第八章基因工程育種一、意義：自80年代Palmiter等將外源生長激素（GH）基因?qū)胄∈螳@得快速生長的超級小鼠以來，應用轉(zhuǎn)基因技術獲得具有速生、抗病、優(yōu)質(zhì)等性狀的優(yōu)良品種引起了人們的極大興趣，相繼開展了兔、魚、雞、豬、羊等動物的基因轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因動物研究已成為一個極具潛在價值的生物醫(yī)學研究新領域。外源基因的導入已成為研究基因調(diào)控、發(fā)育分化、組織特異表達、培育生物新品種的一個有力手段，其發(fā)展?jié)摿蛻们熬笆艿綇V泛的重視。第一節(jié)、轉(zhuǎn)基因研究概況世界第一只轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因“碩鼠”（右）1、轉(zhuǎn)生長激素轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因牛轉(zhuǎn)基因豬2.動物生物反應器能生產(chǎn)人促紅細胞生成素的轉(zhuǎn)基因牛乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)引導人們試圖把轉(zhuǎn)基因動物作為一種生物反映器，生產(chǎn)人類所需的醫(yī)用珍貴稀有蛋白，特別是醫(yī)用活性肽。3.異種器官移植英國蘇格蘭羅斯林研究中心培育出的5只轉(zhuǎn)基因小豬通過基因工程的手術，將豬的一個基因———阿爾法1號(GT基因)“關閉”世界首只轉(zhuǎn)基因靈長類動物

——-安迪第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因羊分泌α—抗胰蛋白酶4、表達調(diào)控、觀賞二、基因工程的概念

geneticengineering定義：又稱為重組DNA技術，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學操作。目的:是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳。三、基因工程技術路線1、DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）2、DNA片段和載體的連接——重組體DNA3、外源DNA片段引入受體細胞——基因克隆和基因文庫4、選擇基因（目的基因）5、目的基因表達切接轉(zhuǎn)選表達

從轉(zhuǎn)基因的技術手段來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導法、精子介導法、胚胎干細胞介導法和核移植法等多種轉(zhuǎn)基因方法。

轉(zhuǎn)基因細胞的核移植技術已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的主流方法。1、從簡單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細胞核移植方向發(fā)展四、發(fā)展的趨勢

轉(zhuǎn)基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機整合和定點整合。為了達到外源基因的高效表達，在轉(zhuǎn)基因結構上增加了含有位點控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，可以實現(xiàn)插入位點非依賴性、拷貝數(shù)相關的表達模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無論外源基因插入什么位點，都能夠維持一個開放的染色體結構，有利于基因的表達。基因打靶技術的出現(xiàn)與發(fā)展，實現(xiàn)了對目的基因的定位操作。2、從外源基因隨機插入（或整合）到定點整合的轉(zhuǎn)變

從轉(zhuǎn)基因的策略來看，動物轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動物階段。借助轉(zhuǎn)基因技術可將單一的功能基因和基因簇引入高等動物的基因組，或?qū)⒛康幕驈膭游锘蚪M中敲除，實現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新的基因型和表型。目前轉(zhuǎn)基因動物主要應用在生物學基礎研究、醫(yī)學疾病模型、動物生物反應器、異種器官移植、動物遺傳改良等５個方面。３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變五、水生動物的轉(zhuǎn)基因研究

水生動物方面的轉(zhuǎn)基因研究，目前主要集中在轉(zhuǎn)基因魚的研究上。從1985年朱作言等報道了轉(zhuǎn)基因魚的工作以來，已將多種外源基因?qū)膈q魚、鱒魚、斑馬魚等。研究的目的主要有兩方面：一是進行諸如生長激素（GH）基因

、抗凍蛋白（AFP）基因、病毒外殼蛋白基因等外源基因轉(zhuǎn)基因動物研究，旨在通過外源基因的轉(zhuǎn)移，使養(yǎng)殖動物獲得抗凍、抗病、生長快速等新的生產(chǎn)性狀，改良養(yǎng)殖品種的品質(zhì)。另一方面的研究目的是利用轉(zhuǎn)基因手段解決發(fā)育生物學和分子生物學問題。如Du等采用美洲大綿尉抗凍蛋白啟動子－鮭魚生長激素cDNA，將其轉(zhuǎn)移進鮭魚，成功地獲得了比對照生長速率快4－6倍的轉(zhuǎn)基因魚，最大為對照的13倍（Du,etal.,1992）。如Ozato等研究了雞－晶狀體蛋白基因在青胚胎中的表達，以及表達與發(fā)育過程的相關性（Ozato,etal.,1986）。還有研究不同啟動子基因重組體在轉(zhuǎn)基因魚中的表達特性，以及一些在發(fā)育和生理上重要的基因（如生長激素基因）在發(fā)育中的調(diào)控作用（Stuart,etal.,1988;McEvoyg,etal.,1988）。六、轉(zhuǎn)基因植物

第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術一、動物基因工程載體二、基因轉(zhuǎn)移技術基因工程技術路線

（一）DNA片段的獲得1、從基因所在的生物體直接取得限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）2、人工合成DNA片段（DNA合成儀）3、PCR反應合成DNA4、mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RACE技術5、基因組文庫和cDNA文庫GenomeDNATotalRNA（二）動物基因工程載體質(zhì)粒型表達載體病毒載體定向打靶載體1.質(zhì)粒型表達載體

表達載體的共同特點是都帶有原核復制區(qū)和選擇性標記基因，保證重組DNA分子能夠在大腸桿菌中擴增，同時也必須包括能在真核細胞表達的相關組件。一般包括轉(zhuǎn)錄外源DNA序列的啟動元件、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信號序列、真核細胞中的選擇性標記，另外還增加了一些附加元件，如增強子、內(nèi)含子、剪接供體與受點，以保證外源基因的高效表達。重組質(zhì)粒構建載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。質(zhì)粒是指一種存在于細胞內(nèi)能獨立復制的染色體外的DNA。

1)質(zhì)粒圖譜登記號：0052

2)質(zhì)粒名稱：pBudCE4.1

3)來源：Invitrogen

4)用途：真核表達載體

5)詳細資料

6)是否可以共享

7)聯(lián)系方式：PM

重組質(zhì)粒的構建過程重組基因的鑒定抗性篩選法：能否生長；藍色和白色菌落，其中白色菌落可能含重組質(zhì)粒。

PCR：雙酶切：

體外表達*在原核生物中的表達：細菌、酵母在真核生物細胞中的表達：人工培養(yǎng)肝細胞、上皮細胞人工培養(yǎng)的人成骨細胞人成骨細胞內(nèi)的pEGFP蛋白表達

2.病毒載體

作為基因轉(zhuǎn)移的病毒載體須具備以下基本條件：攜帶外源基因并能夠包裝成病毒顆粒介導外源基因的轉(zhuǎn)移與表達對機體不致病（1）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體有許多特點：基因組的重排率低外源基因與病毒DNA重組后能遺傳幾個周期安全性好，不會整合到人的染色體上，不導致腫瘤的發(fā)生宿主范圍廣，對受體細胞是否處于分裂期要求不高外源基因在載體上容易高效表達（2）腺相關病毒（adeno-associatedvirus,AAV）腺相關病毒是一種天然復制缺陷型非致病性單鏈DNA病毒，其復制需要有輔助病毒的共轉(zhuǎn)染。無共轉(zhuǎn)染時，野生型AAV優(yōu)先（70%）整合在人染色體的19q13.3位點處，潛伏存在直至被輔助病毒拯救出來。其整合需要基因組兩端的ITR，以及非結構基因編碼的蛋白Rep78和Rep68的存在。

AAV具有以下幾個方面特點：非致病性、無免疫原性和無炎癥反應能感染靜止期的細胞，如神經(jīng)元細胞插入的外源基因表達時間長，一般能夠達到1年之多宿主范圍廣熱穩(wěn)定性強，容易通過滅活輔助腺病毒純化（3）反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型單鏈RNA病毒，感染宿主細胞后，病毒顆粒中的pol基因表達出反轉(zhuǎn)錄酶，以單鏈的RNA基因組為模板，立即轉(zhuǎn)錄出一份線形雙鏈DNA復本，然后在整合酶（Int）介導下，整合到宿主的基因組內(nèi)，此時整合的病毒序列被稱為前病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復制而復制，并由5`-LTR中的一個強啟動子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又具有mRNA模板活性，翻譯出結構蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝與內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽植方式分泌至細胞外，但通常不致死宿主細胞。3.定向打靶載體基因打靶是通過外源基因與靶細胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點整合到靶細胞特定位置上，而使某一個特定位點上的基因發(fā)生定點突變的技術。在細胞內(nèi)存在兩條相同的DNA鏈（同源染色體），在細胞內(nèi)酶的作用下，可以將其切開，發(fā)生交叉，然后重新連接，從而發(fā)生DNA鏈的交換并引發(fā)重組。(1)基因敲除的基本程序構建打靶載體

1）同源序列

2）打靶載體常含兩種篩選標志

neor

：新霉素抗性基因，陽性篩選標志。當重組后，細胞能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長。neorHSV-tk

HSV-tk：單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，陰性篩選標志，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。

啟動子HSV-TK同源序列同源序列Neo隨機整合同源重組把胚胎注入假孕小鼠Southern印記把細胞注入胚泡（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）（1）基因敲除（knock-out）敲除型載體由兩段與基因組內(nèi)靶基因座序列同源的DNA片段（又稱同源臂）組成，中間為正向選擇標記，同緣臂外側(cè)為真核細胞中的負選擇標記及在原核細胞中進行復制與篩選的載體DNA序列。（2）基因敲入（knock-in）基因敲入是利用同源重組原理將外源基因插入到染色體的特定位點上。基因敲入的轉(zhuǎn)基因結構設計上相似于基因敲除結構，但區(qū)別在于：

或用外源基因替換并失活靶基因或在不影響原基因功能的前提下插入新的基因或在染色體上特定位點插入新的外源基因，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，并使得外源基因高效表達（3）基因下調(diào)（knock-down）

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）又被稱為基因下調(diào)，通過干擾RNA（smallinterference

siRNA）分子的作用達到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效應。

siRNA的制備方法主要包括體外合成siRNA和siRNA表達載體兩種。體外合成的siRNA易轉(zhuǎn)染細胞，進入細胞后，可直接發(fā)揮作用，一般不存在siRNA

表達載體的轉(zhuǎn)錄效率低及細胞毒性等問題。但是體外合成的siRNA

只能瞬間干擾，不能達到長久抑制病毒的效果。

大規(guī)模隨機基因剔除—基因捕獲(genetrapping)精細突變的引入打了就走策略(HitandRun法)雙置換法(DoubleReplacement)“標記和置換”法(TagandExchange)利用Cre-LoxP系統(tǒng)引入點突變條件性基因打靶時空特異性基因打靶（spatiotemporalgenetargetingSTGT）Cre/LoxP和FLP—frt系統(tǒng)染色體組大片段的刪除和重排

（三）、基因轉(zhuǎn)移技術

物理轉(zhuǎn)染法

化學轉(zhuǎn)染法

生物法基因轉(zhuǎn)移技術的進展1、DNA顯微注射法2、反轉(zhuǎn)錄病毒載體支持的基因轉(zhuǎn)移3、電脈沖法4、利用轉(zhuǎn)化的全能胚胎干細胞形成生殖系嵌合體的基因轉(zhuǎn)移5、介導法：脂質(zhì)體介導、鈣離子介導、PEI(polyethylenmine)6、精子載體法1.物理轉(zhuǎn)染法（1）電擊法（electroporation）其基本原理是在外加電場的作用下，細胞膜電位發(fā)生改變，細胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿孔，從而使一定數(shù)量的外源DNA從細胞外擴散到細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，并進一步整合到宿主DNA上，達到轉(zhuǎn)基因目的。（2）顯微注射法

是將外源DNA在顯微鏡操作系統(tǒng)的輔助下，通過玻璃微管直接將外源DNA注入哺乳動物受精卵的原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動物。胚胎干細胞基因轉(zhuǎn)化法(引自G1ick&Pasternak，1998)（3）基因槍法

基本原理是將要轉(zhuǎn)染的DNA吸附到高黏度的金屬（鈣或金等）顆粒上，在一種加速裝置的作用下，將這些粒子高速打入細胞或組織內(nèi)，達到轉(zhuǎn)基因目的（4）超聲波法（sonoporation）

超聲波增強基因轉(zhuǎn)染法的主要機制是聲波的空化效應導致細胞的通透性增高，而通過添加超生造影劑能降低空化域值，增強空化效應，促進外源基因進入細胞，提高基因的轉(zhuǎn)染效果2.化學轉(zhuǎn)染法（1）磷酸鈣法

將待轉(zhuǎn)染的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2后，DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；將此顆粒懸浮液加入貼壁培養(yǎng)的細胞中，外源DNA就被靶細胞所吸收，進而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。 （2）脂質(zhì)體法（lipofection）將待轉(zhuǎn)染的DNA溶液與磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結構。當這種脂質(zhì)體懸液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進入細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)。（3）原生質(zhì)體融合法

含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌或酵母細胞。大量擴增，利用溶菌酶或蝸牛酶去除胞壁部分，在高鹽條件下制成原生質(zhì)體，然后散鋪在單層培養(yǎng)的哺乳動物細胞上，在融和劑（如聚乙二醇）作用下，使染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)如細胞內(nèi)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因重組DBA分子通過物理或化學方法轉(zhuǎn)入一個特制的病毒包裝細胞系。轉(zhuǎn)染入包裝細胞系的重組DNA轉(zhuǎn)錄出相應的重組RNA分子，包裝細胞系分泌出來的重組反轉(zhuǎn)錄病毒，便可感染其他類型動物受體細胞，重組RNA分子以DNA形式整合到染色體上，并表達外源基因。3.病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定、長期表達外源基因第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物檢測與培育轉(zhuǎn)基因鑒定表達水平的檢測轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測一、

轉(zhuǎn)基因鑒定標記篩選法（1）正負選擇標記篩選法（2）無啟動子篩選法利用靶基因上的啟動子來轉(zhuǎn)錄標記基因的mRNA并翻譯出特定的蛋白質(zhì)，而達到篩選的目的。分子鑒定法（1）PCR擴增（2）斑點雜交（3）Southern雜交（4）熒光原位雜交二、表達水平的檢測獲得高效表達、具有較強生物學活性的目的是蛋白是轉(zhuǎn)基因的主要目的之一。得到的目的蛋白的的形式：

表達于細胞內(nèi)，可通過對組織或細胞裂解獲取；分泌到細胞外，可通過酶學或免疫學方法進行測定。1、報告基因

報告基因是編碼容易檢測的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，一般用以替換難于測定的蛋白質(zhì)基因，或制備融合蛋白，或利用IRES與目的蛋白形成一條mRNA序列，分別翻譯出兩種蛋白，來研究目的蛋白的功能及其表達特性。2、Northern雜交可以檢測轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)染細胞是否轉(zhuǎn)錄出目的基因所對應的mRNA3、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是將由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA第一鏈為模板進行目的基因或片斷擴增的PCR反應。利用RT-PCR方法擴增出目的基因的電泳條帶，以檢測目的基因是否表達。4、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶組織或轉(zhuǎn)基因細胞的總蛋白，依據(jù)相對分子質(zhì)量標準判定是否有目的蛋白條帶出現(xiàn)，進而判定外源基因的表達情況，同時可以初步判定目的蛋白的表達水平。5、Western雜交

可用來檢測混合蛋白質(zhì)樣品中是否存在目的蛋白，最小檢出量為1ng。6、目的蛋白的生物活性

應選擇相應的生物學測定方法進行測定。當產(chǎn)品生物學活性較天然蛋白活性低時，應當對蛋白質(zhì)結合的功能分子集團進行研究。三、轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測判斷是否生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動物的重要標準是檢查外源基因是否整合到動物的生殖系統(tǒng)中，即是否能夠穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)基因動物傳代常用常規(guī)繁殖方法進行，如有必要，也可采用特殊的方法。一般用轉(zhuǎn)基因檢測陽性動物與已知的非轉(zhuǎn)基因動物交配，這樣做可以較好的度量被整合的外源基因的傳遞規(guī)律。

第四節(jié)、轉(zhuǎn)基因動物的生物安全性轉(zhuǎn)基因制作方法給動物帶來的危害外源基因表達給動物帶來的影響動物轉(zhuǎn)基因與農(nóng)業(yè)動物資源遺傳多樣性的保護轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生物安全性

爭論的主要焦點表現(xiàn)在以下幾個方面：１．轉(zhuǎn)基因動物食品對人類健康的直接或間接影響。２．對自然界中生態(tài)平衡以及物種多樣性的影響。３．轉(zhuǎn)基因技術帶來的倫理道德問題。一、倍性育種二、性控技術三、核移植、克隆技術四、細胞、組織移植一、倍性育種染色體加倍的過程，即允許染色體復制而細胞質(zhì)不分裂。實際上三倍體就是通過抑制減數(shù)分裂Ⅰ或Ⅱ，保留第一或第二極體，并允許配子配合獲得的。而四倍體從理論上講可通過抑制第一次卵裂而直接獲得。三倍體的低育性或不育性有以下幾個用處:(1)可將在二倍體配子形成時所需要的大量能量用于體細胞生長。

(2)提高養(yǎng)成個體的品質(zhì)。(3)可以避免或緩解性成熟的個體繁殖后常發(fā)生大量的死亡。(4)在種間競爭比較敏感的海區(qū)進行三倍體的養(yǎng)殖可以避免外來種的競爭壓力。(5)可以用于養(yǎng)殖不育的群體，控制養(yǎng)殖密度，防止品種的混雜等，特別對外來種引入和基因工程新品種。

三倍體除了其商業(yè)價值外，在生物學方面也具有很高的研究價值，用它可進行生理生化、生殖器官和體細胞組織的能量分配、成熟期激素的產(chǎn)生、基因重組基因定位及雜種優(yōu)勢等的研究。二、倍性育種方法1、化學和物理誘導方法(1)化學休克

細胞松弛素B(CB)，是一種真菌的代謝產(chǎn)物，可抑制細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微絲的形成，它能阻止細胞分裂，但不能阻止染色體的復制。在進行貝類染色體組操作時經(jīng)常用到CB。細胞松弛素B不溶于水，需先溶于二甲基亞諷(DMSO)中，后用過濾的海水配制成所需要的濃度。將受精卵置于此液中15-20min后，再將受精卵移到用過濾海水配制的DMSO溶液中15-20min，以除去殘留在細胞表面上的CB，然后將受精卵置于普通培育海水申進行正常的孵化和培養(yǎng)。

6-二甲基氨基蝶呤(6-DMAP)是一種蛋白激酶抑制物。對細胞的減數(shù)分裂和有絲分裂有抑制作用。對太平洋牡蠣進行了三倍體的誘導，綜合評價指數(shù)(倍化率X孵化率)大于0.5。對皺紋盤鮑三倍體的誘導效果也很好。對牡蠣還進行了一定規(guī)模的中試生產(chǎn)。咖啡因?qū)θ旧w組的加倍也有一定的作用，但需與高溫休克相結合，才能收到較好的效果。(2)溫度休克溫度休克又分為冷休克和熱休克，而冷休克是溫度休克方法中最常用的。在減數(shù)分裂I或II或第一次卵裂期間，無論是冷休克還是熱休克，都能使染色體加倍。大量的實驗證明，亞致死溫度是誘導多倍體的合適溫度。冷休克時，溫度過低不但會降低三倍體的誘導率，而且還會造成胚體發(fā)育異常和幼蟲的大量死亡。合浦珠母貝三倍體的最佳溫度是l2.C，而不是8.C;皺紋盤鮑是3.C，而不是0.C。同樣，熱休克溫度也不宜過高，也應控制在亞致死溫度范圍。(3)水靜壓力休克在較高的流體靜壓力下，正在分裂的受精卵可返回單個細胞階段，即使第一極體或第二極體不能排出。高靜壓力主要作用于微管系統(tǒng)，使微管解聚，微管所保持的結構失去原有的空間構型和剛性。當壓力除去后，這些結構一般還能恢復。在高靜壓下細胞質(zhì)不能分裂，但染色體不受影響，可繼續(xù)分裂，最終形成多倍體。水靜壓力休克已成功誘導產(chǎn)生太平洋牡蠣三倍體和皺紋盤鮑二倍體。將被激活的受精卵放一合適密閉容器中，加壓40-60MPa，持續(xù)l0min。高靜壓力可阻止正常細胞的減數(shù)分裂或有絲分裂。水靜壓的處理強度與處理的受精卵大小有一定的關系。（4）電脈沖處理在一定的電場條件下，細胞會發(fā)生融合。在電場強度為600V/cm的條件下，處理時間為50~200ps，脈沖數(shù)為1~6，牡蠣和貽貝三倍體產(chǎn)率分別為的，55%和36%，四倍體的產(chǎn)率分別為20%和36%。2、雜交方法遠緣雜交草魚♀x鳙♂的雜種是三倍體。亞馬遜鳉♀x黑花鳉♂的雜種是異緣三倍體。直接誘導三倍體所面臨的兩個問題是難以克服的，一是畸形胚的比率較高，二是三倍體的產(chǎn)率不穩(wěn)定。為了解決三倍體的應用問題，四倍體可望是最佳的途徑，即通過生產(chǎn)批量四倍體，然后再與二倍體雜交，以間接的方式獲得三倍體。在理論上，四倍體群體可自繁，與二倍體雜交可產(chǎn)生100%的三倍體群體，而其成活率亦可望與二倍體相近。（二）、四倍體1、第一次卵裂的抑制2、細胞融合3、早期休克處理

在一些三倍體試驗中用精子激活后立即進行休克處理會誘導產(chǎn)生一定數(shù)量的四倍體。4、對可性成熟三倍體牡蠣的卵子進行誘導。三、多倍體的鑒定技術在不同的實驗對象和條件下，倍化率和倍化個體的染色體數(shù)往往不同。因此，對處理群體的倍性鑒定是多倍體育種的不可缺少的技術。鑒定倍性的主要方法有:極體計數(shù)法、染色體計數(shù)法、流式細胞儀法(流儀)、顯微分光光度法、核體積法和電泳法等。1、極體計數(shù)法極體計數(shù)法已作為一種簡單快速的方法用于早期胚胎三倍體的檢測。因為三倍體的誘導或是通過阻止第一極體或是通過阻止第二極體的排出，所以三倍體合子只有一個極體而不是兩個。2、

染色體計數(shù)法染色體計數(shù)法同計數(shù)法同其他檢驗技術相比最直觀，所獲的信息量也較大。不管在胚胎發(fā)育到哪一階段，都可進行染色體計數(shù)。稚貝和成體的組織也可用于倍性檢測。牡蠣染色體計數(shù)：

二倍體長牡蠣中期染色體

2n=20

三倍體長牡蠣中期染色體

3n=30三倍體長牡蠣染色體核型

二倍體長牡蠣染色體核型3、流式細胞儀法流式細胞儀倍性檢測方法是用對DNA-RNA具特異性的熒光染料對細胞核進行染色。細胞解離制成懸液后，用激光激發(fā)，然后通過細胞熒光分析儀的光敏區(qū)，其熒光強度就會被顯示出來。4、

DAPI顯微螢光技術DAPI是一種芳香族熒光物質(zhì)，對DNA腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對非常容易染色。實驗樣品用DAPI處理并用紫外光(365nm)激發(fā)，然后用微量光度計測量熒光強度，熒光強度與相對樣品核DNA的含量呈正相關。三倍體長牡蠣細胞流式儀鑒定結果細胞核仁數(shù)目法三倍體長牡蠣鰓細胞核仁二倍體長牡蠣鰓細胞核仁二、性控技術性別控制就是根據(jù)生產(chǎn)上的某些需要創(chuàng)造單性種群，它在魚類養(yǎng)殖業(yè)上具有廣泛的應用前景和重要的生產(chǎn)意義，可以歸納如下:一是可以加快魚類養(yǎng)殖群體的生長速度。許多魚類雌雄之間的生長速度有明顯的差別。二是可以控制繁殖。進行性別控制可以防止魚的過度繁殖，減少交配時能量的消耗。三是能夠延長養(yǎng)殖魚類群體的有效生長期。

四是可以滿足特殊需求。有些魚的魚卵。（一）魚類的性別1)雌雄異體(Gonochorism)指魚類的一個個體只存在精巢或卵巢一種性腺，在個體發(fā)育階段只表現(xiàn)為單性性征，大多數(shù)魚類屬這種類型，又分為未分化型和分化型。前者性腺先發(fā)育成卵巢樣性腺，然后約有一半個體形成雄性，另一半形成雌性;后者未分化的性腺直接發(fā)育成精巢或卵巢。2)雌雄同體(Hermaphroditism)指同一個體具有可區(qū)分的卵巢和精巢，并分別產(chǎn)生卵子和精子，一般情況下精子和卵子并不同時成熟，而是輪流成熟，或是卵先成熟，或精子先成熟，以防止自體受精。如黑鯛、石斑魚就是雌雄同體，黑鯛2一3齡時雄性成熟排精，3齡后轉(zhuǎn)為雌性成熟、排卵，石斑魚則正好與黑鯛相反。3）魚類性別決定決定魚類性別的染色體機制比較復雜，從目前的研究來看，幾乎包括了所有性染色體類型。下面僅介紹一下較常見的XX/XY，ZW/WW和XO/XX型及只在魚類中存在復性染色體型。XX/XY型此種類型常見于哺乳類。雄性為異配，產(chǎn)生兩個不同的配子，雌性為同配，產(chǎn)生兩個相同的配子，大多數(shù)魚類屬之，如虹鱒、莫桑比克羅非魚、尼羅羅非魚、牙鲆和鱗純類的魚類。ZW/WW型這種類型在鳥類中常見，其與XX/XY型正好相反，雄性是異配，而雄性為同配，這一類型的魚有日本鰓、奧利亞羅非魚、歐洲鯉等。XO/XX型這是昆蟲中常見的性染色體型，即雌雄性染色體數(shù)目不同。一般來說XO多半是雌性，雄性為同配，如緞虎魚科、燈籠魚科中的幾種魚類。另一種情況是，雌性為同配，而雄性只一個性染色體。少數(shù)幾種深海魚類，如星光魚、夜叮魚等。復性染色體型性染色體型多半為X1X1X2X2/X1X2Y。屬此類的魚有墨西哥鱗科魚、紅大麻哈魚、花鰍以及綠鰭馬面鲀等。（二）魚類的人工性別控制1、單性發(fā)育(Parthenogenesis)是指僅在雌核或雄核控制下發(fā)育，形成單性后代的一種特殊有性生殖方式，依次稱為雌核、雄核發(fā)育。(1)雌核發(fā)育(Gynogenesis)雌核發(fā)育與孤雌生殖和雜種發(fā)育不同，需要同種或異種精子進入卵內(nèi)，不過這些精子只起激動作用，不形成雄性原核，并不參與發(fā)育，也沒有兩性原核融合，卵子的發(fā)育完全是在雌核的控制之下進行的，因此得到的后裔全部是母性性狀，基因型與母本相同或略有差異。

人工也可以誘發(fā)動物卵子雌核發(fā)育。已先后在金魚、庫頁烏鱒、鯉魚、石鰓、溪鯉、草魚、斑馬魚、牙鲆和真鰓等20余種進行過研究。1)人工誘導的機理雌核發(fā)育分兩種:一種是極體雌核發(fā)育(Polarbodygynogenesis)又稱雜合子雌核發(fā)育。二倍化是通過抑制Pb2完成的;一種是有絲分裂雌核發(fā)育(Mitoticgynogenesis)又稱純合子雌核發(fā)育，二倍化是通過阻止第一次卵裂實現(xiàn)的。

1981年由Streinger采用純合子法首先在斑馬魚上成功建立純合子以來，又有許多學者如Koman等分別在牙鲆、鰓魚、青鳉魚、羅非魚上獲得成功。2)誘導方法①精子染色體的遺傳失活方法也包括生物學方法、物理學方法以及化學方法。生物學方法--遠緣雜交遠緣種的精子激活卵子但不參與發(fā)育也能產(chǎn)生雌核發(fā)育后代。如用銀大麻哈魚♀X溪紅點鮭♂，其雌核發(fā)育率占49.2%。這種方法前提是所選的異源精子應不參與受精卵的發(fā)育。不過現(xiàn)在有一些學者卻提出可以利用精子遺傳物質(zhì)不完全滅活而把一些特定的基因?qū)耸芫阎校M行定向的轉(zhuǎn)基因，已在虹鱒、大麻哈魚、草魚等中進行了實驗。獲得了肯定的結果。物理方法射線不但能使精子染色體失活而不損傷其受精能力從而誘發(fā)卵子進行雌核發(fā)育，而且隨著照射劑量的增加，胚體成活率起初較低，爾后增高（Hertwig效應）。X射線γ射線具有較好的穿透力適于大量精子的處理，作用原理是誘發(fā)染色體斷裂。紫外線相對于上述兩種射線，便宜且安全又容易操作，適于生產(chǎn)，它的作用原理是使DNA上的氫鍵斷裂，導致DNA局部變形，影響DNA的正常復制和轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)介紹一下紫外線照射的具體步驟:首先應根據(jù)實驗魚的Hertwig效應曲線來確定照射劑量，因為不同的魚照射劑量相同所得效果并不一致。I.將精子稀釋液先預冷;II.采取精液1ml，用稀釋液稀釋50~100倍，Ring’s液，魚的生理鹽水;III.放入培養(yǎng)皿中要平不要太厚一般2-3mm;IV.將培養(yǎng)皿置于搖床振動，使精液照射均勻;V.用紫外燈照射（30W,15cm，照30s~2、3min）。化學方法用特殊的藥品某些染料如甲苯胺鹽、乙烯脲、丫啶黃等也可以導致精子的染色體失活，但使用較少。此外在實驗室中，也可以利用玻璃針刺激魚卵或用弱電流來處理魚卵，誘發(fā)魚卵發(fā)育。②二倍化用染色體失活的精子激發(fā)魚卵獲得的胚胎單倍體，其胚胎發(fā)育開始尚屬正常到了器官發(fā)生期，眼睛及其他器官發(fā)生異常，胚體明顯縮短、扭曲，尾部粗短，即使孵化也不能成活，即所謂的"單倍體綜合征"。因此必須采用一定的方