9.1基于Southern雜交技術的分子標記9.2隨機（或半隨機）引物分子標記技術9.3序列標志位點技術9.4分子標記的應用領域9DNA分子標記技術DNA分子標記的定義

DNA分子標記就是在同一物種不同個體間DNA序列上的差異，某一特定的差異可以通過實驗的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定的DNA分子標記。利用不同的實驗方法可以得到許許多多的DNA分子標記，這些DNA分子標記表明了這些個體間遺傳物質上的差異。遺傳標記的發展形態標記→

細胞學標記（染色體多態性）→

蛋白質標記（同工酶，分子標記）→

DNA標記（分子標記）RFLP

分析

RFLP（restrictionfragmentlengthpoly-morphism）稱為限制性片段長度多態性。當用某種限制性內切酶處理不同生物個體來源的DNA時，由于個體間DNA序列的差異，所產生的切割片段長度和數量可能不同，利用凝膠電泳可以將這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是RFLP。RFLP

分析

RFLP產生的差異帶可以作為分子標記，用于遺傳學的研究。當一個生物有多條染色體，且DNA分子很大時，用一種限制性內切酶切割出的DNA片段太多，電泳后的條帶無法分辨。

使用某一特定序列的標記探針，與電泳分離的片段進行Southern雜交，再顯示出雜交帶，可以大大減少被觀察條帶的數目，便于不同生物個體間的比較和找出差異帶。RFLP

分析

換不同的限制性內切酶切割，配合不同的標記探針，可以得到數目多得驚人的條帶，從而找到很多的分子標記。這些分子標記與表型標記一樣，可以用于遺傳學的研究。但分子標記沒有顯隱性之分，都是共顯性的。采用一種探針

作6

個栽培品種的RFLP分析RFLP所用探針的來源

RFLP分析的效率依賴于選擇合適的探針。由于用能探測重復序列的探針探測出的片段太多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低重復序列。常用的RFLP探針主要來源于隨機基因組克隆和cDNA克隆。RFLP所用探針的來源

由于基因組DNA中甲基化一般很少在表達基因中發生，故用對甲基化敏感的限制酶切，可得到長度為1～2kb的DNA片段，它們是單拷貝或低重復序列，用這些片段制成文庫，即可用作RFLP探針。

如果用cDNA克隆作探針，最好制備來自生物整體mRNA的cDNA文庫。RFLP標記的共顯性什么是多態性

多態性是在不同個體之間比較得到的差異帶，來自于一個個體本身的長短不等的片段不是多態性。RFLP標記的優點1.RFLP標記無表型效應，不受環境條件和發育階段的影響。因此可在特征性狀遠未出現之前就可以知道其基因型。2.

RFLP標記在等位之間是共顯性的，因此不受雜交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是在F1代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。3.用不同探針可以探測出不同的RFLP標記，標記的密度遠遠超過以性狀為基礎的圖譜。RFLP

的不足

雖然RFLP分子標記有這些優點，但實驗步驟較多，費工費時，費用也高，使其應用受到一定的限制。

要使RFLP在指導遺傳育種中發揮作用，還必須將RFLP與已知性狀聯系起來，僅有RFLP標記圖使用價值不大。可變數量串聯重復（VNTRs）

在真核生物基因組中有小衛星和微衛星序列存在，它們是短序列（核心序列）高度重復的序列，在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復的次數有很大差異，并且這些重復序列有多座位性，因此形成了高度的多態性。用某種高度重復序列的核心序列作探針，測定其RFLP，得到電泳后的雜交圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、親子鑒定等。VNTR一例Thecauseofthevariationbetweenindividualgenomesatmicrosatellitesorminisatellitesisthatindividualalleleshavedifferentnumbersoftherepeatingunit.Forexample,oneminisatellitehasarepeatlengthof64bp,andisfoundinthepopulationwiththefollowingdistribution:

7%18repeats11%16repeats43%14repeats

36%13repeats4%10repeatsVNTR差異帶的檢測父母子女間VNTR的檢測結果VNTR應用舉例

用33.15（探針名）進行白種人的DNA指紋分析時，兩個無血緣關系的個體具有相同DNA指紋圖譜的概率為3×10－11，而當把33.15和33.6兩個探針取得的結果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜相同的概率更是降低到5×10－19。隨機擴增多態DNA（RAPD）

RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）稱為隨機擴增DNA多態性。它是利用隨機引物（通常為10個核苷酸）對不同生物個體基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經電泳分離，溴化乙錠染色，顯示出擴增產物的多態性。不同個體間差異的條帶可以作為分子標記。兩個不同油菜品系的RAPDRAPD的特點雖然對具體的一個引物而言其檢測DNA多態性的位點是有限的，但是當采用一組引物時，檢測區域幾乎可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組DNA的多態性。RAPD的特點是操作簡便迅速，不需要標記探針。只要有一套隨機引物就能對任何物種進行RAPD操作。RAPD標記也必須與表型相聯系才能發揮指導遺傳育種的作用。MAAP技術比較

DAFAP-PCRRAPD引物長度(nt)5～1520～349～10引物濃度(mmol/L)3～3030.3典型擴增產物條帶

10～1003～501～10分辨率

高

中等

低分離膠

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺

瓊脂糖顯色

銀染

放射性標記

溴化乙錠染色嚴謹度

低或高

低和高

低(Multiplearbitraryampliconprofiling)DAF：DNAamplificationfingerprinting

AP-PCR：arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction

MAAP結果比較AFLP

AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymor-phism,擴增酶切片段多態性）又稱為SAP（Specificamplifiedpolymorphism,專一擴增多態性），它結合了RFLP和PCR二者的優點，經過酶切和用特異引物擴增，檢測DNA的多態性。由于退火溫度高，結果重復性好，具有RAPD無法比擬的優越性。它是一種高效的分子標記，可用來構建高密度的遺傳圖譜。

AFLP

指紋技術

先用兩種限制性內切酶（A和B）對基因組DNA切割，得到兩個粘性末端為A－A、A－B、B－B三種片段。將A和B兩種接頭加到這些片段的兩端，再用相應的A和B引物對這些片段進行PCR擴增，只有A－B片段可以被擴增。擴增產物用電泳檢測其多態性。通過換用不同的限制酶及不同的引物，可以控制擴增條帶的數目，檢測不同的分子標記。圖9－5AFLP指紋技術用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

EcoRⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-CTCGTAGACTGCGTACC

--GAATTC--

CAT

CTGACGCAT

GGTTAA-5’

--CTTAAG--

↑EcoRⅠ端

引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GACTGCGTACCAATTCNNN↑用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

MseⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-GACGATGAGTCCTGAG--TTAA--

TACTCAGGACTCAT-5’--AATT--

↑

MseⅠ端引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GATGAGTCCTGAGTAANNNAFLP對酶切位點的要求

AFLP一般采用雙酶切，一個酶切點多（識別4堿基），另一個酶切點少（識別6堿基）。切點多的酶產生較小的片段，切點少的酶能夠減少可擴增片段的數目。這兩種酶都必須產生粘性末端。如果用EcoRⅠ（識別6堿基）和MseⅠ（識別4堿基）組合，則產生的酶切片段有三種：即MseⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/EcoRⅠ。如果按酶切位點隨機分布來算（256，4096），MseⅠ/MseⅠ片段占90%以上，EcoRⅠ/MseⅠ片段為EcoRⅠ酶切位點數的兩倍，而EcoRⅠ/EcoRⅠ幾乎沒有。AFLP對引物的要求

引物分為三個部分，分別為CORE、ENZ、EXT，其中CORE與人工接頭中的CORE互補，ENZ與粘性末端序列互補，EXT為選擇性堿基。引物一般16到25個堿基，引物3’端的選擇性堿基每增加1個，譜帶數減少。而選擇性堿基GC含量越高，產生的譜帶數越少，所以通過調整選擇性堿基的數目和種類，就能靈活地調節擴增譜帶數。隨著選擇性堿基的增加，引物與模板的錯配率也相應增加，為了控制錯配率，選擇性堿基一般為1～3個。AFLP的PCR擴增

對于較復雜的基因組來說，AFLP的PCR擴增可分兩步進行，第一步預擴增一般采用2種只帶1個選擇性堿基的引物，引物不被標記，擴增后稀釋10倍，取少量作為第二次擴增的模板，這樣既為第二步擴增提供了充足的模板，又對模板起到了選擇性純化的作用，第二次擴增采用帶有2～3個選擇性堿基的引物，引物被標記，這樣可以提高擴增的特異性。用EcoRI和MseI引物只擴增EcoRI-MseI片段ⅠⅡⅢⅣABCABCABCABC引物組合Ⅰ：EcoRI+C/MseI+ACⅡ：EcoRI+C/MseI+CAⅢ：EcoRI+T/MseI+AGⅣ：EcoRI+T/MseI+ATA：標記EcoRI引物B：標記MseI引物C：標記MseI引物，但不加

EcoRI引物只擴增EcoRI-MseI片段的原因(i)TheMseIprimerhasalowerannealingtemperaturethantheEcoRIprimer,makingamplificationofMseI-MseIfragmentslessefficientcomparedwithEcoRI-MseIfragmentsundertheconditionsused.WehaveindeedobservedstrongeramplificationofMseI-MseIfragmentsusinglongeroralternativeMseIprimersandadapters.只擴增EcoRI-MseI片段的原因(ii)TheMseI-MseIfragmentshaveaninvertedrepeatattheends,duetothefactthattheyareamplifiedbyasingleprimer.Therefore,astem-loopstructuremaybeformedbybase-pairingoftheendsofthefragments.whichwillcompetewithprimerannealing.ThisisalsoconfirmedbytheobservationthatonlylargerfragmentswereamplifiedinAFLPreactionswhenonlytheMseIprimerwasadded.Formationofastem-loopstructurewillbemoredifficultintheselargerfragments.引物5’端以G開頭的原因AnimportantfeatureoftheAFLPprimersisthatallprimersstartwitha5’guanine(G)residue.Wehavefoundthata5’G-residueintheunlabeledprimeriscrucialtopreventthephenomenonofdoublebands.Thedoublebandsappearedtoresultfromincompleteadditionofanextranucleotidetothesynthesizedstrands.ThisterminaltransferaseactivityoftheTaqpolymeraseisquitestrong.

Weconcludefromourresultsthatthisterminaltransferaseactivityismoststrong(almost100%ofthesynthesizedstrands)whenthe3’nucleotideofthesynthesizedstrandisacytidine(C).

引物3’端選擇性堿基數目對擴增特異性的影響ⅠⅡⅢABCDABCDABCD引物組合Ⅰ：EcoRI+A/MseI+CTCAⅡ：EcoRI+A/MseI+CTGCⅢ：EcoRI+T/MseI+CTCAA：MseI引物帶1個選擇性堿基B：MseI引物帶2個選擇性堿基C：MseI引物帶3個選擇性堿基D：MseI引物帶4個選擇性堿基序列標志位點技術

序列標志位點（sequencetagsites，STS）技術是一類基于特定引物序列形成的，利用PCR技術進行的分子標記技術。

SSR是序列標志位點技術中的一種，它以某一微衛星座位兩側的單一序列設計引物，擴增這個微衛星位點的序列，然后電泳檢測產物的大小。由于在不同生物個體中這個座位核心序列的重復次數可能不同，同一個體的兩條染色體的這個座位核心序列的重復次數也可能不同（雜合體），這個座位有許多不同長度的等位“基因”（復等位“基因”）。SSR就是檢測不同個體間等位“基因”在長度上的差異。圖9－6微衛星序列長度多態性測定圖9－7大豆ATT5SSR位點14個等位基因的大小單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)

SNP是指基因組內DNA某一特定位置的核苷酸存在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等位基因在群體中突變頻率不小于1%。SNP一般以替換為主，顛換與轉換之比為1:2。轉換（transition）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。顛換（transversion）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所替代或嘧啶堿基被嘌呤堿基所替代。SNP的研究狀況

目前人類基因組研究中SNP的研究最為廣泛。大多數SNP對蛋白質無直接的影響，因為絕大多數的SNP位于非編碼區。目前已有的人類基因組SNP圖譜中共有142萬個SNP，但只有約4.23%的SNP位于外顯子內。

除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物上也開展了SNP研究。在植物中展開SNP廣泛研究的種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、水稻等農作物上開展了此項工作。

編碼區內SNP的意義

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的SNP（codingSNP，cSNP）比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。SNP的影響

從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：

一種是同義cSNP（synonymouscSNP），即cSNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同。

另一種是非同義cSNP（non-synonymouscSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。SNP用作遺傳標記的優點

SNP用作遺傳標記具有以下優點：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。（2）它在基因組中的分布較微衛星標記廣泛得多。（3）與串聯重復的微衛星位點相比，SNP是高度穩定的，尤其是處于編碼區的cSNP，而串聯重復的微衛星位點的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現困難。SNP用作遺傳標記的優點（4）部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。（5）易于進行自動化、規模化分析，縮短了研究時間。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。檢測單核苷酸差異的方法單鏈構象多態性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）

DNA片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下會折疊成不同的空間構象，單鏈這種構象會因個別核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時由于構象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態性。在SSCP分析時，應先將擴增后的DNA片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。檢測單核苷酸差異的方法基因芯片法

其基本原理是利用DNA分子的變性雜交特性，通過DNA芯片上的固定探針或樣品DNA與游離樣品DNA或探針雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發生與否可采用熒光標記技術來檢測。由于該技術可將大量探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量DNA分子進行檢測分析，解決了傳統印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子少、效率低的問題。近年來的實驗結果指出，一次實驗就可以同時分析成千個多態