第五章細胞工程及其在食品工業中的應用

細胞工程(cellengineering)是以細胞生物學和分子生物學為基礎理論，采用原生質體、細胞或組織培養等試驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細胞系或生物體以及生物的次生代謝產物，并發展有關理論和技術方法的學科。細胞工程的核心技術：細胞培養與繁殖目的：獲得新性狀、新個體、新物質一細胞工程的定義第一節、細胞工程的概念與研究范疇

二細胞工程的研究范疇細胞融合細胞拆分動物細胞與組織培養植物細胞與組織培養細胞核移植染色體工程胚胎工程干細胞與組織工程三、細胞工程的發展1動物細胞工程的發展2植物細胞工程的發展細胞學說的建立胚胎學的發展分子生物學的發展四、細胞工程的理論基礎五、細胞工程的基本技術

植物細胞工程

植物細胞工程的基本技術和理論基礎

植物細胞工程的理論基礎是：

植物細胞的全能性植物細胞工程常用的技術是植物組織培養植物體細胞雜交概念：細胞的全能性是指生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能。原因：是生物體的每一個細胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質及發育為完整個體所必需的全部基因。細胞的全能性

當植物細胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態時，在一定的營養物質、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現出全能性，發育成完整的植株。在生物的個體發育中，由于基因在特定時間和空間下選擇性地表達而形成不同器官，因此，要實現細胞的全能性，首先必須使生物體的細胞處于離體狀態。受精卵的全能性最高；其次是生殖細胞（尤其是卵細胞）；體細胞的全能性比生殖細胞低得多。

①從健康植株的特定部位或組織，如根、莖、葉、花、果實、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養的起始材料，稱之為外植體。②用一定的化學藥劑，最常用的有次氯酸鈉，升汞和酒精等對外植體表面消毒，建立無菌培養體系。嚴格控制無菌條件，這是獲得培養成功的重要一步。②外植體塊在培養基上形成疏松的愈傷組織，由愈傷組織分化出芽并可誘導形成根的小植株。

1）植物細胞和組織培養技術植物組織培養的過程離體的植物器官、組織或細胞脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無規則，高度液泡化的呈無定形狀態的薄壁細胞）再分化根或芽等器官植物體植物組織培養的條件：適宜的養料和激素，適宜的溫度和無菌條件離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化。再分化脫分化產生的愈傷組織繼續進行培養又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細胞的再分化。二、植物組織培養植物組織培養過程相關問題1、在植物組培過程中，為什么要進行一系列的消毒，滅菌，并且要求無菌操作？2、為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養成小植株嗎？植物體細胞雜交的概念將不同種植物的體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新的植物體的技術。（不同種生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統的有性雜交方法是不可能做到這一點的）相關問題（1）要想讓兩個來自不同植物的體細胞融合在一起，遇到的第一個障礙是什么？（2）有沒有一種溫和的去細胞壁的方法？（3）為什么兩個原生質體能發生融合，這與細胞膜的什么特性有關？（4）如果兩個來源不同的原生質體發生融合形成了雜種細胞，下一步該對此細胞做何種處理？（5）如何將雜種細胞培育成雜種植株？植物體細胞雜交過程植物細胞A植物細胞B去掉細胞壁去掉細胞壁原生質體A原生質體B原生質體融合雜合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞細胞分裂分化發育愈傷組織雜種植株植物體細胞雜交過程原生質體制備（酶解法去細胞壁）原生質體融合（人工誘導）

雜種細胞的篩選和培養（形成愈傷組織）雜種植株的再生與鑒定物理法：離心、振動、電刺激等化學法：聚乙二醇等試劑纖維素酶、果膠酶等問題為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學家所想像的那樣，地上長番茄、地下結馬鈴薯？主要原因是：生物基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調控、相互影響的，所以馬鈴薯—番茄雜交植株的細胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質，但這些遺傳物質的表達受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質一樣有序表達，雜交植株不能地上長番茄、地下結馬鈴薯就是很自然的了。問題自然界中有一種含有葉綠體的原生動物──眼蟲，說明植物的細胞器同樣可以在某些動物細胞中存活，請探討：動物細胞與植物細胞之間可以實現雜交嗎？如果理論上可行，請設計出具體實驗方案。異想天開植物細胞工程的實際應用繁殖植物的新途徑微型育種作物脫毒人工種子育種新方法單倍體育種誘導突變體細胞產物的工廠化生產概念：應用組織培養技術，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技術）原理：植物細胞的全能性優點：繁殖率高，可大批量生產取材少培養周期短保持優良性狀微型繁殖作物脫毒病毒在作物體內逐年積累，會導致作物產量降低，品質變差分生區附近（莖尖、根尖）的病毒極少，甚至沒有采用莖尖進行組織培養人工種子結構：人工薄膜+胚狀體（不定芽、頂芽、腋芽）優點：不受氣候、季節、地域的限制保留優良性狀時間短，占地少技術：組織培養原理：細胞全能性養分、無機鹽、有機碳源、農藥、抗生素、有益菌生長調節劑單倍體育種方法：花藥離體培養技術：組織培養獲得單倍體秋水素處理單倍體的幼苗，使染色體加倍優點：明顯縮短了育種年限后代穩定遺傳突變體的利用利用組織培養時，分裂狀態的細胞易受培養條件和外界壓力（如射線，化學物質等）的影響而產生突變的原理，誘導并篩選出對人類有用的突變體。細胞產物的工廠化生產紅豆杉與紫杉醇人參皂甘的生產

植物細胞培養是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖來獲得大量細胞群體的方法。

植物細胞和組織培養技術(PCTC)目前，植物細胞培養技術已在農業、醫藥、食品、化妝品、香料等領域廣泛用于大規模生產有價值的產品。小規模的細胞培養通常在培養瓶中完成，而大規模的培養可在發酵罐中進行。

植物細胞培養基通常包括無機鹽、碳源、維生素、生長調節素和有機添加劑等。無機鹽類包括：無機鹽濃度一般為多少？微量元素主要包括碘、硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、鐵等。

碳源和能源維生素植物細胞的生長都需要硫胺素。可在植物細胞培養基中加入煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素和葉酸等。原生質體培養通常需要大多數必需維生素。1、植物細胞培養基的組成

植物生長激素大多數植物細胞培養基中都含有天然的或合成的植物生長激素。生長激素包括了植物生長素、細胞激動素、赤霉素和脫落酸等四大類。有機氮源通常采用的有機氮源有蛋白質水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。

有機酸加入丙酮酸，或者檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等三羥酸循環的中間產物，能夠保證植物細胞在以銨鹽作為單一氮源的培養基上生長，并且使細胞對鉀鹽的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，這些有機酸還能提高低密度接種的細胞和原生質體的生長。復合物質在植物細胞的培養過程中，酶母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁等復合物質通?？梢宰鳛榧毎纳L劑。

類型和方法:懸浮培養和固定培養懸浮培養方法

要求:材料(疏松易碎的愈傷組織,經過破碎的頸部組織)

條件:水平震蕩,合適的氣體組成/pH

特點:對剪切力敏感結團生長速度慢多泡沫光照無菌培養

圖12-2大規模植物細胞固定化裝置含CaCl2的培養基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口

大規模固定化植物細胞的大規模固定化原則上可根據上述方法進行，但是不能再用塑料注射器，而需要采用如圖12-2所示的大規模細胞固定化裝置進行細胞的固定化。動物細胞工程

應用動物細胞培養動物細胞融合單克隆抗體技術核移植動物細胞工程常用技術人耳鼠“人耳鼠”再出風頭

2001年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動——這是有著一對紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫院副院長、整復外科主任曹誼林教授利用組織工程技術復制出來的。

在京展出的數天，盡管門票高達20元，但還是有將近20萬人，心甘情愿地掏錢一睹“人耳鼠”的風采。

人耳鼠的出現，透露了怎樣的信息？

1.發展歷史:20世紀初，人們不知道神經纖維是由神經細胞的細胞質向外突出形成的，還是由神經細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學家們就這個問題展開了激烈的爭論。1907年，美國生物學家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養。蝌蚪的神經組織存活了好幾周，并且從神經細胞中長出了神經纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經纖維的起源問題，而且開創了動物組織培養的先河。此后，在許多科學家的不懈努力下，動物組織培養不斷改進并逐漸發展成為動物細胞培養。動物細胞培養2、動物細胞培養的應用和概念：動物細胞培養就是從動物有機體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養基中,讓這些細胞生長和增殖.動物細胞的培養過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養單個細胞動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎剪碎組織的目的？胰蛋白酶處理的目的？3、動物細胞培養過程：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養50代細胞傳代培養細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養液遺傳物質未改變遺傳物質已改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）有關概念原代培養：從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。（分裝前的細胞培養）傳代培養：將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。有關概念

細胞株：傳代培養的細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現細胞生長停滯狀態，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

細胞株和細胞系的區別：細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養。動物組織細胞培養要求一體外培養特點:

大多數動物細胞要附在物體上表面生長，動物細胞培養對營養要求更嚴格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。對環境適應性差，對環境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。二培養工具:培養瓶、培養皿、培養管、多孔培養板等。細胞培養以玻璃器皿為主。器皿應選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用于細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位。

三、培養條件

細胞在體外培養中所需的條件

與體內細胞基本相同。

【討論】多細胞動物和人體的細胞都生活在內環境中，討論以下問題：1.體外培養細胞時需要提供哪些物質？提示：充足的營養供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環境。2.體外培養的細胞需要什么樣的環境條件？提示：無菌、無毒的環境。1）恒定的溫度:37℃，

維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。低溫下會使細胞代謝速率降低2）PH：7.2-7.４當PH低于6或高于7.6時的生長會受到影響，甚至死亡。用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。3)氣體：ＣＯ２有調節PH的作用。氣體是人體細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。

4）營養—培養基：在保證細胞滲透壓的情況下，培養液里的成分要滿足細胞進行代謝所需要的各種營養，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細胞才能在體外正常存活、生長。動物細胞的培養基一般分為天然、合成、無血清培養基幾種，此外細胞培養還需要一些常用的溶液。合成培養基

1951年厄爾開發了供動物細胞體外生長的人工合成培養基(MEM)。合成培養基的種類相當多。合成培養基成分已知，便于對實驗條件的控制。但與天然培養基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代，因此，細胞培養中使用的基礎合成培養基還必須加入一定量的天然培養基成分，以克服合成培養基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培養基，如109培養液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培養液等。天然培養基直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清是天然培養基中最有效和最常用的培養成分。它含有許多維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學性狀不可缺少的未知成分。

使用最普遍的天然培養基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質。與合成培養基合用，能使細胞碩利增殖生長。常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為胎牛血清和犢牛血清，前者來源少，價格高；后者要求剛產下尚未哺乳的小牛，因為哺乳后的小牛血清中可能含有更復雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是細胞合成蛋白質的基本成分，氨基酸中有12種是細胞本身不合成的，必須由培養液提供。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子(IGFl、IGF2)等。

水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細胞表面特性促使其附著生長的作用。無血清培養基動物血清成分復雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細胞生長很有效，但后期對培養產物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養基不加動物血清，在基礎培養基中加入細胞生長有效因子，激素等。5)細胞培養溶液平衡鹽水（BSS）：

Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液。PH調整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）細胞消化液:

胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．膠原酶溶液抗生素溶液：1)青、鏈霉素:每毫升培養液含100U青霉素和100ug鏈霉素.2)卡那霉素：終濃度為50ug/ml培養液。3）制霉菌素：濃度25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。6)、無污染環境

培養環境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養時，與體內相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。

四細胞培養設施

1、實驗室設計

細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養室的設計實施原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養于一室，而洗刷消毒在另一室。

細胞培養實驗室1.準備室2.緩沖室

準備室風淋3.培養室培養室

專用于組織細胞培養的空間，應包括更衣間、緩沖間、操作間。內設超凈工作臺、培養箱等細胞培養的必要設備，應具備紫外消毒、通風及溫控設施。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養箱、離心機及倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及毒好的無菌物品等

風淋室：

風淋室是生物潔凈室的理想配套設備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風淋室的板壁采用輕質隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進口不銹鋼制作，吹淋口方向可調，風淋時間可在30-99秒間的調整。風淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調，一般控制溫度在30-35℃較為適宜。

超凈工作臺

也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。CO2培養箱

哺乳動物離體細胞培養和體內細胞一樣,需要在恒足溫度下才能生存,溫差變化一般不應超過0.5度，因此培養箱對溫度應具有較高靈敏度。

CO2培養箱的優點在于能恒定地供應一定量的CO2,一般5%即可維持培養液PH值穩定。

冰箱細胞培養的冰箱應特別注意清潔，

防止污染。水純化裝置細胞培養對水的質量要求較高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各種培養用液。過濾裝置各種培養用液只能用過濾的方法進行除菌消毒處理。微化濾膜濾器是目前應用最廣泛的過濾裝置。細胞冷凍貯存器

細胞冷凍貯存具有經濟、省力和較好保持細胞生物學特性的優點，目前各實驗室主要使用液氮容器貯存細胞。培養器皿

培養器皿包括各種規格的玻璃、塑料培養瓶，培養皿，吸管，離心管等。洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。

無菌操作的要領

由于體外培養的細胞缺乏機體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無菌，防止污染。超凈工作臺消毒

打開紫外線殺菌燈照射消毒20～30分鐘，然后關閉紫外燈，打開風機，流入的空氣是經過除菌板過濾的空氣，工作臺可保持無菌環境。洗手

操作時因整個前臂伸入工作臺內，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新潔爾滅或75%的酒精棉球擦拭。

火焰消毒

所使用物品均應經過燒灼，所用瓶口等開啟或封蓋時均需迅速旋轉過火焰進行消毒。

注意金屬器械不能在火焰上燒灼時間過長。

燒過的用具均要待冷卻后再接觸組織細胞。

吸取營養液后的吸管不能再經火焰燒灼,否則會燒焦形成炭膜,再用時會將有害物質帶入培養液。

合理布局

右手使用方便的用品放右側，左手使用方便的用品放左側。酒精燈置于中央，打開的培養液、培養瓶等應保持斜立或平放（瓶口長時間開口直立,易增加落菌機會）。吸取各種用液應分別使用吸管，不能混用。

3.動物細胞培養的條件1.無菌無毒的環境2.營養3.溫度和pH4.氣體環境

應該加入哪些物質？這些物質如何調配？在使用合成培養基時通常需加入血清、血漿等天然成分，目的是什么？4.動物細胞培養技術的應用蛋白質生物制品的生產如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體健康細胞培養培養健康細胞用于燒傷病人皮膚移植細胞的生理、藥理、病理研究

用于篩選抗癌藥物

動物細胞培養技術條件要求:工藝方式:分批流加式半連續式連續式

培養技術:懸浮培養技術貼壁培養技術微載體培養技術多孔載體培養技術微囊化培養技術中空纖維細胞培養技術植物組織培養和動物細胞培養的比較比較項目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養結果培養目的細胞的全能性細胞增殖固體培養基液體培養基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養材料？1、動物細胞培養液的主要成分是什么？較植物組培培養基有何獨特之處？3、為什么培養前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養能否像綠色植物組織培養那樣最終培養成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養基2、成分中有動物血清等因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強成塊組織不利培養，分散了做成細胞懸浮液利于培養不能，動物細胞培養只能使細胞數目增多，不能發育成新的動物個體

3）細胞融合技術（體細胞雜交技術）

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用動物細胞融合動物細胞融合細胞A細胞B雜種細胞滅活的病毒物理法化學法仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒用滅活的病毒誘導動物細胞融合過程細胞核病毒顆粒細胞核細胞融合與融合誘導細胞融合物質誘導劑：仙臺病毒聚乙二醇

電融合誘導細胞融合的仙臺病毒必須滅活。

細胞融合概述細胞融合（cellfusion)，又稱體細胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程。細胞融合的定義Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發現了細胞合并現象。1958年日本學者岡田（Okada）發現仙臺病毒具有觸發動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現了電融合技術。細胞融合研究進展生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細胞融合成功的例子植物融合細胞成長狀態對比,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環境下融合的細胞

動物細胞融合實驗使用的小白鼠

動植物細胞的融合過程植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發生重組，從而產生新的核外遺傳系統。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。細胞融合的基本原理顯微鏡下細胞融合過程融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖

細胞融合的常用方法一、仙臺病毒法仙臺病毒誘導細胞融合經四個階段：①兩種細胞在一起培養，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細胞膜發生反應，細胞膜受到破環，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細胞，仍需ATP。病毒促使細胞融合的主要步驟如下：兩個原生質體或細胞在病毒黏結作用下彼此靠近；通過病毒與原生質體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質互相滲透；兩個原生質體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖

優點是易得，用法簡單，融合效果穩定。聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產生最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發生融合成為可能。

PEG誘導融合的特點：其優點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。

聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養液至5ml，37℃的CO2培養箱中培養。（6）6—24小時后，換成選擇培養液篩選雜交細胞。三、電融合法電融合法是80年代出現的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發生改變，使異種細胞粘合并發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。

電融合誘導法原理示意圖雜種細胞的篩選雜種細胞的篩選原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，篩選的目的是獲得優良的雜種細胞。1）親本

2）同核體：同源原生質體的融合體3）異核體：非同源的原生質體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質的融合體5）異胞質體：具有不同胞質來源的雜合細胞。6）核質體：有細胞核而帶有少量細胞質的亞原生質體基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選常用的雜種細胞篩選方法植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細胞長成植株呈綠色，并能成長2）抗性互補篩選法：利用親本細胞原生質體對抗生素、除草劑及其它有毒物質抗性差異選擇雜種細胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養基上不能超過50個世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細胞能在含有放線菌素的MS培養基上生長，而親本和其它細胞死亡3）利用物理特性篩選法：根據親本的原生質體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質體親本2：葉肉細胞原生質體在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細胞可以區分4）利用生長特性篩選法：利用原生質體對培養基成分要求與反應的差異選擇雜種細胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原生質體均需外源激素才能生長，但其融合細胞可以產生內源激素，在培養基上不需加激素。動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養基上生長2）營養互補篩選系統：細胞在缺乏一種或幾種營養成分時，不能生長繁殖，即營養缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養基上培養，而親本細胞均會死亡。3）溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養細胞能在32度到40度的范圍內生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養基上生長。雜種細胞在植物育種中的應用雜種細胞是一條新的育種途徑，可以產生新經濟性狀的良種?？茖W家已經在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯×番茄等都得到了再生植株。目標：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優勢性狀的新品種。3、細胞融合技術

在食品工業中的應用（1）酵母菌的育種（2）氨基酸生產菌的育種（3）酶制劑生產菌株的育種細胞雜交瘤技術與單克隆抗體一、何謂單克隆抗體？什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產生的、并能與該抗原發生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細胞產生抗體。B淋巴細胞與抗體

１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產生抗體。２．動物體內的B淋巴細胞可以產生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。３．每一個淋巴細胞只能產生一種抗體。單克隆抗體由單個B淋巴細胞經過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

特點：

特異性強、靈敏度高

只針對某一抗原決定簇單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology

）。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

如何大量生產單克隆抗體？利用淋巴細胞產生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養技術大量培養雜交瘤細胞二、雜交瘤技術的基本原理

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養篩選，繼續培養足夠數量的、能產生特定抗體的細胞群體外培養注射到小鼠腹腔單克隆抗體三、雜交瘤細胞的制備（一）骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養基通過抑制瘤細胞的核苷酸合成，達到去除未融合瘤細胞的目的。細胞有兩條基本途徑合成嘌呤核苷酸，一條是從磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物開始，葉酸是重要的輔酶，而氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞通過這一途徑合成核苷酸。另一條途徑是利用已存在的堿基，經特異的磷酸核糖轉移酶催化合成核苷酸，如次黃嘌呤經過次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）轉變為嘌呤核苷酸。融合所用的瘤細胞是選擇出來的HGPRT缺陷細胞株，因此不能在HAT培養基中生長，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養基中長期存活與繁殖并分泌抗體。（二）免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。（三）脾細胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網或尼龍紗網中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養液沖洗，令細胞通過紗網，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養液，反復抽吸數次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養液：輕輕吹打數次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉／分)計數、備用。（四）細胞準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養液洗3次(37℃)，計數活力細胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養液洗3次(37℃)，并計細胞數和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。（五）細胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內加完，同時并不斷輕微轉動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉動離心管中加1ml無血清培養液，60秒鐘內加完；(3)于5分鐘內慢慢加完20ml無血清培養液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉／分，8分鐘)，去上清，用完全培養液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養，24小時后更換成HAT選擇性培養掖。（六）融合后細胞培養(1)融合后7—10天用HAT培養液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養液半量換液，或仍用HAT培養液；(3)2—3周后出現雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至1／3孔時，應進行抗體檢測。思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成