參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物細胞內DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸一、PCR（多聚酶鏈式反應）1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。它能以極少量的_____為模板，在短時間內復制出上百萬份的DNA拷貝。2．原理1)DNA的熱變性：在80～100℃的溫度范圍內，DNA_________結構解體，雙鏈分開，這個過程稱為_____。當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈。2)子鏈的合成：①需要______；②合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。多聚酶鏈式反應DNA雙螺旋變性引物3、PCR反應過程PCR一般要經歷三十多次循環，每次循環可以分為____、復性和延伸三步。（1）變性：當溫度上升到______以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。（2）復性：溫度下降到_______左右，兩種引物通過________________與兩條單鏈DNA結合。（3）延伸：溫度上升到_____左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在_______________的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。變性90

℃50

℃堿基互補配對72

℃DNA聚合酶1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1～3步30輪DNA復制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復性（退火）

→

延伸PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復制第一次復制555555模板DNA5555555525～30次循環（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。三、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5mL3、微量移液器

用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質上是能夠自動調控溫度的儀器PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，它可以根據DNA的熱變性原理，通過自動改變溫度，達到擴增DNA片段的目的。4、離心機一種通過高速轉動產生離心現象，能將固體與液體分開的設備。（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環程序（反應）循環數變性復性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：實驗注意事項1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。3每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。4混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調零→測定→計算50倍蒸餾水做對照波長260nm處讀數（一）理論上DNA擴增數目的計算1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理

可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關光吸收波長／nm2602402202800.10.22、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數調節至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數)×稀釋倍數體內DNA復制與PCR的技術區別：體內復制PCR技術解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。復制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸課堂小結多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設置工作參數DNA擴增測定含量稀釋調零測定并讀數計算練習鞏固：1.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是

A.反復洗滌B.不