據(jù)不同的培養(yǎng)細胞選用合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI-1640、IMDM、DMEM：F12＝1：1、RPMI-1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培養(yǎng)液為多種細胞使用，根據(jù)不同細胞的要求，每升中補加Hepes15mmol，NaHCO31.2—2.4克。

無血清培養(yǎng)基的補充成分:補充成分即代替血清的各種因子的總稱。多數(shù)無血清培養(yǎng)液必須補加3～8種因子，任何單一因子不能取代血清，至少需兩種。已知有100多種此類因子，其中有些是必需補充因子，如胰島素、硒酸鈉(Na2SeO3)和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其它多數(shù)為輔助作用因子。補充成分按功能將其分成四類。無血清培養(yǎng)基(液)

⑴激素和生長因子:很多細胞用無血清培養(yǎng)時需加入激素，如胰島素(Ins)、生長激素、胰高血糖素等。此外，甾體激素如孕酮、氫化可的松、雌二醇等也是無血清細胞培養(yǎng)時常用的補充因子。每種細胞至少有2～3種生長因子對其正常生存和增殖起著調(diào)節(jié)作用，因此估計機體中約有100多種生長因子。按結(jié)構(gòu)和功能可分為表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等。生長因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細胞倍增時間。無血清培養(yǎng)基(液)

⑵結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白有兩種，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)，它能增強細胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，還可結(jié)合毒性金屬離子，不同細胞需要量不同。另一種是白蛋白，它與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后，具有刺激細胞增殖作用。

⑶貼壁因子絕大多數(shù)真核細胞在體外生長時需要固著于適當?shù)幕?，幫助細胞固著貼附的物質(zhì)叫貼壁因子或胞外基質(zhì)。體外培養(yǎng)細胞常于粘著斑(adhensionplaque)或其近旁發(fā)現(xiàn)纖黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，此處質(zhì)膜下正是紐帶蛋白(vinculin)及α-輔助肌動蛋白(α-actin)存在部位。肌動蛋白絲借助這兩種蛋白質(zhì)附著于質(zhì)膜的內(nèi)表面。FN又與非膠原糖蛋白相連。膜上FN受體將細胞外基質(zhì)FN與細胞內(nèi)肌動蛋白絲相連。這樣，胞外基質(zhì)、細胞膜受體及細胞內(nèi)某些分子直接或間接作用，共同形成細胞結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一體，成為控制細胞形態(tài)、功能、生長、分化以及某些其它性質(zhì)(如影響質(zhì)膜中蛋白質(zhì)的組織等)的重要因素之一。如體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活及分化主要決定于所提供的細胞外基質(zhì)；肌細胞分化，肝細胞和乳腺細胞的形態(tài)、代謝，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程，都與ECM有關(guān)。無血清培養(yǎng)基(液)

⑷微量元素微量元素對細胞長期傳代的作用于1981年由Murakam首先報道。硒元素不僅具有抗過氧化物酶對細胞的毒副作用，還可促進細胞生長。1983年Clereand用一組復(fù)雜的微量元素，使8株雜交瘤細胞生長繁殖。

酶抑制劑實驗證實長期使用無血清細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，會改變細胞的某些特性。是因為在細胞傳代時，常需借助酶的作用，無血清培養(yǎng)基缺乏對細胞保護的成分，殘余的酶會對細胞造成損傷，因此無血清培養(yǎng)基內(nèi)必須添加酶抑制劑以中止殘余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)，使用濃度為0.1％－0.5％，濾過除菌后，將其加在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)。目前無血清細胞培養(yǎng)基仍處在探索階段，尚無固定配方。無血清培養(yǎng)基(液)

pH調(diào)整液:合成培養(yǎng)基大都呈弱酸性，而細胞生長的最適pH為7.0－7.2，可忍耐的pH范圍6.6－7.8。pH到7.6時，細胞雖有代謝但不再分裂增殖，故使用培養(yǎng)基時要調(diào)整pH，并注意培養(yǎng)過程中的pH變化以及時換液。常用的pH調(diào)整液是NaHCO3、HEPES等。細胞培養(yǎng)用液-其他溶液NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.7％。

HEPES:為了較長時間恒定pH，可使用緩沖能力較強HEPES（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基派嗪-N’-2-乙磺酸），使用的終濃度為10－50mmol/L，可以根據(jù)緩沖能力的要求而定。

抗生素液:常用的有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、二性霉素等。常配成100×或200×于使用濃度的鹽溶液內(nèi)，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養(yǎng)液內(nèi)，每小瓶最好一次用完。細胞培養(yǎng)用液-其他溶液

L-Glutamin(谷氨酸)溶液制備

L-Glutamin(分子量146.15)6g

三蒸水200ml

濾過除菌；分裝；－20℃保存；使用時每100ml培養(yǎng)液加lml。(一)原代細胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（primary

culture）從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長。

細胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。

細胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖

克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。

二、細胞培養(yǎng)的方法原代細胞培養(yǎng)方法與步驟

⑴取材⑵消化與分散組織⑶離心和計數(shù)

⑷接種培養(yǎng)⑸觀察

單層細胞培養(yǎng)法（見錄像）和組織塊培養(yǎng)法。

細胞換液：全量換液和半量換液。換液時機的選擇：培養(yǎng)液pH值：細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細胞狀態(tài)。二、細胞培養(yǎng)的方法

鼠胎組織細胞原代培養(yǎng)

取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污。

切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。

消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）細胞傳代培養(yǎng)

⑴原代細胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細胞株。

⑵細胞系傳代以得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)。⑶接觸抑制。⑷營養(yǎng)枯竭。⑸方法：洗細胞，消化，接種，觀察。將培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。(懸浮細胞的直接和離心傳代)

細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同，在一代中，細胞培增3～6次。二、細胞培養(yǎng)的方法

（一）培養(yǎng)細胞的生長特征與形態(tài)分型

1.單層培養(yǎng)細胞的生長過程⑴游離期：懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細胞變?yōu)閳A球形。⑵吸附期：貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁。⑶潛伏期：此時細胞有生長活動，基本無增殖。細胞株潛伏期一般為6～24小時。⑷對數(shù)生長期（增殖期）：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。⑸停止期（平臺期/維持期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性。⑹衰退期：細胞內(nèi)顆粒進一步增多，透明度降低，立體感差。最后細胞皺縮，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，從瓶壁上脫落下來。

三、體外培養(yǎng)細胞的觀察方法

（一）培養(yǎng)細胞的生長特征與形態(tài)分型

2.培養(yǎng)細胞的形態(tài)分類按生長方式:貼壁型細胞（Monolayercells）。懸浮型細胞（Suspensioncells）。絕大多數(shù)有機體細胞屬貼壁型細胞，只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。按細胞形態(tài)(貼壁細胞）：成纖維型細胞（Fibroblast-likedcells）。上皮型細胞（Epithelium-likedcells）。其它，不定型。

三、體外培養(yǎng)細胞的觀察方法成纖維型細胞梭形或不規(guī)則三角形中央有卵圓形核胞質(zhì)向外伸出長短不同的突起中胚層間質(zhì)起源

上皮型細胞扁平不規(guī)則多角形細胞中央有圓形核緊密相連單層膜樣生長內(nèi)、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等

游走型細胞散在生長，一般不連成片細胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起活躍的游走或變形運動羊水細胞培養(yǎng)的早期多形細胞型難以確定規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)如神經(jīng)組織的細胞等

（二）細胞計數(shù)方法與顯微測量三、體外培養(yǎng)細胞的觀察方法

（一）細胞的凍存方法四、培養(yǎng)細胞的凍存、復(fù)蘇與運輸冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：4℃30～60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時（或過夜）→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細胞濃度控制在：5×106～2×107/ml。常用細胞冷凍保存液5%或10％DMSO(二甲基亞砜，終濃度＜1%)＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液不含DMSO細胞凍存液

（二）細胞的復(fù)蘇四、培養(yǎng)細胞的凍存、復(fù)蘇與運輸快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中(一)生長曲線的測定五、培養(yǎng)細胞增殖動力學(xué)方法細胞懸液制備接種細胞技術(shù)繪制生長曲線

(二)分裂指數(shù)測定分裂指數(shù)＝分裂細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

(三)克隆(集落)形成試驗

(四)BrdU滲入法測定細胞增殖指數(shù)(一)細胞污染的種類六、細胞培養(yǎng)的污染和檢測

細菌、酵母菌、霉菌和病毒

(二)污染源

無菌操作技術(shù)不當操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細胞

白色念珠菌污染真菌感染

支原體污染電鏡照片,煎蛋狀和其他形狀95％以上是以下四種支原體：口腔支原體(M.orale)，精氨酸支原體(M.arginini)，豬鼻支原體(M.hyorhinis)，牛萊氏無膽甾原體(A.laidlawii)