第五章

反膠團萃取與雙水相萃取2013.2第一節、反膠團萃取基本要求：1、掌握反膠團的構造、反膠團的物理化學特性及制備2、反膠團萃取原理，了解反膠團在分離工藝中的應用。重點：反膠團萃取原理。難點：反膠團的構造；反膠團的物理化學特性及制備。第一節反膠團萃取一、概述傳統的萃取，難以應用于一些生物活性物質的提取與分離。因為絕大多數蛋白質不溶于有機溶劑，若使蛋白質接觸有機溶劑，會引起蛋白質的變性。另外，蛋白質分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取難以奏效，因次研究和開發易與工業化的、高效的生化物質分離方法已成為當務之急。反膠團萃取（reversedmicellarextrceion）就是在這一背景下發展起來的一種新型分離技術。1977年，瑞士學者Luisi等人首次提出用反膠團萃取蛋白質，但未引起人們的廣泛關注。直到20世紀80年代生物學家們才開始認識到反膠團萃取的重要性。反膠團萃取的本質仍然是液液萃取，但與一般溶劑萃取所不同的是，反膠團萃取是利用表面活性劑在有機溶劑相中形成反膠團進行萃取，即反膠團在有機相內形成一個親水微環境，使蛋白質類生物活性物質溶解于其中，從而避免在有機相中發生不可逆變性的現象。此外，構成反膠團的表面活性劑往往具有溶解細胞的能力，因此可以用于直接從完整細胞中提取蛋白質和酶，省卻了細胞破壁。1、反膠團的形成及特性膠團和反膠團的形成膠團或反膠團的形成均是表面活性劑分子自聚的結果，是熱力學穩定體系。將表面活性劑溶于水中，當其濃度超過臨界膠團濃度（criticalmicelleconcentration,CMC）時，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團（micelles）。水溶液中膠團的表面活性劑的極性基團向外與水相接觸，而非極性基團在內，形成一個非極性的核心，此核心可以溶解非極性物質。若有機溶劑中加入表面活性劑，當其濃度超過臨界濃度時，就會在有機相中也形成聚集體，稱為反膠團。在反膠團中，表面活性劑的非極性基團在外，與有機相接觸，而極性基團則排列在內形成一個極性核（polarcore）。此極性核具有溶解極性物質的能力，極性核溶解水后，就形成“水池”。由于周圍水層和極性基團的保護，保持了蛋白質的天然構型，不會造成失活。反膠團：是兩性表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發地向內聚集而成的、內含微小水滴的、空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學穩定的有序構造。反膠團的微小界面和微小水相具有兩個特異性功能：(1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能；(2)在疏水性環境中具有使親水性大分子如蛋白質等保持活性的功能。

反膠團萃取技術在分離生物大分子特別是分離蛋白質方面，具有突出優點：

（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；（2）分離、濃縮可同時進行，過程簡便；（3）能解決蛋白質（如胞內酶）在非細胞環境中迅速失活的問題；（4）由于構成反膠團的表面活性劑往往具有細胞破壁功效，因而可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白質和酶；（5）反膠團萃取技術的成本低，溶劑可反復使用等。

反膠團的應用研究：（1）作為生物膜的簡化模型；（2）作為顯示酶類性質的一種模型進行基礎性研究；（3）作為具有新型功能的疏水性反應場；（4）作為酶和微生物的一種新型的固定化方法；（5）作為微小型的生物反應器；（6）作為生理活性物質及生物活性大分子的特異性分離場的應用性研究。2、反膠團的構造1)、反膠團的構造向非極性溶劑中加入表面活性劑時，當表面活性劑的濃度超過一定的數值時，會在非極性溶劑內形成表面活性劑的聚集體。與在水相中不同的是，非極性溶劑內形成的表面活性劑聚集體，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內，與在水相中形成的微膠團方向相反，因而稱之為反膠團或反向膠團。

圖是表面活性劑聚集體的可能的微觀構造極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”正膠團：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內，中間形成非極性的“核”極性“頭”有機溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團：表面活性劑的極性頭朝內，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”

在反膠團中有一個極性核心，它包括由表面活性劑極性端組成的內表面、平衡離子和水，被稱之為“水池”。因為這個“水池”具有極性，可以溶解具有極性的分子和親水性的生物大分子，而極性分子和/或親水性的生物大分子也因此可＂溶解＂在非極性的有機溶劑中。

3、常用表面活性劑表面活性劑的存在是構成反膠團的必要條件，有三類表面活性劑都可在非極性溶劑中形成反膠團。

（1）陰離子型表面活性劑（2）陽離子型表面活性劑（3）非離子型表面活性劑常用的表面活性劑及其相應的有機溶劑

在反膠團萃取蛋白質使用最多的是陰離子型表面活性劑AOT，AOT容易獲得，它具有雙鏈，形成反膠團時無需添加輔助表面活性劑且有較好的強度；它的極性基團較小，所形成的反膠團空間較大，有利于生物大分子進入。3、反膠團的分類1）、單一表面活性劑反膠團體系：是指在使用時無須加入助劑的表面活性劑，具有多條中等長度的烷基尾和一個較小的極性頭。A、陰離子型，如AOT。該體系結構簡單和穩定，反膠團體積較大，適用于等電點較高的、相對分子量較小的蛋白質的分離；

B、陽離子型，如CTAB，DAP等。該體系適用于等電點較低的、相對分子量較大的蛋白質的分離；C、非離子型表面活性劑，能形成更大的反膠團體系，能分離相對分子量更大的蛋白質，但這類體系容易乳化。2）、混合表面活性劑反膠團體系：是指兩種或兩種以上表面活性劑構成的體系，一般來說，混合表面活性劑反膠團對蛋白質有更高的分離效率。3）、親和反膠團體系：是指除了有組成反膠團的表面活性劑以外，還有具有親和特征的助劑，它的親和配基與蛋白質有特異的結合能力，往往極少量親和配基的加入就可使萃取蛋白質的選擇性大大提高。

二、反膠團的物理化學特性及制備1、反膠團的物理化學特性影響反膠團的大小的因素：表面活性劑和非極性有機溶劑的種類、濃度；操作時體系的溫度、壓力；微小水池中的離子強度等。（1）反膠團的臨界膠團濃度表面活性劑在非極性有機溶劑相中能形成反膠團的最小濃度稱為臨界膠團濃度（CMC）。大多數在0.1~1.0mmol/L之間。CMC與表面活性劑的種類有關。

見下表某些表面活性劑的臨界膠束濃度／(mol／L)（2）反膠團含水率W：W用水和表面活性劑的摩爾濃度之比來定義，即：

C[水]

W=

C[表面活性劑]

如表面活性劑是AOT，則C[水]W=

C[AOT]W越大，反膠團的半徑越大。

當W<6-8時，“水池”（微水相）中水分子被表面活性劑親水基團強烈地束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常強。另外，其冰點通常低于0℃。這一部分水使表面活性劑的親水性基團水合化，即被牢固地束縛著，所以粘度很大，流動性很差。在AOT反膠團中，水合化一分子AOT需要6~8個水分子，而其它水分子則不受束縛，可與普通水一樣自由流動。故當W>16時，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團內也形成二重電荷層。見下圖。假定反膠團為球形（除了W或表面活性劑濃度很大外），反膠團平均直徑dm的增加和W的增加基本成正比，W=0~50之間，dm=2~30nm。AOT的Wmax=60，若W值再增大，反膠團溶液變渾濁，并開始分層。2、反膠團的制備制備反膠團系統一般有以下三種方法：（1）注入法

將含有蛋白質的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機溶劑中去，然后進行攪拌直到形成透明的溶液為止。該方法過程快，并能較好地控制反膠團的平均直徑和含水量。（2）相轉移法將酶或蛋白質從主體水相轉移到含表面活性劑的非極性有機溶劑中形成反膠團-蛋白質溶液，即把含有表面活性劑的有機相和含有蛋白質的水相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質緩慢轉入（萃入）有機相。

該過程較慢，但形成的體系處于穩定的熱力學平衡狀態，有利于在有機溶劑相中獲得較高的蛋白質濃度。（3）溶解法

將含有反膠團（W＝3~30）的有機溶液與蛋白質固體粉末一齊攪拌，使蛋白質進入反膠團中。用于非水溶性蛋白質。該法所需時間較長，含蛋白質的反膠團體系穩定。

說明反膠團“水池”中的水與普通水的性質有區別。

三、

生理活性物質的分離濃縮

反膠團萃取原理蛋白質的溶解反膠團的萃取1、反膠團萃取原理從宏觀上看反膠團萃取，是有機相－水相間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機溶劑相中的反膠團微水相中的分配萃取。從原理上，可當做“液膜”分離操作的一種。如下圖所示：2、反膠團萃取特點（1）進入有機相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，從而避免了與有機溶劑相直接接觸而引起的變性，失活。（2）pH、離子強度、表面活性劑濃度等（如下表）因素會對反膠團萃取產生影響。通過對它們的調整，對分離場（反膠團）—待分離物質（生物大分子等）的相互作用加以控制，能實現對目的物質高選擇性的萃取和反萃取。（3）有機相內反膠團中微水相體積最多僅占有機相的幾個百分點，所以它同時也是一個濃縮操作。

3、影響反膠團萃取生物分子的主要因素

（1）水相pH值的影響表面活性劑的極性頭是朝向反膠團的內部，使反膠團的內壁帶有一定的電荷，而蛋白質是一種兩性電解質，水相的pH值決定了蛋白質分子表面可電離基團的離子化程度，當蛋白質所帶電荷與反膠團內所帶電荷的性質相反時，由于靜電引力，可使蛋白質轉移到反膠團中。相反，當水相pH大于等電點時，由于靜電斥力，使溶入反膠團的蛋白質反向萃取出來，實現了蛋白質的反萃取。

（2）水相離子強度的影響

a：離子強度影響到反膠團內壁的靜電屏蔽的程度，降低了蛋白質分子和反膠團內壁的靜電作用力。b：減小了表面活性劑極性頭之間的相互斥力，使反膠團變小。這兩方面的效應都會使蛋白質分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白質從反膠團中反萃取出來。

（3）助表面活性劑的影響蛋白質的分子量往往很大，超過幾萬或幾十萬，使表面活性劑形成的反膠團的大小不足以包容大的蛋白質，而無法實現萃取，此時加入一些非離子表面活性劑，使它們插入反膠團結構中，就可以增大反膠團的尺寸，溶解相對分子質量較大的蛋白質。

（4）溶劑體系的影響溶劑的性質，尤其是極性，對反膠團的形成和大小都有影響。常用的溶劑有：烷烴類（正己烷、環己烷、正辛烷、異辛烷等）。有時也使用助溶劑，如醇類。可以調節溶劑體系的極性，改變反膠團的大小，增加蛋白質的溶解度。4、蛋白質的溶解蛋白質向非極性溶劑中反膠團的納米級水池中的溶解，有下圖所示的四種可能。（1）為水殼模型；（2）蛋白質中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳氫化合物相接觸；（3）蛋白質被吸附在微膠團的“內壁”上；（4）蛋白質被幾個微膠團所溶解，微膠團的非極性尾端與蛋白質的親脂部分直接作用。在水殼模型中，蛋白質居于“水池”的中心，水殼層保護了蛋白質，使它的生物活性不會改變。蛋白質表面電荷與反膠團內表面電荷間的靜電作用是使蛋白質進入反膠團的重要因素，因此凡能影響靜電作用的因素都會影響蛋白質的溶入，如水溶液的pH、離子強度等。5、反膠團萃取與反膠團萃取有關的因素如表5-1.因分離中使用的表面活性劑種類不同，如陰離子型和陽離子型，其相互作用和分離原理也會不同。應用較多的反膠團體系為：AOT/異辛烷體系。以立體性、靜電性、疏水性相互作用的分離特性及效果歸納如下：

1）、氨基酸分離特性氨基酸分子量與反膠團相比太小，不存在反膠團-氨基酸分子間的立體性相互作用和分子間的大小識別，實際是通過AOT-氨基酸分子間的相互作用進行萃取的。但由于氨基酸因pH不同而發生正負電荷的變化和帶有疏水性殘基，所以，以靜電和疏水性相互作用來定量評價氨基酸的萃取特性和效果。各種氨基酸隨pH值的變化，實際電荷量的變化和氨基酸萃取率變化之間的關系如圖8-6。如圖，平均每單位正電荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子數是一固定值，該值由氨基酸種類決定。氨基酸殘基的疏水性越大，該值越大。2）、酶、蛋白質萃取特性酶、蛋白質等生物大分子的空間尺度與反膠團的大小相接近，故存在立體性相互作用。各種相互作用都很重要，在大多數情況下，是它們之間的復合作用。有些蛋白質的構象發生很小的變化時，就可能對這些相互作用的結果產生很大影響。（1）靜電性相互作用以下表所示的酶、蛋白質為例，考察萃取或反萃取時靜電性相互作用以及pH對這種作用的影響。①小分子蛋白質（Mr<20000）當pH>pI時，蛋白質不能溶入膠團內，但在等電點附近，急速變為可溶。當pH<pI時，即在蛋白質帶正電荷的pH范圍內，它們幾乎完全溶入膠團內。②蛋白質分子量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側偏離pI，萃取率也會降低（即立體性相互作用效果增大）。

③分子量更大的BSA，全pH范圍內幾乎都不能萃取（即靜電相互作用效果無限小，可忽略不計）。此時，AOT濃度如從通常條件（50~100mmol/L）增加到200~500mmol/L，逐漸變為可萃取。④降低pH，正電荷量增加，萃取率從某一pH開始，急速減小。這是因為pH導致蛋白質變性造成的。蛋白質和微量的AOT在靜電、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了復合體而變性。⑤添加KCl等無機鹽，因離子強度的增加和靜電屏蔽的作用，而使靜電性相互作用變弱，一般地，萃取率下降。

添加KCl等無機鹽，對有機相具有脫水作用（W減小），使立體性相互(排除)作用增大。

（2）立體性相互作用（空間位阻）隨蛋白質分子量的增大，蛋白質分子和膠團間的立體性相互作用增加，萃取率下降。

反膠團粒徑并非一致，存在一粒徑分布。反膠團的粒徑分布（分離場）隨鹽濃度和AOT濃度的增加而發生顯著的變化。蛋白質溶入與否，對它幾乎沒有影響。

即使萃取溶入膠團的蛋白質的種類和分子量不同，分離場的特性（膠團平均直徑和含水率）幾乎不變。隨著蛋白質分子量的增加，分配系數KpI（蛋白質等電點處的分配系數）迅速下降。可以認為相對分子量20000左右的蛋白質的高效分離是通過立體性相互作用來實現的。（3）其它的相互作用

關于疏水性相互作用和特異性相互作用，還研究不多。一般認為疏水性相互作用對蛋白質分配特性的影響不大。四、在分離工藝中的應用

1、蛋白質分離

利用圖8-8和圖8-9的靜電相互作用，通過三步分離核糖核酸a、細胞色素c和溶菌酶。調整pH，進行正萃取分離，通過控制KCl濃度，反萃取分離，獲得較好地分離效果和收率。第一步：在pH=9.0和較低的鹽濃度下，核糖核酸酶a帶負電荷，不能被反膠團萃取，留在水相中，而細胞色素C和溶菌酶由于都帶正電荷，被萃取到反膠團中。第二步：利用提高離子強度，將細胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反膠團中。第三步：進一步提高pH值和離子強度，將溶菌酶反萃到水相中。2、濃縮α-淀粉酶

使用如圖8.14所示，用2個混合槽和2個澄清槽組成連續萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v/v)辛醇-異辛烷的反膠團體系循環萃取分離α-淀粉酶，控制第一級水相中酶濃度在較低水平上，使失活速度很小，將α-淀粉酶濃縮了8倍，酶活力損失約30%。對該過程優化，在反膠團中加入非表面活性劑，以提高分配系數，同時加大攪拌速度，以提高傳質速率，第二級反萃液中α-淀粉酶的活力回收率為84%，濃縮了17倍。

3、直接提取胞內酶

用反膠團直接從全發酵液中提取和純化棕色固氮菌的胞內脫氫酶：將全細胞的懸浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/己醇-辛烷反膠團溶液中，完整的細胞在表面活性劑的作用下，析出酶進入反膠團的“水池”中，經反萃取，可選擇性地回收濃度很高的酶。該技術不利的一面是細胞碎片留在反膠團中，使得反膠團不能循環利用，但如果能夠便利地回收有機溶劑和表面活性劑，那么這種細胞溶解和蛋白質萃取相結合的工藝方法，將成為從細胞中直接提取蛋白質的重要途徑。4、反膠團萃取用于蛋白質的復性

反膠團萃取的另一個應用是蛋白質的復性。重組DNA技術生產的大部分蛋白質，須溶于強變性劑中，以便從細胞中抽提出來。除去變性劑，進行復性的過程通常要在極稀的溶液中進行，以避免部分復性中間體的凝集。利用反膠團包裹變性的蛋白質，通過調整系統組成的環境參數，使得每個微膠團只包裹一個蛋白質分子，然后改變膠團溶液組成進行復性，由于蛋白質被單獨裝在各個膠團中，復性時完全不接觸，避免了有害作用，使酶的活性完全恢復。

5、從植物中提取油和蛋白質用烴類有機溶劑對植物種子進行反膠團萃取，油被直接萃入有機相，蛋白質卻萃入反膠團的“水池”中。先用水溶液反萃取得到蛋白質，溶液再經冷卻使表面活性劑沉淀分離，最后用蒸餾的方法將油和烴類分離。實驗證明該方法相當優越。

6、分離膜型的反膠團萃取

分離膜型的液-液反膠團萃取是混合分離型的改進型，以疏水性多孔質膜（接觸比表面積較大，30~300cm2/cm3)作為液液兩相的接觸界面。在膜的內外兩側，分別流過含有蛋白質的水相和含有反膠團的有機相，液液界面靠膜兩側的壓力差保持。因膜自身對蛋白質透過無選擇性，與反膠團萃取分離法具有相同的原理。其優點是：沒有在一般連續性液液萃取法中成為問題的進料和液泛等制約因素，可自由地改變液流的流速；總物質移動速度和膜面積比一般方法大；在原理上是連續式的，放大也較容易。五、在液膜分離法中的應用利用含有反膠團的有機相作為液膜，從一水相中向另一水相中選擇性地輸送生理活性物質的液膜分離方法，和通常的液液萃取法相比，具有以下一些特征：正萃取和反萃取能同時在一個裝置內進行，表面活性劑的使用量及其損失較少，從原理上來看，速度差分離也是可能的。

六、反膠團萃取設備要實現反膠團萃取的工業化，關鍵之一是開發適用于反膠團萃取的高效分離設備。1、膜萃取器膜萃取器有管狀超濾膜和中空纖維膜兩種。（1）管狀超濾膜用管狀陶瓷超濾膜截留含有磷脂酶的反膠團，實現了對生物產品的部分分離。含有磷酯酶的發酵液經過泵進入到陶瓷超濾膜組件中，磷酯酶被截留在膜內，萃余相則返回到反應器，從而實現磷酯酶的分離。（2）中空纖維膜

中空纖維管是另一類被廣泛用于液-液分離的膜萃取器。它具有很大的比表面積，且與反膠團技術相結合能減少蛋白質的失活，是一項很有實用前景的生物分離技術。將親和配基（活性色素辛巴藍）加入到大豆卵磷酯-正已烷系統中，制成親和反膠團相，并將此膠團相固定于聚丙烯中空纖維膜內，從而構建起親和反膠團萃取膜的分配色譜裝置（AMPC）。

2、離心萃取器

反膠團溶液-水-蛋白質所組成的萃取體系，由于表面活性劑的存在，界面張力低，易乳化。另外，由于萃取的目標產物是蛋白質，易變性失活。為了盡量避免蛋白質的變性，應盡量縮短操作時間，因而反膠團離心萃取是一項很合適的蛋白質萃取分離技術。

3、混合澄清槽

混合-澄清式萃取器是一種最常用的液-液萃取設備，該設備由料液與萃取劑的混合器和用于兩相分離的澄清器組成，可進行間歇或連續的液-液萃取。但該設備最大的缺點是反膠團相與水相相混合時，混合液易出現乳化現象，從而增加了相分離時間。

4、微分萃取設備

（1）噴淋塔萃取器

噴淋塔是一種應用廣泛的液-液微分萃取設備，具有結構簡單和操作彈性大等優點，在反膠團萃取方面受到了人們的關注。尤為重要的是，當用于含有表面活性劑的反膠團體系時，所需輸入的能量很低，故不易乳化，從而縮短了相分離時間。但噴淋塔的缺點是連續相易出現軸向反混，從而降低萃取效率。（2）轉盤萃取塔

轉盤萃取塔（RDC）可用于蛋白質的萃取分離。下圖是RDC萃取蛋白質的示意圖，反膠團相為分散相，水相為連續相。轉盤塔的優點是單位塔高的效率高、高產量、操作彈性大和低能耗等。缺點是體系易出現乳化和返混現象。研究轉盤萃取塔中蛋白質的反膠團萃取（1）考察d32（反膠團分散相中液滴直徑）的分布。d32隨著反膠團特性的改變而改變。有溶菌酶存在時的d32比沒有時要小的多。另外，溶菌酶的溶解和傳質也會影響反膠團液滴的直徑；隨轉盤轉速的增大，液滴直徑也會下降。

（2）研究轉盤萃取塔中反膠團萃取溶菌酶的傳質性能，所建立的軸向擴散模型可描述轉盤萃取塔的萃取性能，可用于轉盤萃取塔反膠團萃取的參數預測和指導過程設計。第二節雙水相萃取掌握：1.聚合物的不相容性；相圖。2.雙水相體系的是的形成及組成3.影響雙水相萃取的因素4.雙水相萃取技術有什么優越性利用物質在互不相溶的兩水相間分配系數的差異來進行萃取的方法。雙水相萃取？

雙水相的形成將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時，當聚合物濃度達到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系。這種含有不同聚合物分子的溶液發生分相的現象叫聚合物的不相容性。形成原因：由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。常用的雙水相體系

高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱Dextran)高聚物/無機鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/無機鹽體系為:PEG/硫酸鹽或磷酸鹽體系。雙水相系統(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)雙水相萃取的原理是生物物質在雙水相體系中的選擇性分配，當物質進入雙水相體系后，由于表面性質、電荷作用和各種作用力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即分配系數不同。第一節雙水相分離理論雙節線：把均相區和兩相區域分隔開。

系線：連接雙節線上兩點的直線。

均相區兩相區在同一條系線上的各點分成的兩相具有相同的組成，但體積比不同臨界點：當系線長度趨向于零時，即在圖中的C點，兩相差別消失，任何溶質在兩相中的分配系數均為1，成為單相體系。ATPS相圖雙節線(bi-nodal)：

圖中的曲線。雙節線以下的區域為均相區,以上的區域為兩相區，即ATPS。

系線(tieline)：

雙節線上兩點的直線。系線反映的信息A杠桿規則：系線上各點均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規則B性質差異：系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度,系線越長,兩相間的性質差別越大；反之則越小.C 臨界點(criticalpoint)：當系線長度趨于零時,兩相差別消失,任何溶質在兩相中的分配系數均為1。如K點。

對于PEG/Dextran所形成的雙水相體系中，若降低PEG相對分子質量，則生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系數增大；而降低Dextran相對分子質量，則分配系數減小。若想在上相獲得較高的蛋白質收率，對于PEG聚合物，應降低它的平均分子量，相反，若想在下相獲得較高的蛋白質收率，則平均分子量應增加。(1)成相聚合物的影響A、成相聚合物分子量B、成相聚合物的濃度聚合物分相的最低濃度為臨界點，系線的長度為零，此時分配系數為1，即組分均勻的分配于上下相.隨著成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增大，系統遠離臨界點，系線長度增加，兩相性質的差別(疏水性等)增大，蛋白質分子的分配系數將偏離臨界點處的值(m=1)，即大于1或小于1。因此,成相物質的總濃度越高，系線越長，蛋白質越容易分配于其中的某一相。(2)鹽的種類和濃度鹽的種類和濃度對分配系數的影響主要反映在對相間電位和蛋白質疏水性的影響。①鹽的種類

在雙聚合物系統中，無機離子具有各自的分配系數，不同電解質的正負離子的分配系數不同，從而產生不同的相間電位。由于各相要保持電中性，使得帶電生物大分子，如蛋白質和核酸等分別向兩相移動分配。②鹽的濃度

鹽的濃度不僅影響蛋白質的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統，改變各相中成相物質的組成和相體積比。例如，PEG/磷酸鹽體系中上下相的PEG和磷酸鹽濃度及Cl-在上下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變，這種相組成即相性質的改變直接影響蛋白質的分配系數，如圖。離子強度對不同蛋白質的影響程度不同，利用這一特點，通過調節雙水相系統的鹽濃度，可有效地萃取分離不同的蛋白質。（4）溫度的影響

分配系數對溫度的變化不敏感成相聚合物對蛋白質有穩定化作用,所以室溫操作活性收率依然很高,而且室溫時粘度較冷卻時(4℃)低,有助于相的分離并節省了能源開支。（一）目的物的萃取1、如果目標產物在上相中的分配系數足夠大，則細胞勻漿液中的目標產物可采用一步或兩步雙水相萃取工藝獲得較高的純化倍數。一步雙水相萃取：是把生物材料懸浮液和雙水相系統混合后，其中下相含