發光(fāɡuānɡ)免疫分析法

LuminescenceImmunoassay精品資料一．概論免疫性是動物在長期進化過程中逐漸發展起來的防御感染和維護機體完整性的十分有效而靈巧的手段。免疫系統的特殊功能是識別“自我”和“非自我”的物質，對自身的物質不起反應，而對外源的及體內改變了的物質則能起專一(zhuānyī)的免疫反應，排除其對機體的危害。另一方面，免疫系統還擔負著維持機體免疫狀態的自身穩定性，以清除體內衰老和突變的細胞。精品資料1．抗體和抗原（Antigen,Antibody）免疫學的重要對象是抗原和抗體的反應問題(wèntí)。抗原是一種外來物質，當其進入動物體內能引起抗體的產生，并能和抗體反應的物質。抗體(antibody.Ab)與抗原(antigen.Ag)的結合具有極高的專一性和親合性。不能誘導產生抗體，但能和適當抗體起反應，即有免疫反應性的簡單分子稱為半抗原。

精品資料（1）抗原蛋白質，多糖(duōtánɡ)，核酸，合成多肽，低分子物質（2）抗體抗體是一種蛋白質（主要是γ-球蛋白質）血清蛋白質在自由電泳場中白蛋白α-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白抗體存在于β-球蛋白和γ-球蛋白內這些蛋白質稱為免疫球蛋白IgM.IgA.IgG.IgD和IgEγM.γA.γG.γD.γE精品資料2.放射性免疫分析（RIA）1959Berson和Yallow將免疫反應與分析化學相結合創立了放射性免疫分析法。荷爾蒙的測定先將荷爾蒙注入天竺鼠體內對抗此抗原的抗體(kàngtǐ)（Ab）Ag*+Ab===Ag*-Ab要測定一病人的血清標本中荷爾蒙的濃度，Ag+Ag*-Ab===Ag-Ab+Ag*(+Ag*-Ab)測定Ag*，可計算標本中所含有的荷爾蒙（Ag）濃度1977獲諾貝爾醫學生物學獎精品資料分析對象：測量含量很低的生物活性化合物：如蛋白質（酶，接受體，抗體）激素（甾族化合物，甲狀腺激素，酞激素）藥物及微生物等。優點：專一性強，靈敏度高缺點：①放射性同位素可能損害(sǔnhài)人們的身體健康，以致于實驗室要有特殊防護技術②該法還需要用貴重的閃爍計數器和試劑③穩定性-同位素的壽命相對較短

精品資料3酶免疫(miǎnyì)分析法用酶標記抗原或抗體例：酶聯免疫法測定氯霉素微量反應板——羊抗兔IgG抗體兔抗氯霉素抗體+氯霉素酶結合物+氯霉素樣品沒有結合的酶結合物被洗去，再向相應孔中加入過氧化氫和鄰苯二胺，作用一定時間后，結合后的酶結合物將無色的鄰苯二胺轉化為藍色的產物，加入終止液后顏色由藍變黃，用波長450nm（雙波長時最適參考波長≥600nm）酶標儀進行檢測，吸光值與樣品中氯霉素含量成反比。酶不穩定(wěndìng)、光度分析線性范圍窄

精品資料競爭(jìngzhēng)型酶聯免疫法測定氯霉素含量示意圖精品資料4.發光免疫分析法熒光免疫分析法化學發光免疫分析法以熒光物質或化學發光反應物質作為標記物。優點：專一性強靈敏度高穩定性好，可避免放射性污染標記物不同，因而(yīnér)檢測方法也不同精品資料二．熒光(yíngguāng)免疫分析法FluonescenseImmuuoassay1．熒光(yíngguāng)探針（1）

一般要求a檢測最常遇到的樣品為血清，它有很高的熒光(yíngguāng)背景。

血清蛋白λem325-350nm(λex280nm)血清中NADH和膽紅素430-470nm(λex330-360nm)探針λem>500nm精品資料b.熒光探針的斯托克斯位移〉50nmc.熒光探針的摩爾吸光系數要大熒光產率應盡可能高d.熒光探針要穩定，且聯結于抗體或抗原時不應損害(sǔnhài)它們的活性e.熒光探針的激發波長應位于可見光區，因為較長波長處熒光雜質較少λex應位于vis區精品資料(2)有機探針

熒光黃常用的探針熒光產率高，有較好的光穩定性和低的溫度系數。其缺點是斯托克斯位移較小。在堿性的條件下，熒光黃與免疫球蛋白IgG的自由氨基起反應(fǎnyìng).

羅丹明類化合物廣泛用來標記抗體和熒光黃相比，其熒光產率不如熒光黃，可是其發射波長較長，樣品背景干擾較少。此外，羅丹明類亦常作為能量轉移的接受體。精品資料(3)

金屬(jīnshǔ)螯合物某些稀土金屬(jīnshǔ)離子會與某些配位體生成會發強熒光的配合物。如：Eu(Ⅲ),Tb(Ⅲ),Nd(Ⅲ)與β-二酮衍生物對-氨基甲酰三氟丙酮聚氨羧酯鹽鄰菲羅啉

稀土金屬(jīnshǔ)離子配合物lifetime50~1000s熒光背景103~106倍

精品資料2．熒光免疫檢測法的類型（1）均質檢測法均質檢測法不需要分離步驟，方法簡便快速，但它常受到來自背景（血清）的干擾，該法系根據已標記抗原聯接于抗體時發生已標記抗原熒光性質(xìngzhì)的改變。通常將均質檢驗法分為：

熒光增強法熒光猝滅法間接猝滅法熒光激發轉移水解法熒光偏振法精品資料a．熒光增強法本法基于當標記物的抗原(kàngyuán)聯接于抗體時原標記的抗原(kàngyuán)熒光強度增強。b．熒光猝滅法當被標記的抗原(kàngyuán)聯接到抗體時熒光的量子產率下降，例如慶大霉素的測定，將限量的抗體加入一已被標記和未標記的慶大霉素混合物中，熒光猝滅程度與慶大霉素量相關。c.間接猝滅法

精品資料d.熒光激發轉移如熒光黃作為給予體，羅丹明作為接受體，熒光黃的熒光與羅丹明的吸收光譜重疊，后者可吸收前者的熒光。例：嗎啡的測定i)用熒光黃（F）標記抗原(kàngyuán)羅丹明（R）標記抗體Ag+AgF+AbR(Ag-AbR)+(AgF-AbR)Ag的存在減少了熒光的猝滅程度

精品資料ii)抗體既是給予(jǐyǔ)體又是接受體Ag+AbF+AbRAbF-Ag-AbRe.水解法精品資料2）非均質檢測法非均質檢測法在檢測之前，必須進行分離。既游離的已標記的抗原(kàngyuán)必須從聯接于抗體的抗原(kàngyuán)中分離出來，或者未聯接的已標記的抗體從抗原(kàngyuán)聯接的部分分離出來。其分離可通過離心沉降，或固相聯接抗原(kàngyuán)（或抗體）來實現。固相型檢測法包括競爭性和非競爭性反應的標記抗原(kàngyuán)或抗體

抗原(kàngyuán)聯接于聚合物表面-----免疫吸附劑

精品資料

時間分辨熒光法消除樣品背景干擾(gānrǎo)的另一種方法是時間分辨熒光法。樣品背景的熒光壽命一般為10ns，而鑭系鰲合物的熒光壽命一般為10-100μs。且斯托克斯位移較大，很適用于時間分辨法進行測定。精品資料精品資料時間(shíjiān)分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）精品資料精品資料熒光(yíngguāng)免疫分析法優點：

消除放射性同位素的污染

穩定性較好缺點：高的背景光，限制了靈敏度干擾測定精品資料三．化學發光免疫分析法這種分析方法既有發光檢測(jiǎncè)的高靈敏度，又有免疫分析法的特異性。1．主要發光體系

魯米諾，異魯米諾及其衍生物焦焙酚光澤精吖啶酯1，2-雙氧基化合物過氧化草酸酯

螢火蟲發光體系細菌發光體系精品資料2.發光標記物（1）發光反應中消耗掉的標記物a．Luminol及其衍生物Luminol偶聯于配體后，其發光效率較低Isoluminol及其衍生物被廣泛應用

Luminol的氨基取代導致Ф降低(jiàngdī)Isoluminol的氨基取代導致Ф增加

此類標記可用于各種分析物，但CL需催化劑，因此有較高的背景信號。精品資料精品資料b．吖啶酯類不需要催化劑

優點：高量子產率，低背景信號和易于與蛋白質連接，主要用于標記半抗原和蛋白質。缺點：光發射是瞬時的c．過氧化草酸酯優點：靈活性缺點：過氧化草酸酯水溶性較差，極易水解(shuǐjiě)。二氧雜四元環酮延長的光發射、低背景、寬的線性范圍精品資料（2）不起發光反應的標記物這類標記物在發光過程中不被消耗，反應過程中起催化作用的物質。a．過氧化物酶（peroxidase,POD）Luminol+H2O2—用POD標記分析物b．蟲熒光素酶，細菌熒光素酶酶成本昂貴，不穩定，熒光酶基因(jīyīn)的制造c．熒光物質作為標記物熒光素，丹璜酰氯，熒光胺，羅丹明精品資料（3）酶標記物GOD和G-6-PDH利用某些酶作為(zuòwéi)標記物，然后通過標記的酶催化生成的產物，再作用于發光物質，以產生生物發光和化學發光。葡萄糖

（4）固相法發光免疫分析它不需要離心處理，操作簡便，精確度高，所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球精品資料競爭法：（檢查小分子抗原多采用）啟動發光(fāɡuānɡ)試劑Ag+Ag-L+AbAg-Ab+Ab-Ag-L—————h精品資料夾心(jiāxīn)法：（檢查大分子抗原多采用）

Sp-Ab+AgSp-Ab-AgSp-Ab-Ag+Ab-LSp-Ab-Ag-Ab—啟動發光試劑———hv其中:L為發光標記物或發光底物,Ag為抗原,Ab為抗體,Sp為固相。精品資料精品資料精品資料ACS180由德國拜耳公司生產，商品名為ACS180全自動化學發光免疫分析系統(xìtǒng)有ACS180Plus和ACS180sE等型號,2000年又推出新—代的ADVIACentaur免疫測定系統(xìtǒng)吖啶酯可通過化學反應直接標記抗體或抗原當在堿性介質中氧化時，經過一個二氧酮的中間體，產生一個電激發的10一甲基吖啶酮，當它回復到基態時釋放出光子精品資料精品資料精品資料模塊化組合分析系統(xìtǒng)<E>精品資料Elesys(10102010E-170)瑞士羅氏公司(Roche)的ElecsysECLIA系統，綜合了各種先進技術，具有獨特的優越性，是目前在醫學檢驗中應用的唯一的電化學發光免疫測定儀器這三臺檢測系統均應用了電化學發光免疫測定及有關先進技術，其測試的靈敏度和特異性相同，有完善(wánshàn)的使用說明，試劑通用，操作也有相同之處。儀器設計上有一些差異，主要不同在于工作量的差別精品資料精品資料精品資料精品資料3化學生物(shēngwù)發光免疫分析法的特點（1）優點：高靈敏度寬的線性范圍分析速度快高選擇性高穩定性花費少所用試劑無毒消除放射性同位素的污染。

精品資料（2）缺點：實驗結果的重復性方面存在一定問題發光免疫測定是一種瞬時的化學反