4微生物次級代謝與調節次級代謝產物(Secondarymetabolites)是某些微生物在生命循環的某一個階段產生的物質，它們一般是在產生菌生長中止后合成的。微生物產生的次級代謝物有抗生素、毒素、色素和生物堿等。2/4/20231現代工業發酵調控學郭曉燕4.1.1微生物次級代謝的特征

次級代謝產物一般不在產生菌的生長期產生，而在隨后的生產期形成。種類繁多，含有不尋常的化學鍵，如氨基糖、苯醌、香豆素、環氧化合物、麥角生物堿、吲哚衍生物、吩嗪、吡咯、喹啉、萜烯、四環類抗生素等。一種菌可以產生結構相近的一簇抗生素。例如，產黃青霉能產生至少10個具有不同特性的青霉素。2/4/20232現代工業發酵調控學郭曉燕2/4/20233現代工業發酵調控學郭曉燕微生物次級代謝的特征一簇抗生素中各組分的多少取決于遺傳與環境因素。次級代謝物合成所涉及的酶的特異性較低；而初級代謝方面的特異性總是很高，因差錯會導致致命性的后果。次級代謝方面的差錯對細胞的生長無關緊要，改變后的代謝產物有些還保留生物活性。2/4/20234現代工業發酵調控學郭曉燕微生物次級代謝的特征有人認為，次級代謝產物之所以種類繁多，就是因為酶的底物特異性不高所致。他們把次級代謝過程又稱為多向代謝作用(pleometabolism)。2/4/20235現代工業發酵調控學郭曉燕微生物次級代謝的特征

一種微生物的不同菌株可以產生多種在分子結構上完全不同的次級代謝產物，例如，灰色鏈霉菌不僅可以用于生產鏈霉素，還可用來生產白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰綠霉素等。不同種類的微生物也能產生同一種次級代謝產物。次級代謝產物的合成對環境因素特別敏感。其合成信息的表達受環境因素調節。如對抗生素的合成需在較低的磷酸鹽濃度0.1~10mM范圍內進行，而生長能耐受的范圍平均要大10倍，即0.3~300mM。2/4/20236現代工業發酵調控學郭曉燕微生物次級代謝的特征微生物由生長期向生產期過渡時，菌體在形態學上會發生一些變化。例如，一些產芽胞的細菌在此時會形成芽胞，真菌和放線菌會形成孢子。因此，有人把次級代謝產物的合成作用看作是細胞分化的伴隨現象。微生物的次級代謝產物的合成過程是一類由多基因控制的代謝過程。這些基因不僅位于微生物的染色體中，且位于質粒中，并且染色體外的基因在次級代謝產物的合成中往往起主導作用。2/4/20237現代工業發酵調控學郭曉燕吖啶黃插入質粒DNA雙鏈堿基對之間，造成堿基對增加或減少，高溫則使質粒變性。它們使原來產生抗生素的質粒不能復制，從而影響抗生素的產生，說明了質粒控制著抗生素的合成。從春日霉素和金絲霉素產生菌春日鏈霉菌的體內分離出質粒，經電鏡觀察有三種不同長度（15μm、3.4μm和0.59μm）的DNA。含有15μmDNA的質粒控制春日霉素的合成；含有3.4μmDNA的質粒，控制金絲霉素合成。2/4/20238現代工業發酵調控學郭曉燕4.1.2次級代謝產物的類型

可根據次級代謝產物分子中的主要組分與初級代謝的關系，把次級代謝產物分成五個基本類型糖類許多次級代謝產物在結構上明顯與糖類物質有關。它們的前體物質都是葡萄糖，但是它們的結構在次級代謝過程中被修飾了。例如，鏈霉素，新霉素和卡那霉素等均是分子結構被修飾了的寡糖類抗生素。2/4/20239現代工業發酵調控學郭曉燕鏈霉素是由鏈霉胍、鏈霉糖和N-甲基-L-氨基葡萄糖胺三部分組成。2/4/202310現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝產物的類型多肽類同糖類物質一樣，氨基酸或其聚合物(多肽)在次級代謝過程中常常被修飾，形成多肽類抗生素。例如鏈霉菌產生的放線菌素是由寡肽構成的。還包括芳香族氨基酸或其他氨基酸合成途徑的中間體產物被修飾后形成的抗生素。例如，委內瑞拉鏈霉菌產生的氯霉素和頭狀鏈霉菌產生的絲裂霉素C等。2/4/202311現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝產物的類型聚脂酰類這類化合物均以活性脂酰作為前體，通過聚合作用形成的。由乙酰輔酶A可以形成兩類自身縮合產物：一類是通過頭尾聯接的聚乙酮(酰)化合物；另一類是通過新形成的活性異戊二烯的寡聚作用形成的化合物。這類化合物可形成萜類、甾類和類胡蘿卜素類次級代謝產物。屬于這類次級產物的有水稻惡苗病菌產生的赤霉素等。2/4/202312現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝產物的類型核酸堿基類似物類此類次級代謝產物的合成明顯地與核酸堿基的合成相關。它們或者由細胞中現成的核苷酸經化學修飾轉變而來，或者通過與核苷酸生物合成相似的過程合成而來。例如6-氨基嘌呤，焦土霉素，狹霉素，蛹螬菌素等。2/4/202313現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝產物的類型其它類型微生物還產生一些不屬于上述四種類型的次級代謝產物。因為人們很難根據這類化合物分子中的組分的來源，把它們歸于上述任何一種類型的次級代謝產物。2/4/202314現代工業發酵調控學郭曉燕4.1.3抗生素的生源學(Biogenesis)

生源學又稱為生物發生學，是指一些天然物質，包括有生命的物質為什么會發生，存在的學問，它對宿主，環境有何作用？抗生素生源學研究一些微生物為什么會產生這類對其它微生物，甚至對其自身有害的物質,其功能是什么？在這方面的了解將有助于解釋抗生素的形成機制和控制其生產。2/4/202315現代工業發酵調控學郭曉燕抗生素的生源學(Biogenesis)

1)合成次級代謝物是作為儲藏物。2)作為正常代謝的無用的副產物。3)大分子消化后殘留的碎片。4)解除體內有害代謝物的毒性。5)支路代謝物。6)競爭需要用于抑制其它微生物，爭奪有限的養分。2/4/202316現代工業發酵調控學郭曉燕抗生素的生源學(Biogenesis)7)進化遺留所致。8)在自然界具有生態上功能。9)調節功能，至少與形態學，分化方面有關。10)代謝維持產物，其作用主要是代謝過程而不是產物本身。2/4/202317現代工業發酵調控學郭曉燕4.1.4初級與次級代謝途徑相互連接次級代謝物的生物合成包含：養分吸收入細胞內通過中樞代謝途徑養分轉化為中間體小分子的生物合成（次級代謝物的前體）如有必要，改變其中一些中間體這些前體進入次級代謝物生物合成的特有的途徑在次級代謝物的主要骨架形成后，最后轉化為產物2/4/202318現代工業發酵調控學郭曉燕生長與次級代謝產物共用的代謝中間產物

2/4/202319現代工業發酵調控學郭曉燕2/4/202320現代工業發酵調控學郭曉燕2/4/202321現代工業發酵調控學郭曉燕有三種用于將初級代謝中間體修飾為次級代謝終產物的生化過程生物氧化與還原生物甲基化生物鹵化2/4/202322現代工業發酵調控學郭曉燕4.2次級代謝物生物合成的前體

次級代謝物的生物合成過程除了在前體的形成和聚合過程方面外皆遵循一般的生物合成規律。次級代謝途徑同初級代謝的分解代謝、無定向代謝和組成代謝緊密相關。其前體通常是正常的或經修飾的初級代謝的中間體。2/4/202323現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝物生物合成的前體

按Rose(1979)的定義，前體(precursor)是在細胞內生成的，或由培養基提供的，能被代謝形成某種終產物的物質。Stanbury等(1984)把前體定義為，加入到某一培養基中的一些化學物質被直接結合到所需產物中。

2/4/202324現代工業發酵調控學郭曉燕前體與中間體前體是指加入到發酵培養基中的某些化合物能被微生物直接結合到產物分子中去，而自身的結構無多大變化，且具有促進產物合成的作用。中間體是指養分或基質進入一途徑后被轉化為一種或多種不同的物質，它們均被進一步代謝，最終獲得該途徑的終產物。2/4/202325現代工業發酵調控學郭曉燕表4-4可作為次級代謝物的前體的一些中間體2/4/202326現代工業發酵調控學郭曉燕(1)短鏈脂肪酸含聚酮化物(polyketide)中間體的一些次級代謝物是由乙酸、丙酸、丁酸和其它短鏈脂肪酸形成的。乙酸、丙酸以乙酰CoA和丙酰CoA的形式，分別作為C2和C3起始單位，而正常的延伸單位為丙二(酸單)酰-CoA和甲基丙二酰-CoA,它們分別為C2和C3的延伸單位。2/4/202327現代工業發酵調控學郭曉燕單體的形成乙酰CoA+ATP+CO2+H2O丙二酰CoA+ADP+Pi丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰-CoA+ADP+Pi丙酰CoA+草酰乙酸甲基丙二酰-CoA+丙酮酸2/4/202328現代工業發酵調控學郭曉燕單體的形成丙二酰-CoA是由乙酰-CoA羧化酶催化乙酰CoA形成的。甲基丙二酰-CoA可通過丙酰CoA羧化酶或甲基丙二酰-CoA羧基轉移酶催化，由丙酰CoA形成。2/4/202329現代工業發酵調控學郭曉燕短鏈脂肪酸為前體的抗生素紅霉素引物：丙酰CoA單體：2-甲基丙二酰CoA四環素引物：丙二酰胺CoA單體：丙二酰CoA2/4/202330現代工業發酵調控學郭曉燕2/4/202331現代工業發酵調控學郭曉燕（2）異戊二烯單位2/4/202332現代工業發酵調控學郭曉燕（3）經修飾的氨基酸D-氨基酸甲基氨基酸氨基酸生物合成途徑的中間體2/4/202333現代工業發酵調控學郭曉燕（4）芳香中間體有許多抗生素的芳香部分是由莽草酸途徑的中間體或終產物形成的。2/4/202334現代工業發酵調控學郭曉燕由芳香中間體合成的抗生素和其它次級代謝物2/4/202335現代工業發酵調控學郭曉燕（5）經修飾的糖與氨基糖2/4/202336現代工業發酵調控學郭曉燕（6）環己醇與氨基環己醇2/4/202337現代工業發酵調控學郭曉燕2/4/202338現代工業發酵調控學郭曉燕（7）脒基和甲基脒基的供體一般是精氨酸甲基的供體是甲硫氨酸2/4/202339現代工業發酵調控學郭曉燕（8）經修飾的嘌呤或嘧啶堿2/4/202340現代工業發酵調控學郭曉燕4.2.2前體的作用起抗生素建筑材料的作用誘導抗生素生物合成的作用2/4/202341現代工業發酵調控學郭曉燕前體與誘導物的區別誘導作用在次級代謝物的合成控制上起重要作用。有時難于區分這種促進作用是真的誘導作用還是起前體作用。2/4/202342現代工業發酵調控學郭曉燕前體與誘導物的區別

一般，可把那些能在生長期內促進抗生素生物合成的化合物看作誘導物，而前體往往只在生產期內起作用，甚至蛋白質合成受阻的情況下也行。誘導物應能被非前體的結構類似物取代。2/4/202343現代工業發酵調控學郭曉燕前體與誘導物的區別

如甲硫氨酸除了可作為頭孢菌素合成的前體，提供S的作用，更為重要的作用在于誘導節孢子的形成，而后者的多寡影響頭孢菌素的合成。甲硫氨酸可被亮氨酸取代。2/4/202344現代工業發酵調控學郭曉燕前體與誘導物的區別

誘導物的另一個特征是其誘導系數特別高，如給鏈霉素生物合成受阻的突變株1g純的A因子(在接種時)，可誘導1g鏈霉素的形成，其誘導系數為106。2/4/202345現代工業發酵調控學郭曉燕4.2.3前體的限制性

前體常常是次級代謝物生物合成的限制因素。如在發酵過程中加入苯乙酸可強烈地促進芐青霉素的生產；丙酸或丙醇促進大環內酯抗生素的生物合成。肽類抗生素的形成中非蛋白的氨基酸成分通常是限制因素。如粘菌素的生物合成受-氨基丁酸和,-二氨基丁酸的限制；桿菌肽的生產受鳥氨酸的限制。2/4/202346現代工業發酵調控學郭曉燕前體的限制性

乙酰CoA的缺少會限制四環素的生產。金黃色鏈霉菌的低產菌株的特征是乙酰CoA傾向于走三羧酸循環而被氧化；高產菌株沒有這一傾向。

Streptomycesnourseivarpolifungini合成制霉菌素的能力的提高與其前體，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有關。2/4/202347現代工業發酵調控學郭曉燕4.2.3.1前體合成的調節機制當初級代謝和次級代謝均需要同一種必需的前體時，則低濃度前體需先滿足生長的需要。如某一前體是次級代謝生物合成的限制因素，則除去控制前體生物合成的反饋調節機制可使抗生素增產。2/4/202348現代工業發酵調控學郭曉燕4.2.3.1前體導向抗生素的合成次級代謝物合成途徑第一個酶往往是關鍵。途徑中還可能存在另一些限制性酶。這些酶往往受到反饋、碳、氮、或磷的調節。另一些酶受到高濃度前體的誘導。2/4/202349現代工業發酵調控學郭曉燕前體的限制性前體物質可能不能被細胞吸收。不能被運送到次級代謝產物合成的部位。添加的物質不是次級代謝產物合成過程起限定作用的物質。2/4/202350現代工業發酵調控學郭曉燕添加前體的策略

外源前體在發酵液中的殘留濃度過高，會使生產菌中毒，不利于抗生素的合成。但前體不足也不行。因此，研究適當的前體添加策略對有些抗生素的高產穩產有重要意義。2/4/202351現代工業發酵調控學郭曉燕添加前體的策略可在基礎料中添加過程添加前體時宜少量多次或流加，控制發酵液中前體殘留濃度在適當范圍。2/4/202352現代工業發酵調控學郭曉燕4.3次級代謝物的生物合成

一旦前體被合成，它們便流向次級代謝物生物合成的專用途徑。在某些情況下單體結構單位被聚合，形成聚合物，如聚酮化物，寡肽和聚醚類抗生素等。這些特有的生物合成中間產物需作后幾步的結構修飾。修飾的深度取決于產生菌的生理條件。最后，有些復雜抗生素是由幾個來自不同生物合成途徑組成的。2/4/202353現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝物的生物合成

4.3.1.把前體引入次級代謝物生物合成的專用途徑。了解這方面所涉及的生物合成酶的知識很重要。這種專用途徑的第一個酶特別重要，因它決定了前體進入次級代謝物合成途徑的通量，中間體的流向和途徑的生產能力。2/4/202354現代工業發酵調控學郭曉燕4.3.2前體聚合作用過程2/4/202355現代工業發酵調控學郭曉燕4.3.3次級代謝物結構的后幾步修飾

2/4/202356現代工業發酵調控學郭曉燕4.3.4復合抗生素中不同部分的裝配

2/4/202357現代工業發酵調控學郭曉燕復合抗生素中不同部分的裝配

2/4/202358現代工業發酵調控學郭曉燕4.3.5次級代謝物合成酶的專一性

次級代謝物合成酶往往只具有簇的專一性，即對基質分子的某一部分有要求，對分子的其它部分無絕對要求。乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在四環類抗生素形成中起引物的作用，這是由于缺少高度專一性所致。2/4/202359現代工業發酵調控學郭曉燕不是所有次級代謝物合成酶都缺乏基質專一性，有些具有高度專一些。2/4/202360現代工業發酵調控學郭曉燕4.5微生物次級代謝作用的調控4.5.1次級代謝與生長分化的關系P203（1）細菌（2）放線菌A因子P200（3）真菌2/4/202361現代工業發酵調控學郭曉燕初級代謝物可誘導合成酶的產生從而增加最終產物的產量。在放線菌發酵過程起誘導作用的是內源代謝物如A因子。A因子既可誘導灰色鏈霉菌和比基尼鏈霉菌（Streptomycsbikiniensis）的形態分化，又誘導其化學分化．并且促進氣生菌絲、分生孢子、鏈霉素合成酶以及鏈霉素的形成。在灰色鏈霉菌中，A因子能在轉錄水平上誘導至少10種蛋白質，其中之一是鏈霉素-6-磷酸轉移酶，這種酶具有兩種功能：其一是參與鏈霉素的生物合成；其二是與抗性有關。2/4/202362現代工業發酵調控學郭曉燕4.5.2次級代謝過程的啟動的原因可能是生長期末細胞的酶的組成發生變化，與次級代謝物合成有關的酶的突然出現有關；也可能是前體的積累，起誘導物的作用或編碼次級代謝產物的基因從分解代謝物阻遏中解除阻遏所致。2/4/202363現代工業發酵調控學郭曉燕參與初級代謝的酶是通過誘導產生的比生長速率（）下降也是一種誘導因素2/4/202364現代工業發酵調控學郭曉燕4.5.2.2啟動抗生素的幾種調控機制

盡管抗生素具有非常重要的社會和經濟重要性，但并不存在一個能夠解釋它們生理調節的通用的控制模型。2/4/202365現代工業發酵調控學郭曉燕啟動抗生素的幾種調控機制

此類調節往往發生在轉錄水平，具體證據為：直到生長速率下降時，才出現編碼抗生素合成的mRNA。2/4/202366現代工業發酵調控學郭曉燕次級代謝物啟動的假想機制圖4-37比生長速率（）下降限制性養分的耗竭幾種調節因子的聯合作用（cAMP,碳源，氮源，或磷源的同化速率)嚴謹響應(strigentresponse)微生物信號因子2/4/202367現代工業發酵調控學郭曉燕(1)碳源分解代謝物對抗生素生物合成的影響（2）N源分解代謝物的調節（3）磷酸鹽的調節作用2/4/202368現代工業發酵調控學郭曉燕

丙二酰CoA合成途徑

2/4/202369現代工業發酵調控學郭曉燕抗生素生物合成的終止2/4/202370現代工業發酵調控學郭曉燕抗生素生物合成的終止抗生素合成的中止不是由于產生菌細胞失去活力，而是有三種可能的原因使抗生素生物合成終止：1)抗生素生物合成途徑的一個或更多的酶的不可逆的衰退；2)積累的抗生素產生的反饋抑制作用；3)抗生素前體的耗竭。實驗證據支持前兩種可能性。2/4/202371現代工業發酵調控學郭曉燕定向抗生素生物合成定向抗生素生物合成有多種可行的辦法。用于制備新的和分子結構發生變化的抗生素的主要方法有：1)抗生素產生菌的突變作用；2)簡單使用非天然前體；3)在生物合成的各步驟中使用抑制劑或誘導物；4)用生物合成途徑的某一或多步驟受阻的阻斷型突變株，或加入非天然的前體進行誘變合成或突變生物合成；2/4/202372現代工業發酵調控學郭曉燕定向抗生素生物合成5)在生物合成中用獨特的基質和培養基；6)利用嗜高滲等嗜極端環境條件的微生物作為抗生素生產菌株，也可以考慮采用厭氧微生物或發酵周期很長的微生物進行生產；2/4/202373現代工業發酵調控學郭曉燕定向抗生素生物合成7)通過另一種微生物產生的酶或分離出的酶改造代謝產物；8)混合培養發酵有時能提供結構更復雜的代謝產物；9)基因操縱。2/4/202374現代工業發酵調控學郭曉燕抗生素生物合成的研究方法與次級代謝產物的多樣性不同，微生物生物合成次級代謝產物的生化反應可以歸納為數目有限的若干條生物合成途徑。論證生物合成途徑的一般步驟為：①確定構成目的產物的構建單位即生源；②確定生物合成途徑中的關鍵的中間產物，合理地推斷反應順序；③分離鑒別生物合成反應中的關鍵酶。由于生物合成過程中初級代謝和次級代謝兩種途徑相互交叉，影響因素很多，因此生物合成機理的研究較為困難。常用的研究方法有